Summary
Diagnostische Ultraschallbildgebungs hat sich als wirksam bei der Diagnose von verschiedenen Atemwegserkrankungen bei Menschen und Tieren sein. Wir zeigen eine von Dr. Zuo Labor genutzt werden, um Membran Kinetik speziell in Mausmodellen analysieren umfassende Ultraschall-Protokoll. Dies ist auch eine nicht-invasive Technik, die Forschung quantitative Informationen über Maus Atemmuskelfunktion bereitstellen kann.
Abstract
Funktionsanalyse von Nagetier Atemskelettmuskulatur, insbesondere die Membran, wird üblicherweise durch Isolierung Muskelstreifen mit invasiven chirurgischen Verfahren durchgeführt. Obwohl dies eine effektive Methode zur Beurteilung der in-vitro-Membranaktivität geht es nicht überleben Chirurgie. Die Anwendung von nicht-invasiven Ultraschallabbildung als ein in vivo-Verfahren ist vorteilhaft, da es reduziert nicht nur die Anzahl der Tiere getötet, sondern ist auch für die Überwachung der Progression der Erkrankung in lebenden Mäusen. So kann unsere Ultraschall-Bildgebungsverfahren wahrscheinlich helfen bei der Entwicklung von neuen Therapien, die Muskelverletzung von verschiedenen Erkrankungen der Atemwege hervorgerufen zu lindern. Insbesondere in der klinischen Diagnose von obstruktiver Lungenerkrankungen, hat Ultraschallbildgebungs das Potential, um in Verbindung mit anderen Standardtests, die das frühe Einsetzen der Membran Muskelermüdung zu detektieren. In dem aktuellen Protokoll beschreiben wir, wie genau zu bewerten Membran contractikeit in einem Mausmodell mit Hilfe eines diagnostischen Ultraschallbildgebungstechnik.
Introduction
Vor kurzem haben die diagnostischen Ultraschallbildgebungstechniken, um Maus-Modellen der renovaskulärer Hypertonie und Bauchspeicheldrüsenkrebs 1,2 angewendet. Jedoch sind diese Techniken nicht in großem Umfang in Nagetier Atemmuskelfunktionstest verwendet. Deshalb haben wir einen diagnostischen Ultraschallbildgebungsverfahren ein wertvolles Werkzeug für In-vivo-Beurteilung der Längs Membran Mobilität in Mäusen entwickelt.
Es gibt mehrere Vorteile bei diagnostischen Ultraschallbildgebung. Zum Beispiel ist es nicht invasiv, sicher, tragbar und ermöglicht Echtzeitmessungen auf einen relativ niedrigen Kosten 3. Besonders waren bestimmte niederfrequente Ultraschallgeräte in der Lage, Lufteinschlüssen, eine klinische Merkmal der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) mit leichter bis schwerer Luftstrom Einschränkung 4 zu erkennen. So kann diagnostischen Ultraschall-Bildgebung als leicht zugänglich und reproduzierbar Screening-Verfahren zur Echtzeit-Überwachung dienen von Atemwegserkrankungen.
Diagnostische Ultraschallbildgebungstechniken werden häufig zu größeren Tieren oder menschlichen Probanden angewendet. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von Ultraschall-Bildgebungsstudien an Mausmodellen, die wahrscheinlich auf die Herausforderungen Führen Ultraschall auf kleine Fächer ist. Das derzeitige Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Messung der Membranfunktion in der Maus. Darüber hinaus, obwohl es wurden mehrere Studien an Nagetieren auf Membranfunktion, die meisten Ergebnisse wurden durch Isolieren Muskelstreifen direkt aus dem Tier eingeschläfert 5-7 erzeugt. Im Gegensatz dazu ist in einem in-vivo-diagnostischen Ultraschall-Bildgebungsverfahren für die Analyse von Membranaktivität verringern würde die Zahl der Tiere geopfert für Experimente. Darüber hinaus Langzeitbehandlungen auf die Verbesserung der Kontraktilität Membran konzentriert kann genau über Ultraschall in Nagetiermodellen ohne Tiere beurteilt werden.
ntent "> In unserem Labor haben wir eine effektive Methode zur Visualisierung und Analyse von Mausmembranaktivität mit Hilfe eines Ultraschall-Maschine, die das Verständnis der Membran-Funktion hilft in vivo, vermeidet invasive Methoden zu Tieren, und hilft bei der Entwicklung von therapeutischen entwickelt Behandlungen für Atemfunktionsstörungen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren, die Tierversuchspersonen wurden genehmigt und in Übereinstimmung und Einhaltung der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Vorschriften und Richtlinien abgeschlossen.
1. Maus Anästhesie
- Richten Sie ein sauberes Verfahren Tisch mit einem beheizten isothermen Pad in einer chirurgischen Handtuch gewickelt. Das Heizkissen sollte zwischen 30 ° C und 34 ° C gehalten werden, um zu stabilisieren Kerntemperatur des Tieres, während die potenziellen Stress für das Tier.
- Platzieren Sie die Maus in einer Narkose Kammer mit den folgenden Parametern: Sauerstoffflussrate von 1,5 L / min und Isofluran-Verdampfer auf 3,5% eingestellt. Komplette Sedierung sollte innerhalb von 1-2 Minuten dauern. Wenn eine Induktionskammer nicht verfügbar ist, kann eine Glocke mit einem Drahtgeflecht am Boden positioniert, um direkten Kontakt mit dem Tier zu vermeiden Isofluran verwendet werden.
- Die Maus vom Induktionskammer unverzüglich entfernen, sobald esvollständig betäubt (erreicht, wenn die Maus verliert Willkürmotorik). Tragen Sie eine Nasenkegel auf das Tier für die Wartung der Anästhesie. Die Sauerstoffströmungsgeschwindigkeit sollte auf etwa 0,5 l / min reduziert und die Isofluran Verdampfer sollte im Bereich von 1,5 bis 2,5% eingestellt werden.
- Eine kleine Menge von Augensalbe direkt auf der Hornhaut, Augentrockenheit 8 zu reduzieren. Außerdem während der Anästhesie, die Maus sollte ein Fehlen des Pedals Rückzugsreflex zu erhalten, sollte die Schleimhäute eine rosa Farbe bleiben und Atmung sollte stetig angezeigt.
2. Vorbereitung für diagnostische Ultraschall-Bildgebung Ordnung
- Halten jede Etappe der Maus auf der beheizten Prozedur-Tabelle mit einem entfernbaren Klebstoff, wie chirurgisches Band.
- Mit einem elektrischen Rasierer, entfernen die Haare an der ventralen Körperoberfläche zwischen dem Bauch und auf halber Höhe der Brusthöhle. Bewerben Enthaarungscreme weiter rebewegen Sie die restlichen Haare, die nicht von dem Rasiermesser geschnitten wird. Wischen Sie die Creme mit einem feuchten Gaze nach 2-3 min.
- Entfernen Sie die überschüssige Haare mit einem mit Wasser befeuchteten Gaze und reinigen Sie die rasierte Region mit 70% Alkohol oder gleichwertig antiseptisch. Die Ultraschallsonde wird auf diesen Bereich angewendet werden, um Membranfunktion visualisieren. Ein aktuelles Analgetikum darf Tieren erleben kleinere Hautreizungen durch Haarentfernung zur Verfügung gestellt werden.
3. Diagnostische Ultraschall-Bildgebung Protokoll
- Schalten Sie das Ultraschallgerät und stellen Sie die Ausgangsleistung (falls erforderlich) auf das Gerät durch den Prozentsatz, um eine optimale Auflösung zu erhalten.
- Stellen Sie das Ultraschallgerät, um entweder B (Helligkeit)-Modus, M (Bewegung)-Modus oder sowohl vor Bildgebung, die für die richtige Visualisierung der Maus Membran Kontraktion ermöglicht.
- Eine kleine Menge von Ultraschall-Gel auf den oberen Bauch der Maus und massieren Sie das Gel in Richtung der Brusthöhle.
- Legen Sie die UltraSchallwandler in diesem Bereich und Winkel sie nach oben zum Herzen hin. Stellen Sie die Sonde bis eine optimierte Auflösung des Bildes erzielt wird. HINWEIS: Für dieses Protokoll ist ein Mikroarray konvexe oder lineare Phased-Array-Wandler eine ideale Sonde aufgrund des geringen Platzbedarfs und ausgezeichnete axiale Auflösung 9 zu verwenden; die Frequenz muss über die Bandbreite angepasst werden und für diese Versuche eine Reihe von 6.5-12 MHz verwendet werden.
- Drücken Sie die Taste FREEZE, um vorübergehend die Membran Bilder speichern und die ausgewählten Kontraktionen.
- Speichern Sie die Aufzeichnung als Kinoschleife, die für den späteren Messungen der Zwerchfellexkursion sowie Atemfrequenz ermöglicht. Hinweis: Bilder von Bildern kann in der Computer-Speicher oder auf einer externen Festplatte zur späteren Analyse 9 gespeichert werden.
- Genau messen die Tiefe der Membranbewegung von Entspannung Kontraktion mit den elektronischen Bremssättel, die Teil der Ultraschall-Software sind.
- Konvertieren Sie dieCine-Loop-Datei in eine MPEG-Datei und bestimmen die Atmungsrate, indem die Anzahl der Zwerchfellkontraktionen während des Aufzeichnungszeitraums. Alternativ kann die Anzahl der Kontraktionen pro Minute (Atemfrequenz) von M-Modus-Bild gezählt.
4. Beitrag Anästhesie Tierrettung
- Die Maus sollte vollständig von der Narkose erholen innerhalb 1 Stunde. Das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichend Brustlage zu halten.
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Representative Results
Ein typisches Ultraschallbild einer Maus Membran ist in Fig. 1A gezeigt. Die Maus Membran maximale vertikale Verschiebung aufgezeichnet wurde. Dieser Abstand wurde durch genaues Messen der Tiefe der Membranbewegung von der Entspannung der Kontraktion mit der elektronischen Bremssättel, die Teil der Ultraschall-Software. Tabelle 1 zeigt diese Entfernungsmessungen von Zwerchfellkontraktionen von drei verschiedenen Mäusen berechnet. Nach der Umwandlung der Filmschleife Datei in eine MPEG-Datei wurde die Atmungsrate, indem die Anzahl der Zwerchfellkontraktionen während eines sechs zweite Aufzeichnungsperiode bestimmt. Diese Analyse kann unter Verwendung von B-Modus werden. Alternativ stellt M-Modus-Bild visualisiert eine vertikale Bewegung der Membran als auch die Atemfrequenz, wie in Fig. 1B gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß dieses Verfahren wirksam beim genauen Beobachtung Maus Membran Kontraktionen. Ferner kann durch recordi ng Blendenfunktion ermöglicht dieses Protokoll auch für die Bewertung der zwei wichtige Parameter, wie Blende Ausflugs-und Atemfrequenz. Dieses bildgebende Verfahren ist zur direkten Vergleich zwischen gesunden und kranken Zwerchfell. Fig. 2 veranschaulicht, aber die potentiellen Bildartefakte, die bei der Durchführung von diagnostischen Ultraschall-Bildgebung auftreten können.
Abbildung 1. A. Ein Vertreter Ultraschallbild einer Maus Zwerchfell (B-Modus). Die festen und gestrichelten Linien zeigen die Membran während kontrahiert und entspannt Staaten bzw. B.. Ein Vertreter Ultraschallbild eines Vertrags Maus Membran (M-Modus).pg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Ein Ultraschallbild von Maus Zwerchfell mit dem Vorhandensein von möglichen Nachhall (A) und Kometen-Schweif (B) Artefakte (durch die Pfeile angedeutet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| 1. Messung (mm) | 2. Messung(Mm) | 3. Messung (mm) | Durchschnitt (mm) ± SD | |
| Maus 1 | 0,96 | 0,92 | 1,06 | 0,980 ± 0,072 |
| Maus 2 | 0,93 | 0,99 | 1,01 | 0,977 ± 0,042 |
| Maus 3 | 0,91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Tabelle 1. Entfernung Messungen der Maus Membranbewegung. Mittees wurden drei separate aufgezeichneten Werte für jede einzelne Maus berechnet. Die Standardabweichung ist als SD definiert. Hinweis-, Tier Varianz hat keinen signifikanten Einfluss auf die Messung von Membran Kontraktionen (P = 0,1224).
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Discussion
Die aktuelle Versuchsprotokoll entwickelt diagnostische Ultraschallbildgebungsspezifische Membran Aktivität in einem Mausmodell-Techniken über eine nicht-invasive, In-vivo-Ansatz. Die Narkosegerät Einstellungen sind Näherungswerte, die etwas für jedes Tier eingestellt werden kann, da einzelne Mäuse können unterschiedlich auf die Anästhesie reagieren werden. Um eine unzureichende Betäubung Verwaltung zu vermeiden, ist es wichtig, der Maus die Vitalzeichen wie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Körpertemperatur regelmäßig zu überwachen. Außerdem müssen Haar vor dem Ultraschalluntersuchung entfernt werden, weil unrasierte Haar kann das Bild verwischen und zu verhindern, genaue Visualisierung der Membran Kontraktionen.
Wir verwendeten B-Mode-Ultraschall-Bildgebung, um eine zweidimensionale (2D) stellen Querschnittsbild des Maus Membran und M-Modus verwendet, um die Membranbewegung Kinetik zu überwachen. Es ist wichtig, einen Mikro konvexen Array-Wandler für 2D-Bilder zu verwenden, da es proVides verbesserte axiale Auflösung von oberflächlich gelegen anatomischen Strukturen im Vergleich zu herkömmlichen linearen Schall 10. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die elektronische Fokussierung des Bildes verschlechtert sich die Brennweite verlängert 9. Außerdem sollte eine ausreichende Menge von Ultraschall-Gel auf der Mausunterleib für den Erwerb deutliche Bilder angewendet werden. Das Gel wird die Möglichkeit von Lufteinschlüssen zwischen der Haut und dem Wandler, um ein hochauflösendes Bild 11 zu erzeugen.
Obwohl die Anwendung der diagnostischen Ultraschall-Bildgebung vielversprechend ist, gibt es Einschränkungen bei Verwendung dieser Technik als Forschungswerkzeug. Zum Beispiel ist es wichtig, dass der Endbenutzer ist gut ausgebildeten beim Erhalt genauer und reproduzierbarer Bildern und ist in der Lage, Blenden Aktivität konstant zu interpretieren. Außerdem treten Spiegelbildartefakte, wenn eine anatomische Struktur, wie beispielsweise die Membran, wird zweimal auf dem Monitor angezeigt. Dies ist betrachtenED eine Ausbreitungs Artefakt und die Ergebnisse in der Reflexion nicht ordnungsgemß innerhalb des Ultraschallbetriebssystem 12,13 angeordnet. Beispielsweise können Ultraschallwandler mehrere außeraxiale Strahlen reflektieren kann, die aus einer anatomischen Struktur, die nicht in dem Weg des Hauptstrahls 12,14 herzustellen. Darüber hinaus kann aufgrund der Brechung, der Strahl nicht immer in einer geraden Linie von dem Reflektor zu reisen. Da der Ultraschall nur das Signal, das an den Wandler zurück verarbeiten und die Zeitsteuerung des Brechungs nicht bestimmen, kann der Monitor wahrscheinlich die gleichen anatomischen Struktur anzuzeigen zweimal in unterschiedlichen Abständen und zeigen somit ein Spiegelbild Artefakt.
Eine weitere Ausbreitung Artefakt, das auftritt, ist Nachhall. Dieses Artefakt angezeigt gleichmäßig beabstandeten parallelen Linien, die sich im allgemeinen senkrecht zum Ultraschallstrahl (2A) 15 angeordnet. Diese Art von Artefakt kann eine echte Feld störenVision und Maske spezifischen anatomischen Strukturen von Interesse. So ist bei der Analyse der Daten berücksichtigt werden. Eine Teilmenge der Nachhall Artefakt ist der Komet-Tail-oder B-Linien. Diese sind eine Art von Artefakt, das Nachhall eine vertikale Flugbahn des dichten Echos bildet, die sich von der Membran auf den Rand des Ultraschallbild 16 (wie in Fig. 2B dargestellt). Diese Artefakte werden durch Mehrfachreflexionen, die zwischen oder innerhalb einer Struktur und dem Wandler 13, der durch Abwinkeln des Wandlers, um eine senkrechte Berührung mit der spiegelnden Objekten 17 zu vermeiden, minimiert werden kann vorkommen erzeugt. Trotz dieser Einschränkungen diagnostischen Ultraschall-Bildgebung ermöglicht eine sichere, empfindliche und schnelle Analyse von Membranfunktion in einem Mausmodell, das potenziell auswerten kann Nagetier Membran Dysfunktion und zur Entwicklung von neuartigen präklinischen Therapien für Erkrankungen der Atemwege.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse von OU General Fund G110 und Research Excellence Fonds für Biomedizinische Forschung und OSU-Fonds HRS 013.000 unterstützt. Die Autoren möchten Lauren Chen für ihre Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
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