Summary
ההדמיה אולטרה סאונד לאבחון הוכיחה להיות יעיל באבחון מחלות בדרכי הנשימה שונות בבני אדם ובעלי חיים. אנו מדגימים פרוטוקול אולטרסאונד מקיף מנוצל על ידי המעבדה של ד"ר זואו לנתח קינטיקה סרעפת במיוחד במודלים של עכבר. זו גם טכניקת מחקר לא פולשנית שיכול לספק מידע כמוני על תפקוד שרירים בדרכי הנשימה בעכבר.
Abstract
ניתוח תפקוד של שרירי שלד בדרכי הנשימה של מכרסמים, ובעיקר הסרעפת, מבוצע בדרך כלל על ידי בידוד רצועות שריר באמצעות ניתוחים פולשניים. למרות שזו שיטה יעילה להערכה בפעילות סרעפת מבחנה, זה כרוך בניתוח שאינו הישרדות. היישום של ההדמיה אולטרה סאונד לא פולשני כמו הליך in vivo מועיל שכן הוא לא רק מפחית את מספר בעלי החיים הקריב, אבל מתאים גם לניטור התקדמות מחלה בעכברים חיים. לפיכך, שיטת ההדמיה אולטרסאונד עשויה עשויה לסייע בפיתוח של טיפולים חדשניים שיקלו פגיעה בשרירים הנגרמים על ידי מחלות נשימה שונות. במיוחד, באבחנות קליניות של מחלות ריאה חסימתית, יש הדמיה אולטרסאונד הפוטנציאל לשמש בשילוב עם בדיקות סטנדרטיות אחרות כדי לזהות את ההתחלה המוקדמת של עייפות שריר סרעפת. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים כיצד להעריך contracti סרעפת במדויקlity במודל של עכברים תוך שימוש בטכניקת הדמיה אולטרה סאונד לאבחון.
Introduction
לאחרונה, טכניקות הדמיה אולטרסאונד לאבחון יושמו מודלים עכבר של יתר לחץ דם renovascular ו1,2 סרטן לבלב. עם זאת, טכניקות אלה לא היו בשימוש נרחב בassay תפקוד שרירים נשימה המכרסם. לכן, פיתחנו שיטת הדמיה אולטרסאונד לאבחון ככלי רב ערך עבור in vivo הערכות אורך של ניידות סרעפת בעכברים.
ישנם מספר יתרונות להדמית אולטרה סאונד לאבחון. לדוגמא, זה לא פולשנית, בטוח, נייד, ומאפשר מדידה בזמן אמת בעלות נמוכה יחסית 3. במיוחד, מכשירי אולטרסאונד בתדר נמוך מסוימים הצליחו לזהות לכידת אוויר, מאפיין קליני של מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) עם קל עד הגבלת זרימת אוויר חמורה 4. לפיכך, הדמיה אולטרסאונד אבחון עשויה לשמש ככלי סינון נגישים ושחזור לניטור בזמן אמת של הפרעות בדרכי הנשימה.
טכניקות הדמיה אולטרסאונד לאבחון לעתים קרובות חלות על בעלי חיים גדולים יותר או בבני אדם. עם זאת, היו מספר מצומצם של מחקרי ההדמיה אולטרסאונד במודלים של עכברים, שהוא ככל הנראה בשל האתגרים של ביצוע אולטרסאונד בנושאים בקנה מידה קטנה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך חדשני למדידת תפקוד סרעפת בעכבר. בנוסף, למרות שהיו כמה מחקרים במכרסמים על תפקוד סרעפת, רוב התוצאות היו שנוצרו על ידי בידוד רצועות שריר ישירות מבעלי החיים מומתים 5-7. לעומת זאת, השימוש בשיטת הדמיה אולטרסאונד לאבחון in vivo לניתוח פעילות סרעפת הייתי להקטין את מספרם של בעלי החיים מוקרבים לניסויים. יתר על כן, טיפולים לטווח ארוך מתמקדים בשיפור התכווצות סרעפת ניתן להעריך בצורה מדויקת באמצעות אולטרסאונד במודלים של מכרסמים מבלי להקריב בעלי חיים.
ntent "> במעבדה שלנו, פיתחנו שיטה יעילה להמחשה, כמו גם ניתוח פעילות סרעפת עכבר באמצעות מכשיר אולטרסאונד, אשר מסייע להבנה של תפקוד סרעפת in vivo, נמנע משיטות פולשניות לבעלי חיים, ומסייע בפיתוח טיפולי טיפולים לבעיות בתפקוד נשימה.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים כרוכים בנושאי בעלי חיים אושרו והושלמו בהתאם ועמידה בועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית אוניברסיטת אוהיו תקנות (IACUC) והנחיות.
1. עכבר הרדמה
- הגדרת שולחן הליך נקי עם כרית בידוד תרמית מחוממת העטופה במגבת כירורגית. כרית החימום יש לשמור בין 30 מעלות צלזיוס ו34 ° C כדי לייצב את טמפרטורת הליבה של בעל החיים תוך הפחתת לחץ פוטנציאלי לבעלי החיים.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה הרדמה עם הפרמטרים הבאים: להגדיר את זרימת חמצן לשיעור 1.5 ליטר / דקה ומאדה isoflurane מוגדר .3.5%. הרגעה מלאה אמורה להתרחש בתוך 1-2 דקות. אם תא אינדוקציה אינו זמין, צנצנת פעמון ניתן להשתמש עם רשת תיל ממוקמת בחלק התחתון כדי להימנע ממגע ישיר עם בעלי החיים isoflurane.
- מייד להסיר את העכבר מתא האינדוקציה פעם זההוא הרדים לחלוטין (מושגת כאשר העכבר מאבד את התפקוד מוטורי מרצון). החל האף חרוט לבעלי החיים לצורך התחזוקה של הרדמה. קצב זרימת החמצן צריך להיות מופחת בכ 0.5 ליטר / דקה ומאדה isoflurane צריך להיות מוגדר בטווח של 1.5-2.5%.
- למרוח כמות קטנה של משחה עיניים ישירות לקרניות להפחית יובש בעיניים 8. בנוסף, במהלך הרדמה, העכבר צריך לשמור על עדר רפלקס נסיגת דוושה, הריריות צריכה להישאר בצבע ורוד, והנשימה אמורה להופיע יציבה.
2. הכנה לאבחון אולטראסאונד הדמיה הנוהל
- לרסן את כל רגל של העכבר על שולחן ההליך המחומם עם דבק נשלף, כגון קלטת כירורגית.
- שימוש במכונת גילוח חשמלי, להסיר את השיער על פני גוף הגחון בין דרך הבטן וחצי עד חלל בית החזה. החל קרם להסרת שיער לעוד יותר מחדשלהזיז את השיער שנותר כי הוא לא נחתך על ידי סכין הגילוח. נגב את השמנת עם תחבושת לחה לאחר 2-3 דקות.
- להסיר את השיער העודף באמצעות תחבושת לחלח מים ולנקות את האזור המגולח עם אלכוהול 70% או שווה ערך אנטיספטי. הבדיקה אולטרסאונד תחול על תחום זה כדי להמחיש תפקוד סרעפת. משכך כאבים אקטואליים עשויים להיות מסופקים לבעלי חיים חווים גירוי בעור קטין עקב הסרת שיער.
3. אבחון אולטראסאונד הדמיה פרוטוקול
- הפעל את מכשיר אולטרסאונד ולהתאים את תפוקת החשמל (במידת צורך) על ידי מנגנון אחוז כדי לקבל רזולוציה אופטימלית.
- הגדר את מכשיר אולטרסאונד לאו B (בהירות) במצב, M (תנועה) במצב, או שניהם לפני ההדמיה, המאפשר להדמיה תקינה של התכווצות סרעפת עכבר.
- למרוח כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד על הבטן העליונה של העכבר ולעסות את הג'ל אל חלל בית החזה.
- הנח את אולטרהנשמע מתמר באזור זה ואת זוויתו כלפי מעלה לכיוון הלב. התאם את הבדיקה עד ברזולוציה ממוטבת של התמונה מושגת. הערה: עבור פרוטוקול זה, מערך מיקרו קמור או מתמר מערך ליניארי הדרגתי הוא בדיקה אידיאלית לשימוש עקב טביעת הרגל הקטנה ורזולוציה צירית מצוינת 9; התדירות צריכה להיות מותאמת לרוחב הפס ולניסויים אלה מגוון של 6.5-12 MHz עשוי להיות מנוצל.
- לחץ על לחצן הקפאה כדי לחסוך באופן זמני את תמונות הסרעפת ולהציג את הצירים שנבחרו.
- שמור את ההקלטה כלולאת קולנוע, המאפשרת למדידות מאוחרות יותר של טיול סרעפתית, כמו גם קצב נשימה. הערה: מסגרות של תמונות ניתן לשמור בזיכרון המחשב או על כונן קשיח חיצוני לניתוח בעתיד 9.
- בדיוק למדוד את העומק של תנועת סרעפת מהרפיה להתכווצות באמצעות מחוגה האלקטרונית שהם חלק מתוכנת אולטרסאונד.
- המרתקובץ Cine לולאה לתוך קובץ MPEG ולקבוע את קצב הנשימה על ידי ספירת מספר התכווצויות סרעפתי במהלך תקופת ההקלטה. לחלופין, מספר הצירים לדקה (קצב נשימה) ניתן לספור מתמונת M-mode.
4. הודעה שחזור בעלי החיים הרדמה
- העכבר צריך להחלים לגמרי מהרדמה תוך שעה 1. אל תשאירו את בעלי החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונת אולטרסאונד טיפוסית של סרעפת עכבר מוצגת באיור 1 א. התזוזה האנכית המקסימלי סרעפת העכבר נרשמה. מרחק זה מחושב על ידי בדיוק מדידת העומק של תנועת סרעפת מהרפיה להתכווצות באמצעות מחוגה האלקטרונית שהם חלק מתוכנת אולטרסאונד. טבלת 1 מציגה מדידות מרחק אלה של התכווצויות סרעפתי משלושה עכברים שונים. לאחר המרת קובץ Cine הלולאה לתוך קובץ MPEG, קצב הנשימה נקבע על ידי ספירת מספר התכווצויות סרעפת במהלך שש תקופת הקלטה שנייה. ניתוח זה יכול להתבצע באמצעות B-mode. לחלופין, M-mode מספק תמונה דמיינו תנועה אנכית סרעפת, כמו גם קצב נשימה כפי שמוצג באיור 1. תוצאות אלו מראות כי שיטה זו היא יעילה בצורה מדויקת התבוננות התכווצויות סרעפת עכבר. יתר על כן, על ידי recordi ng תפקוד סרעפת, פרוטוקול זה מאפשר גם להערכת שני פרמטרים חשובים, כולל טיול סרעפת וקצב נשימה. שיטת הדמיה זו שימושית להשוואה ישירה בין שריר סרעפת בריא וחולה. עם זאת, איור 2 מדגים את ממצאי הדמיה הפוטנציאליים שעלולות להתרחש בעת ביצוע ההדמיה אולטרה סאונד לאבחון.
איור 1. א תמונת אולטרסאונד נציג של שריר סרעפת עכבר (B-mode). הקווים מוצקים ומקווקוים מתארים את הסרעפת במדינות נדבקו ורגועים, בהתאמה. ב '. תמונת אולטרסאונד נציג של סרעפת עכבר קבלנות (M-mode).pg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. תמונת אולטרסאונד של שריר סרעפת עכבר עם הנוכחות של הדהוד אפשרית () ושביט זנב חפצים (ב) (המסומנים בחיצים). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 1 st מדידה (מ"מ) | 2 מדידת nd(מ"מ) | 3 rd מדידה (מ"מ) | ממוצע (מ"מ) ± סטיית תקן | |
| 1 מאוס | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0.980 ± 0.072 |
| עכבר 2 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977 ± 0.042 |
| עכבר 3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0.910 ± 0.020 |
מדידות טבלה 1. מרחק של תנועת סרעפת עכבר. בסיס ממוצעes חושבו משלושה ערכים שנרשמו נפרדים לכל עכבר בודד. סטיית תקן מוגדרת כSD. שים לב, יש שונות בעלי החיים אין השפעה משמעותית על המדידה של התכווצויות סרעפת (P = 0.1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול הניסוי הנוכחי מפתחת טכניקות הדמיה אולטרסאונד לאבחון ספציפיות לפעילות הסרעפת במודל של עכברים באמצעות vivo גישה לא פולשנית, ב. הגדרות מנגנון ההרדמה הן ערכים מקורבים, אשר עשוי להיות מותאם במקצת עבור כל חיה מאז עכברים בודדים עשויים להגיב באופן שונה להרדמה. כדי למנוע ממשל הרדמה לא תקין, זה חשוב לנטר באופן קבוע את הסימנים החיוניים של העכבר כולל את קצב הלב, קצב נשימה, טמפרטורת גוף. יתר על כן, יש להסיר את השיער לפני סריקת אולטרסאונד, כי שיער לא מגולח עלול לטשטש את התמונה ולמנוע הדמיה מדויקת של התכווצויות הסרעפת.
אנחנו השתמשנו בהדמיית אולטראסאונד B-מצב כדי לספק דו ממדים (2D) תמונת חתך רוחב של הסרעפת העכבר ומשמשים M-mode כדי לפקח קינטיקה תנועת סרעפת. חשוב להשתמש במתמר מערך מיקרו קמור לתמונות 2D כי זה הפרוvides שיפור רזולוציה צירית של מבנים אנטומיים הממוקמים באופן שטחי בהשוואה למתמר מערך ליניארי מסורתי 10. כמו כן, חשוב לציין אלקטרוני שהתמקדות של התמונה מדרדרת כאורך המוקד מורחב 9. בנוסף, כמות מספקת של ג'ל אולטרסאונד צריכה להיות מוחלת על בטנו של העכבר לרכישת תמונות שונות. ג'ל מגביל את האפשרות של כיסי אוויר בין העור והמתמר כדי להפיק תמונה ברזולוציה גבוהה 11.
למרות היישום של ההדמיה אולטרסאונד לאבחון הוא מבטיח, יש מגבלות לשימוש בטכניקה זו ככלי מחקר. לדוגמא, זה קריטי, כי משתמש הקצה הוא מאומן היטב בקבלת תמונות מדויקות ושחזור, והוא מסוגל לפרש את פעילות סרעפת באופן עקבי. יתר על כן, ממצאי תמונת הראי להתרחש כאשר מבנה אחד אנטומיים, כגון הסרעפת, מוצג פעמיים על המסך. זה לשקולאד חפץ התפשטות ותוצאות בהשתקפות שממוקמת בצורה לא נכונה בתוך 12,13 מערכת ההפעלה אולטרסאונד. כך, למשל, מתמרים אולטרסאונד יכול לייצר כמה קורות מחוץ הציר שיכול לשקף את מבנה האנטומי שאינו במסלול של 12,14 הקורה המרכזי. יתר על כן, בשל שבירה, הקרן עשויה שלא תמיד נוסעת בקו ישר מרפלקטור. מאז אולטרסאונד רק יכול לעבד את האותות המוחזרים למתמר ולא יכול לקבוע את העיתוי של השבירה, הצג עשוי עשוי להציג את אותו מבנה האנטומי פעמיים במרחקים שונים ובכך מפגין חפץ תמונת ראי.
חפץ התפשטות נוסף שנתקל בה הוא הדהוד. מציג ממצא זה מחולקים באופן שווה קווים מקבילים שהם בדרך כלל ממוקמים בניצב לקורה אולטרסאונד (איור 2 א) 15. סוג זה של חפץ עשוי לשבש את שדה אמיתי שלמבני חזון ומסכה ספציפיים האנטומי של עניין. לפיכך, יש לנקוט בזהירות בעת ניתוח הנתונים. קבוצת משנה של חפץ הדהוד הוא שביט הזנב או B-קווים. אלה הם סוג של חפץ הדהוד שיוצר מסלול אנכי של הדים צפופים, המשתרע מהסרעפת עד לקצה של מסך אולטרסאונד 16 (כפי שמודגם באיור 2). ממצאים אלה מיוצרים על ידי השתקפויות מרובות שמתרחשים בין או בתוך מבנה ומתמר 13, שניתן למזער על ידי לדוג את המתמר, כדי למנוע מגע בניצב עם specular אובייקטי 17. למרות מגבלות אלה, אולטרסאונד הדמיה אבחון מאפשרת ניתוח בטוח, רגיש ומהיר של תפקוד סרעפת במודל של עכברים, אשר יכול להעריך את תפקוד סרעפת מכרסמים ולעזור לפתח טיפולים טרום קליניים חדשניים להפרעות בדרכי הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של OU הקרן הכללית G110 וקרן מחקר למצוינות של מחקר ביו וOSU-HRS קרן 013,000. המחברים מבקשים להודות ללורן חן על סיועה בהכנת כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
