Summary
A medida quantitativa da função progenitor óssea na consolidação da fratura requer alta resolução tecnologia de imagens em série. Aqui, os protocolos são fornecidos para o uso de microscopia intravital e rastreamento osteo-linhagem sequencialmente imagem e quantificar a migração, proliferação e diferenciação de células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos no processo de reparação de fratura óssea.
Abstract
Óssea vira continuamente e é altamente regenerativo após lesão. Células tronco / progenitoras osteogênicas têm sido a hipótese de existir, mas em demonstração vivo dessas células só recentemente foi atingido. Aqui, são fornecidos in vivo técnicas de imagem para investigar o papel das células-tronco / progenitoras osteogênicas endógenos (OSPCs) e seus descendentes na reparação óssea. Usando osteo-linhagem de células traçando modelos e imagens intravital de microfraturas induzidas no osso calvária, OSPCs podem ser observados diretamente durante os primeiros dias após a lesão, em que ocorrem eventos críticos no processo de reparo precoce. Sites de lesão pode ser trabalhada sequencialmente revelando que OSPCs mudar para a lesão, aumentam em número e diferenciação em osteoblastos do osso formando. Estes métodos oferecem um meio de investigar o papel dos reguladores moleculares Stem Cell-intrínsecos e extrínsecos para regeneração óssea e reparo.
Introduction
Doenças ósseas degenerativas e perda óssea relacionada à idade levando a um alto risco de fratura osteoporótica tornou-se um grande desafio para a saúde pública 1. Manutenção do osso é controlado pelos osteoblastos de formação óssea e os osteoclastos de reabsorção óssea. Defeitos de formação de células ósseas são uma das principais causas de perda óssea relacionada à idade e doenças ósseas degenerativas 2,3. Embora extensa pesquisa centrou-se na melhoria da consolidação da fratura, a descoberta de medicamentos confiáveis para curar doenças ósseas degenerativas e para reverter a fraqueza de fraturas osteoporóticas continua a ser uma questão importante. Assim, o estudo da fonte de células formadoras de osso e de seus mecanismos de controle na regeneração óssea e reparação oferece uma nova visão para melhorar a regeneração óssea e reverter doenças perda óssea.
A existência de células mesenquimais multipotentes da medula óssea foi proposto com base na identificação de populações clonogénicos que poderia diferenteIATE em osteogênico, linhagens adipogénicos e condrogênicas ex vivo 4. Recentemente, vários estudos têm relatado que as células-tronco do esqueleto / mesenquimais (SSC / CTM) são uma fonte natural de osteoblastos e são fundamentais para a renovação óssea, remodelação e reparo de fratura 5,6 . Além disso, nosso estudo de rastreamento de linhagem revelou que osteoblastos maduros têm uma meia-vida inesperadamente curto (~ 60 dias) e são continuamente reabastecidos pelas suas células tronco / progenitoras em ambas as condições homeostáticas e reparo de fratura normais 6. No entanto, a identidade in vivo de células estaminais e como tal as células reagem para fracturar lesão e fornecimento de células formadoras de osso não são claras. Portanto, é importante desenvolver um método que é capaz de analisar a migração, proliferação e diferenciação das CSCs endógenos / MSCs em circunstâncias fisiológicas.
Reparo de fratura é um processo multi-celular e dinâmica regulada por um conjunto de complexocitoquinas e factores de crescimento de 7. A abordagem mais popular para estudos de fratura é a utilização de um modelo animal com fratura de ossos longos e analisar ossos por seccionamento do osso e as técnicas de imunofluorescência 8-10. Este processo de reparação pode ser monitorado por várias técnicas de imagem, incluindo micro-CT 11, de infravermelho próximo de fluorescência 12, e imagens quimiluminescência 13. No entanto, cada técnica tem algumas limitações e não houve nenhuma maneira eficaz de monitorar a função SSC / MSC no nível celular in vivo. Recentemente, confocal / dois fotões microscopia intravital tem sido desenvolvido e usado para detectar células cancerosas transplantadas e células-tronco hematopoiéticas no contexto do seu microambiente da medula óssea, mesmo na resolução de uma única célula em animais vivos 14. Ao combinar essa tecnologia com uma série de modelos de rastreamento de linhagem, fomos capazes de definir que as células-tronco osteogênico / progenitoras podem ser geneticamente marcado por ac transitóriavação da resistência myxovirus -1 (Mx1) promotor e progenitores induzida-MX1 pode manter a maioria dos osteoblastos maduros ao longo do tempo, mas não participam na geração de condrócitos no rato adulto 6. Além disso, demonstrou-se que OSPCs Mx1 marcadas fornecer a maior parte dos novos osteoblastos em fratura cura 6.
Aqui, utilizando modelos de rastreamento osteo-linhagem e microscopia intravital, um protocolo é fornecido para definir os in vivo cinética de células-tronco + / progenitoras osteogênicas Mx1 no reparo de fratura. Este protocolo oferece imagens seqüenciais para acompanhar a deslocalização de osteogênicas tronco / progenitoras em sítios de fratura e a medição quantitativa de expansão osteoprogenitoras no processo de reparo precoce. Esta abordagem pode ser útil em vários contextos, incluindo a avaliação de candidatos terapêuticos para melhorar a reparação do osso.
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Protocol
1. Ratos e pré-condicionamento
Nota: Todos os animais foram mantidos em condições livres de patógenos e todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts. Todos cirurgia deve ser realizada sob condição estéril utilizando equipamento estéril autoclavada. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) e Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomate), foram comprado a partir de Jackson Laboratories. ratinhos osteocalcina-GFP foram fornecidos pelo Dr. Henry Kronenberg. Para a análise quantitativa de migração OSPC e proliferação in vivo, foram utilizados Mx1-Cre + Rosa-YFP + (única cor-repórter) ratos. Para acompanhamento mais detalhado de sua diferenciação em osteoblastos Osteocalcin + amadurecer, usamos trigenic Mx1-Cre + Rosa-tomate + OCN-GFP +ratinhos.
- Para marcar células Mx1 + in vivo, preparar ácido polyinosinic-polycytidylic (PIPC, 2,5 mg / ml) em solução de PBS estéril e injectar 200 ul de 20 g de Mx1-Cre + repórter rato intraperitonealmente uma vez em dias alternados durante 10 dias.
- Para eliminar as células hematopoiéticas Mx1 + residentes, irradiar ratinhos com uma dose única de 9,5 Gy. Após 24 horas de irradiação, tipo selvagem células da medula óssea transplantados (1x10 6 células / rato) por via intravenosa 16. Nota: Como as células Mx1-induzidos incluem células hematopoiéticas e osteoclastos derivados de hematopoiéticas, a eliminação de Mx1 + células hematopoiéticas melhora a qualidade de imagem e quantificação de células Mx1 + osteogênicas.
- Após o transplante de medula óssea, para monitorizar os animais quatro a seis semanas, a fim de alcançar um repovoamento bem sucedida de células de medula do dador.
2. Mousar Preparação
- Anestesiar rato por injecção intraperitoneal de 50 ul de cetamina / xilazina (100 mg / kg, xilazina 12 mg / kg de peso corporal), utilizando um procedimento IACUC-aprovado. Nota: A duração do efeito pode ser prorrogado por uma dose adicional de cetamina / xilazina.
- Determinar se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta aos pés e / ou pitadas de cauda. (Opcional) Quando o mouse é anestesiado, garantir uma máscara de gás isoflurano sobre o nariz gravando. Ajuste o nível de isoflurano para garantir que o animal está completamente sedada.
- Prenda o cabelo do couro cabeludo usando um aparador elétrico ou tesoura pequena. Retire os pedaços de cabelo e esterilizar a pele exposta com 70% de algodão embebido em álcool. Aplique gel lacrimogêneo para evitar a desidratação da córnea.
3. Lesões Microfratura
- Depois de garantir que o animal está totalmente sedado, fazer uma única incisão inversa em forma de L para abrir a pele do couro cabeludo. Resumidamente, fazer uma primeira incisão (menor que 1 cm) starting de uma orelha a outra orelha. Vire ~ 60 ° e continuar a incisão em direção ao nariz até ~ 2-3 mm de distância do nariz. Nota: Esta incisão minimiza a formação de tecidos cicatriciais acima da área a ser trabalhada.
- Separe os retalhos de pele puxando para os lados com uma pinça. Ambos os ossos frontais e da intersecção das suturas sagital e coronal deve ser claramente exposto.
- Limpe a superfície aberta por lavagem com PBS estéril e limpeza suave com gaze ou cotonetes estéreis até que todos os pêlos residuais são eliminados.
- Para gerar microfraturas no calvário, segure a cabeça do rato com uma mão e uma agulha 30 G com a outra mão. Faça um micro-punção (~ ferida diâmetro 0,2 milímetros com <1mm de profundidade) no osso frontal esquerdo perto do cruzamento das suturas sagital e coronal, inserindo a ponta de uma agulha 30 G com uma pressão suave e torcer movimento. Cuidado: é essencial para evitar a agulha de penetrar no cérebro, minimizando assim bleeding e dano tecidual.
- Mudar para uma agulha maior (20 ou 25 G) e alargar o buraco punção torcendo a agulha (~ 0,5 milímetros de diâmetro).
- Repita o passo 3,3-3,5 para gerar segunda punção no osso frontal contralateral.
- Limpe os pontos feridos pela queda contínua da PBS até o sangramento parar.
Nota: sangramento em locais de fratura irá interferir com a imagem apropriada e induzir a formação de cicatriz. - Aplicar uma gota de solução salina fisiológica estéril ou 2% Methocel no crânio para evitar a secagem. Nota: Não permita que a superfície do crânio para secar, o que irá reduzir a nitidez da imagem. É importante utilizar uma quantidade suficiente de gel ou solução salina para cobrir a área.
4. Imagens intravital
- (Opcional) Antes de imagiologia, alguns ratos foram injectados com um corante vascular para visualizar os vasos sanguíneos. Injetar retro-orbital com 20 l de Qtracker não-alvo 705 (2 mM solução em 50 mM de tampão borato) diluído em 80 ml de PBS. Use uma seringa de insulina para minimizar o desperdício de reagentes. Se o sinal não é suficientemente brilhante, valores adicionais podem ser necessárias.
- Ligue o scanner. Nota: Um scanner a laser com base em polígono permite a aquisição simultânea de múltiplos canais de imagem a uma taxa de vídeo (30 quadros por segundo). Digitalização taxa vídeo é muito importante para a imagem do animal vivo.
- Ligue o laser multi-fotão (femto-segundo titânio: laser de safira). Defina o comprimento de onda de 880 nm e ajustar a potência de segunda geração de imagens harmônico (440 nm) do osso. Para GFP e tdTomato excitação, ligue o 491 nm e 561 lasers de estado sólido nm.
- Ligue a PMT (tubo fotomultiplicador) detectores para cada sinal (± 20 nm filtro passa-banda 435 para geração de segundo harmônico, a ± 19 nm filtro passa-banda de 528 para GFP, e 590 ± 20 para tdTomato.) (Opcional) Use um 638 nm laser de hélio-neon e um PMT com ± 27,5 nm filtro passa-banda de 695 para detectar Qtracker sinal 705.
- Placenviar um e o animal em um eixo XYZ estágio do microscópio motorizado. Mantenha o mouse na posição mais confortável com uma almofada de aquecimento elétrico para ajudar a manter a temperatura do corpo (o que reduz o risco de perda de animais). Use fita adesiva para segurar o mouse para minimizar o movimento durante o exame e para manter a área com imagens o mais horizontal possível.
- Aplicar uma gota de quente 2% de gel de metilcelulose ou de solução salina fisiológica sobre o crânio para evitar a secagem. Coloque uma tampa de vidro sobre a área de imagem. Use uma lente de baixa ampliação (30x objetiva de imersão em água com 0,9 NA) para digitalizar o calvária.
- Usando o controlador dos eixos XYZ, encontrar a superfície de calvária de detectar o sinal de SHG a partir de ossos e identificar um local de marco fundamental, tal como a intersecção entre as suturas sagital e coronal suturas. Adquirir uma imagem e gravar as coordenadas XYZ.
- Continue a procurar o local da lesão, observando sinais de SHG e fluorescência.
- Quando os sites de ferimento ou da região of interesse são encontrados, adquirir uma imagem do melhor plano focal contendo sinais de fluorescência SHG e das células de interesse. Salvar coordenadas XYZ ea distância até à intersecção das suturas sagital e coronal para definir sua localização exacta para as próximas rodadas da imagem.
- Para a coleta de estruturas 3D celulares e osso de lesão fratura, gravar imagens por Z-stacks (2-5 intervalo mM) com ~ 100 mm de profundidade a partir da superfície do osso endosteal. Após a conclusão da imagem de um lado da lesão, repetir processo de imagem para sites de lesões próximas.
Procedimentos 5. Operação POST
- Após a imagiologia, enxaguar local de imagem com solução salina estéril para remover o gel de metilcelulose a partir do crânio. Usando uma mecha de algodão estéril, aplicar uma pequena quantidade de pomada com antibiótico triplo na superfície. Cubra os retalhos de pele e re-fechar o couro cabeludo por sutura cirúrgica. Isto pode ser feito com um fio de sutura hipoalergénico (poliglactina absorvível sutura) e 5-0 tamanho da agulha de sutura. Atenção: A boa técnica de sutura minimiza a formação de cicatriz.
- Tratar todos os animais com injeção IP de 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina cada 12 horas para 48 horas após a cirurgia. Manter os animais em uma câmara de recuperação quente até que recuperar a consciência suficiente. Após 3 a 5 dias, a reabertura da sutura e repita os passos de imagens intravital para acompanhar a mudança celular durante a cicatrização da fratura.
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Representative Results
O modelo de fratura de ossos longos estabilizada tem sido popular em estudos de fratura. No entanto, ossos longos ou grandes modelos de fratura causar danos nos tecidos múltiplos e, portanto, têm uma limitação na medição quantitativa da função das células do osso. Nós desenvolvemos uma lesão minimamente invasiva (menos de 1 mm de diâmetro, com pouca ou nenhuma invasão na dura-máter) sobre os ossos de calvária frontais com agulha de perfuração (Figuras 1A-1C). Nós escolhemos uma vista superior dos ossos frontais na calota craniana de imagem in vivo ao vivo de microfraturas porque este osso tem uma estrutura plana e fina óssea com medula óssea, permitindo a clara imagem do osso lesionado, células ósseas, e vasculatura sem a interferência de outros tecidos ( Figura 1C). Observou-se que este microfracture recapitula muitas características de grandes lesões da fractura, incluindo a formação de calo suave seguido por deposição mineral e formação de novo osso (dados não mostrados).
"> Sequential imagem in vivo de Mx1 células-tronco progenitoras + osteogênica. Estamos próximos testaram se este método é capaz de rastrear uma população de células osteogênicas especial durante a cicatrização da fratura. Anteriormente, desenvolvemos os ratos dupla repórter Mx1/Tomato/Ocn-GFP trigenic por cruzar camundongos Mx1-Cre com Rosa26-Tomate repórter e camundongos osteocalcina-GFP (Figura 2A) 6. A vantagem deste modelo é a marcação diferencial de osteogênicas tronco / progenitoras e osteoblastos maduros. por administração PIPC, o Mx1 + OSPCs são expressamente indicados pela expressão de tomate, enquanto que osteoblastos maduros diferenciado de OSPCs induzidas Mx1 expressar Tomate e GFP. Entretanto, osteoblastos pré-existentes e osteoblastos maduros de Mx1 progenitores não-induzidas expressar GFP sozinho (Figura 2B). Após a substituição de irradiação e da medula óssea, que generciado duas microfraturas nos ossos frontais desses ratos. Constatou-se que a área de cada uma fratura foi detectada através de um único campo de visão com o objectivo de 30x. Seqüencial de imagem 3D-intravital de microfraturas mostrou a deslocalização de tomate + OSPCs no local da fratura no dia 2 e sua expansão no dia 5. Não houve GFP ou indetectável + osteoblastos neste momento. No dia 12, um subconjunto dos osteoprogenitores perto da superfície da fractura iniciada a diferenciação dos osteoblastos (Tomate + GFP +). Subsequentemente, a acumulação de novos osteoblastos e formação de novo osso (analisado por segunda geração harmónica, azul) eram evidentes no dia 21, indicando que a migração e proliferação de células progenitoras osteogénicas é um mecanismo importante para o fornecimento de novos osteoblastos que participam na cura de fratura (Figura 2C).Cinética de osteogênicas tronco / progenitoras na reparação de fraturas. Para Teª se o nosso método fornece uma saída consistente e quantitativa dos números osteoprogenitoras durante a cicatrização da fratura, foi utilizado o Mx1/YFP rato como modelo linhagem de rastreamento simples e acompanhados Mx1 + OSPCs no reparo de fratura precoce. Depois de células da medula Mx1 + foram substituídos por tipo selvagem medula, geramos seis microfraturas independentes (dois / mouse) em Mx1/YFP rato calvária. Quando Mx1/YFP + OSPCs foram monitorados por 14 dias após a lesão, observou-se de forma consistente que um pequeno número de progenitores foram detectados no local da lesão por 3 dias. Os números aumentaram continuamente no dia 7, atingindo um pico populacional no dia 10 e manter por 14 dias (Figura 3A). Foram quantificados a cinética de números osteoprogenitoras por medir a intensidade do sinal YFP (processamento e análise com o programa ImageJ imagem). Repetimos esse experimento com uma saída similar, sugerindo a consistência da nossa abordagem (Figura 3B).
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Figura 1. In vivo de imagens de rato lesão calvária. (A) Representação esquemática de microfraturas nos ossos frontais do rato perto do cruzamento das coronais (CS) e sagital suturas (SS) e de imagens intravital seqüencial. (B) a exposição cirúrgica do rato calvaria antes da lesão. (C) lesões Microfratura representativos do calvária de rato para imagens intravital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. In vivo de rastreamento de OSPCs nos locais de lesão. (A) Representação esquemática de trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP mouse. (B) Este diagrama ilustra possíveis populações de células fluorescentes que aparecem em locais de ferimento de trigenic Mx1/Tomato / OCN-GFP mouse. O vermelho representa Mx1 + OSPCs expressar tomate. O amarelo representa osteoblastos maduros (tomate + GFP +) diferenciados Mx1 + OSPCs enquanto o verde representa novos osteoblastos de osteoblastos pré-existentes (GFP +) ou Mx1 não induzível (Mx1 -). Progenitores (C) seqüencial de imagens intravital de Mx1 + OSPCs e osteoblastos nos locais lesionados. Tomate + osteoprogenitoras e osteoblastos GFP + perto da lesão no rato Mx1/Tomato/Ocn-GFP calvárias foram fotografada imediatamente após a lesão (dia 0) e a tindicou vezes após a lesão. As setas indicam os osteoblastos derivados de Mx1 + OSPCs (amarelo). Azul osso. O círculo pontilhado representa todo o local da fratura (single). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Medição consistente e quantitativa de OSPCs induzidas-MX1 durante a cura da fractura. (A) Três lesões independentes sobre Mx1/YFP rato calvárias foram fotografadas sequencialmente imediatamente após a lesão (dia 0) e nos momentos indicados após a lesão. (B) Quantitative medição de células tronco / progenitoras osteogênicas Mx1 +. A cinética da Mx1 + OSPCexpansão em locais de lesão foi medido pela intensidade do sinal YFP usando ImageJ. Os gráficos mostram dois experimentos independentes, com a média de seis acidentes em cada experimento. Azul, osso; , Mx1 + células tronco / progenitoras osteogênicas verdes; vermelho, vasculatura (Q-pontos). Barras de escala são 100 mm (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O regulamento de células-tronco do esqueleto pode ser de grande importância para a definição de melhores métodos para alcançar a regeneração óssea. Imagens quantitativas e seqüencial no nível celular tem sido tecnicamente desafiador. Embora o modelo de fractura de ossos longos do rato tem sido amplamente utilizado e adequado para estudos biomecânicos 17, a sua localização de tecidos profundos, fractura tamanho desigual, danos nos tecidos moles, e a aplicação de fixadores de estabilização têm limitado a imagens intravital sequencial. Aqui, um método para ultrapassar estas limitações, a combinação de confocal / microscopia intravital dois fotões e um modelo de fractura de calvária rato é fornecido. Esta abordagem com rastreamento tronco / progenitoras da linhagem osteogênica demonstra sua capacidade em tempo real, in vivo de imagens de osteogênicas tronco / progenitoras de reparação da fratura.
Um grande desafio técnico neste método é a obtenção de imagens consistentes e de alta qualidade ao longo do tempo. Alta qualidade imidades com profundidade máxima de imagem depende da luminosidade dos repórteres fluorescentes e a condição do tecido da área de imagem. Além disso, para minimizar a exposição do laser para evitar danos nos tecidos e é importante para a fotodegradação de imagem sequencial de longo prazo. Varrimento rápido usando a plataforma de taxa de vídeo é útil para este fim. Se um único campo de visão não pode cobrir toda lesão, a área pode ser mapeado por tirar fotos montagem para cobrir a maior parte dos sítios de fratura. É importante para um compromisso entre a qualidade da pilha-Z e a quantidade de informação obtida durante toda a sessão de imagem. Por exemplo, Z-stacks com muitas fatias (por exemplo, 1-2 mM passos) e alta definição são mais fáceis de analisar melhor; no entanto, requerem exposição a laser a longo prazo que leva a um grau mais elevado de fotobranqueamento induzida por laser.
Desde seqüencial imagem in vivo de lesões fratura requer a abertura cirúrgica repetitivo da pele e superfície óssea,formação de cicatriz fibrosa na superfície da calota craniana é um problema comum que interrompe imagens de tecidos profundos e rende alta fluorescência de fundo. Técnicas de sutura qualificados e sangramento mínimo é fundamental para reduzir a formação de cicatriz. Em geral, 3-5 tempo de repetição de imagem pode ser alcançado sem perda significativa da qualidade da imagem.
Dada a possibilidade de repetição de imagem, o controle fácil e preciso do tamanho da fratura e da consistência da cinética de reparo, este método pode fornecer um meio razoável para testar alvos terapêuticos para a consolidação da fratura, osteoporose e outros tipos de regeneração de tecidos, como músculo esquelético.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros competitivos.
Acknowledgments
Agradecemos C. Park para ler o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIAMS sob Award Número K01AR061434 e uma Sociedade Fellowship Award Leukemia & Lymphoma (5127-09) para DP e doações dos Institutos Nacionais de Saúde para CPL e DTS O conteúdo é de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
| Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
| DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
| Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
| Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
| Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
| Methocel 2% | OmmiVision | ||
| pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
| Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
| Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
| Radius-635 HeNe laser | Coherent |
References
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