Summary
Diagnostica ecografica ha dimostrato di essere efficace nella diagnosi delle diverse malattie respiratorie in soggetti umani e animali. Dimostriamo un protocollo ecografia completa utilizzata da laboratorio del Dr. Zuo per analizzare la cinetica del diaframma in particolare in modelli murini. Questa è anche una tecnica di ricerca non invasiva che può fornire informazioni quantitative sulla funzione dei muscoli respiratori mouse.
Abstract
Analisi Funzione di roditore muscoli scheletrici respiratorio, in particolare il diaframma, viene comunemente eseguita isolando strisce muscolari utilizzando procedure chirurgiche invasive. Anche se questo è un metodo efficace di valutazione in vitro dell'attività diaframma, esso comporta un intervento chirurgico non-sopravvivenza. L'applicazione di non invasiva ecografia come una procedura in vivo è utile in quanto non solo riduce il numero di animali sacrificati, ma è adatto anche per monitorare la progressione della malattia in topi vivi. Così, il nostro metodo di imaging ad ultrasuoni può probabilmente contribuire allo sviluppo di nuove terapie che alleviano lesione muscolare indotto da varie malattie respiratorie. In particolare, nella diagnosi clinica delle malattie polmonari ostruttive, ecografia ha il potenziale di essere utilizzato in combinazione con altri test standard per rilevare l'insorgenza precoce di affaticamento muscolare diaframma. Nel protocollo attuale, si descrive come valutare con precisione diaframma contractilità in un modello murino utilizzando una tecnica diagnostica ecografica.
Introduction
Recentemente, tecniche di imaging ad ultrasuoni di diagnostica sono state applicate a modelli murini di ipertensione renovascolare e pancreas 1,2 cancro. Tuttavia, queste tecniche non sono stati ampiamente utilizzati in roditori respiratoria saggio di funzione muscolare. Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo di imaging ad ultrasuoni di diagnostica come un valido strumento per le valutazioni in vivo longitudinali di mobilità del diaframma nei topi.
Ci sono diversi vantaggi per diagnostica ecografica. Per esempio, è invasivo, sicuro, portatile, e consente misurazioni in tempo reale ad un costo relativamente basso 3. In particolare, alcuni dispositivi ad ultrasuoni a bassa frequenza sono stati in grado di rilevare air trapping, una caratteristica clinica della malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO) con lieve a grave limitazione al flusso aereo 4. Così, diagnostica ecografica può servire come un metodo di screening facilmente accessibile e riproducibile per il monitoraggio in tempo reale di disturbi respiratori.
Tecniche di imaging ad ultrasuoni di diagnostica sono spesso applicati agli animali più grandi o soggetti umani. Tuttavia, ci sono stati un numero limitato di studi di imaging ad ultrasuoni su modelli murini, che è probabilmente dovuto alle sfide di eseguire ultrasuoni su soggetti di piccole dimensioni. Il protocollo attuale delinea una nuova procedura per misurare la funzione diaframma nel topo. Inoltre, anche se ci sono stati diversi studi sui roditori sulla funzione del diaframma, la maggior parte dei risultati sono stati ottenuti isolando fasce muscolari direttamente dall'animale eutanasia 5-7. Al contrario, utilizzando un metodo di imaging diagnostico ad ultrasuoni in vivo per analizzare l'attività diaframma diminuirebbe il numero di animali sacrificati per la sperimentazione. Inoltre, i trattamenti a lungo termine incentrati sul rafforzamento della membrana contrattilità possono essere valutati con precisione con gli ultrasuoni in modelli di roditori senza sacrificare animali.
S copi "> Nel nostro laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo efficace per la visualizzazione e l'analisi dell'attività diaframma mouse usando una macchina ad ultrasuoni, che aiuta la comprensione della funzione di diaframma in vivo, evita metodi invasivi agli animali, e facilita lo sviluppo di terapeutica trattamenti per la disfunzione respiratoria.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati e completati in conformità e il rispetto degli Institutional Animal Care ed uso commissione Ohio State University (IACUC) norme e linee guida.
1. Topo Anestesia
- Istituire un tavolo procedura pulita con un pad isotermica riscaldata avvolta in un asciugamano chirurgico. Il rilievo di riscaldamento deve essere mantenuta tra 30 ° C e 34 ° C per stabilizzare la temperatura interna dell'animale, riducendo la probabilità di stress per l'animale.
- Posizionare il mouse in una camera di induzione di anestesia con i seguenti parametri: flusso di ossigeno impostato a 1,5 L / min e vaporizzatore isoflurano impostato a 3,5%. Sedazione completa dovrebbe avvenire entro 1-2 min. Se una camera di induzione non è disponibile, una campana di vetro può essere utilizzato con una rete metallica posizionata nella parte inferiore per evitare il contatto diretto con l'animale isoflurano.
- Rimuovere immediatamente il mouse dalla camera di induzione voltaè completamente anestetizzato (raggiunta quando il mouse perde la funzione motoria volontaria). Applicare un naso-cono all'animale per il mantenimento dell'anestesia. Il flusso di ossigeno deve essere diminuito di circa 0,5 L / min e il vaporizzatore isoflurano dovrebbe essere impostato in un range da 1,5 a 2,5%.
- Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica direttamente alle cornee per ridurre la secchezza degli occhi 8. Inoltre, durante l'anestesia, il mouse dovrebbe mantenere l'assenza del riflesso ritiro pedale, le mucose dovrebbero rimanere di colore rosa, e la respirazione dovrebbe apparire costante.
2. Preparazione per Diagnostic Ultrasound Imaging procedura
- Trattenere ogni tappa del mouse sulla tabella procedura riscaldata con un adesivo rimovibile, come nastro chirurgico.
- Usando un rasoio elettrico, rimuovere i capelli sulla superficie ventrale del corpo tra il modo addome e mezza la cavità toracica. Applicare crema depilatoria per ulteriori respostare i capelli rimanenti non tagliata dal rasoio. Pulire la crema con una garza umida dopo 2-3 minuti.
- Rimuovere i peli in eccesso utilizzando una garza imbevuta di acqua e pulire la regione rasata con il 70% di alcool o equivalente antisettico. La sonda ad ultrasuoni viene applicato a questa zona per visualizzare la funzione diaframma. Un analgesico topico può essere fornito agli animali che avvertono lievi irritazioni cutanee a causa di depilazione.
3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol
- Accendere il dispositivo ad ultrasuoni e regolare la potenza di uscita (se necessario) sull'apparecchio per percentuale avere risoluzione ottimale.
- Impostare la macchina ad ultrasuoni a uno B (luminosità)-mode, M (moto)-mode, o entrambi prima di imaging, che consente la corretta visualizzazione della contrazione diaframma mouse.
- Applicare una piccola quantità di gel ultrasuoni sull'addome superiore del mouse e massaggiare il gel verso la cavità toracica.
- Posizionare l'ultrasuono trasduttore in questa zona e l'angolo verso l'alto verso il cuore. Regolare la sonda fino a raggiungere una risoluzione ottimizzata dell'immagine. Nota: per questo protocollo, una matrice di micro-convessa o lineare phased array di trasduttori è una sonda ideale da usare grazie al minimo ingombro e un'eccellente risoluzione assiale 9; richiede la frequenza da regolare attraverso la larghezza di banda e per questi esperimenti una gamma di 6.5-12 MHz può essere utilizzata.
- Premere il pulsante FREEZE per salvare temporaneamente le immagini diaframma e visualizzare le contrazioni selezionati.
- Salvare la registrazione come cine loop, che permette di successive misure di escursione diaframmatica, così come il tasso di respirazione. Nota: fotogrammi di immagini possono essere salvate nella memoria del computer o su un disco rigido esterno per le analisi future 9.
- Proprio misurare la profondità del movimento del diaframma dal relax alla contrazione utilizzando calibri elettronici che fanno parte del software ultrasuoni.
- Convertire ilfile di cine loop in un file MPEG e determinare il tasso di respirazione contando il numero di contrazioni diaframmatiche durante il periodo di registrazione. In alternativa, il numero di contrazioni al minuto (frequenza respiratoria) può essere conteggiato dall'immagine M-mode.
4. Post anestesia recupero degli animali
- Il mouse dovrebbe recuperare completamente dall'anestesia entro 1 ora. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
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Representative Results
Una tipica immagine ecografica di un diaframma mouse viene mostrato nella Figura 1A. Il diaframma topo spostamento verticale massima è stata registrata. Questa distanza è stata calcolata misurando con precisione la profondità di movimento del diaframma da relax contrazione utilizzando calibri elettronici che fanno parte del software ultrasuoni. Tabella 1 visualizza queste misurazioni della distanza di contrazioni diaframmatici da tre diversi topi. Dopo la conversione del file cine loop in un file MPEG, la frequenza respiratoria è stata determinata contando il numero di contrazioni diaframmatiche durante un secondo periodo di registrazione di sei. Questa analisi può essere eseguita utilizzando B-mode. In alternativa, M-mode fornisce un'immagine visualizzata di diaframma movimento verticale e la frequenza respiratoria come mostrato nella Figura 1B. Questi risultati dimostrano che questo metodo è efficace per osservare con precisione contrazioni diaframma mouse. Inoltre, da recordi ng funzione di diaframma, questo protocollo consente inoltre di valutare due parametri importanti, tra cui escursioni diaframma e la frequenza respiratoria. Questo metodo di imaging è utile per un raffronto diretto tra muscolo diaframma sani e malati. Tuttavia, la Figura 2 mostra i potenziali artefatti di imaging che possono verificarsi durante l'esecuzione di diagnostica ecografica.
Figura 1. A. Una immagine rappresentativa ultrasuoni di un diaframma muscolare mouse (B-mode). Le linee continue e tratteggiate rappresentano il diaframma durante gli stati appaltati e rilassato, rispettivamente. B. Una immagine ecografica rappresentativo di un diaframma amministrazione mouse (M-mode).pg "target =" _blank "> Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Un'immagine ecografia del mouse del muscolo diaframma con la presenza di possibili riverbero (A) e a coda di cometa artefatti (B) (indicati dalle frecce). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| 1 misura st (mm) | 2 ° misura(Mm) | 3 ° misura (mm) | Media (mm) ± SD | |
| Mouse 1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0,980 ± 0,072 |
| 2 del mouse | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0,977 ± 0,042 |
| 3 del mouse | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0.910 ± 0.020 |
Misurazioni Tabella 1. Distanza di movimento del mouse diaframma. Averages stati calcolati da tre valori registrati distinte per ciascun singolo mouse. La deviazione standard è definito come SD. Nota, varianza animale non ha effetti significativi sulla valutazione delle contrazioni del diaframma (P = 0,1224).
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Discussion
Il protocollo sperimentale attuale sviluppa diagnostici tecniche di imaging ad ultrasuoni specifica dell'attività diaframma in un modello murino mediante un approccio non invasivo vivo. Le impostazioni di apparecchi per anestesia sono valori approssimati, che possono essere leggermente adattate per ciascun animale in quanto topi individuo può rispondere in modo diverso ad anestesia. Per evitare somministrazione anestesia improprio, è importante controllare regolarmente i segni vitali del topo compresi la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, e la temperatura corporea. Inoltre, i capelli devono essere rimossi prima ecografia perché i capelli la barba lunga può sfocare l'immagine e prevenire la visualizzazione accurata delle contrazioni del diaframma.
Abbiamo usato B-mode imaging ad ultrasuoni per fornire una bidimensionale (2D) in sezione trasversale immagine del diaframma mouse e usato M-mode per monitorare la cinetica di movimento del diaframma. È importante utilizzare un trasduttore a matrice di micro-convessa per immagini 2D perché proVIDES migliore risoluzione assiale di strutture anatomiche localizzati in superficie rispetto ai tradizionali trasduttori di matrice lineare 10. E 'anche importante notare che elettronico focalizzazione dell'immagine degrada come la lunghezza focale è esteso 9. Inoltre, una adeguata quantità di gel ultrasuoni deve essere applicato l'addome del topo per l'acquisizione di immagini distinte. Il gel limita la possibilità di sacche d'aria tra la pelle e il trasduttore per produrre un'immagine ad alta risoluzione 11.
Anche se l'applicazione di diagnostica ecografica è promettente, ci sono limitazioni all'utilizzo di questa tecnica come strumento di ricerca. Per esempio, è fondamentale che l'utente finale è ben addestrato per ottenere le immagini accurati e riproducibili ed è in grado di interpretare l'attività diaframma costante. Inoltre, artefatti speculari verificarsi quando una struttura anatomica, come il diaframma, viene visualizzata due volte sul monitor. Questo è considerareEd un artefatto propagazione e risultati nella riflessione indebita situato all'interno del 12,13 sistema operativo ultrasuoni. Ad esempio, trasduttori a ultrasuoni possono produrre diversi fasci fuori asse che può riflettere fuori una struttura anatomica che non è nel percorso del fascio principale 12,14. Inoltre, a causa della rifrazione, il raggio può non sempre viaggiare in linea retta dal riflettore. Poiché l'ultrasuono può elaborare solo il segnale che viene restituito al trasduttore e non può determinare la temporizzazione della rifrazione, il monitor può probabilmente visualizzare la stessa struttura anatomica due volte a distanze diverse e quindi presentare un artefatto immagine speculare.
Un artefatto propagazione ulteriore che si incontra è il riverbero. Questo manufatto visualizza uniformemente distanziati linee parallele che sono generalmente posizionati perpendicolarmente al fascio di ultrasuoni (Figura 2A) 15. Questo tipo di artefatto può interrompere un vero e proprio campo divisione e maschere specifiche strutture anatomiche di interesse. Pertanto, si deve usare cautela quando si analizzano i dati. Un sottoinsieme di riverberazione artefatto è il B-linee a coda di cometa o. Questi sono un tipo di riverbero manufatto che forma una traiettoria verticale di echi densi, che si estende dal diaframma al bordo dello schermo ultrasuoni 16 (come illustrato nella Figura 2B). Questi manufatti sono prodotti da riflessioni multiple che si verificano tra o all'interno di una struttura e il trasduttore 13, che può essere minimizzata inclinando il trasduttore per evitare un contatto perpendicolare con gli oggetti speculare 17. Nonostante questi limiti, diagnostica ecografica permette un'analisi sicuro, sensibile e rapida della funzione diaframma in un modello murino, che potenzialmente possono valutare roditore disfunzione diaframma e contribuire allo sviluppo di nuove terapie pre-clinici per disturbi respiratori.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti del Fondo UO generale G110 e ricerca di eccellenza Fondo della ricerca biomedica e OSU-HRS Fondo 013.000. Gli autori desiderano ringraziare Lauren Chen per la sua assistenza nella preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
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