Summary
وقد ثبت التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية أن تكون فعالة في تشخيص مختلف أمراض الجهاز التنفسي في مواضيع الإنسان والحيوان. علينا أن نظهر بروتوكول الموجات فوق الصوتية الشاملة التي يستخدمها مختبر الدكتور تسوه لتحليل حركية الحجاب الحاجز وتحديدا في نماذج الماوس. وهذا هو أيضا أسلوب البحوث غير الغازية التي يمكن أن توفر معلومات كمية عن وظيفة الماوس العضلات التنفسية.
Abstract
تحليل وظيفة من القوارض عضلات الهيكل العظمي الجهاز التنفسي، وخصوصا الحجاب الحاجز، ويؤديها عادة من خلال عزل العضلات باستخدام شرائط العمليات الجراحية الغازية. على الرغم من أن هذا هو وسيلة فعالة لتقييم النشاط في الحجاب الحاجز المختبر، أنها تنطوي على عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة. تطبيق التصوير بالموجات فوق الصوتية غير الغازية باعتبارها الإجراء في الجسم الحي هو مفيد لأنه لا يقلل من عدد الحيوانات التضحية، ولكن هو أيضا مناسبة لرصد تطور المرض في الفئران الحية. وبالتالي، لدينا طريقة التصوير بالموجات فوق الصوتية قد يساعد على الأرجح في تطوير علاجات جديدة تخفف اصابة في العضلات الناجمة عن مختلف الأمراض التنفسية. ولا سيما، في التشخيصات السريرية لأمراض الرئة الانسدادي، والتصوير بالموجات فوق الصوتية لديه القدرة على استخدامها جنبا إلى جنب مع غيرها من الاختبارات القياسية للكشف عن الاصابة المبكرة من التعب في العضلات الحجاب الحاجز. في البروتوكول الحالي، نحن تصف كيفية تقييم بدقة الحجاب الحاجز contractility في نموذج الفأر باستخدام تقنية التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية.
Introduction
في الآونة الأخيرة، وقد تم تطبيق تقنيات التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية لنماذج الماوس من ارتفاع ضغط الدم الكلوية والبنكرياس 1،2 السرطان. ومع ذلك، لم تستخدم على نطاق واسع هذه التقنيات في القوارض الجهاز التنفسي وظيفة العضلات الفحص. لذلك، قمنا بتطوير طريقة التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية باعتبارها أداة قيمة لتقييم طولية في الجسم الحي من التنقل الحجاب الحاجز في الفئران.
وهناك العديد من المزايا لتصوير الموجات فوق الصوتية التشخيصية. على سبيل المثال، فمن موسع وآمنة، والمحمولة، ويسمح لقياس الوقت الحقيقي بتكلفة منخفضة نسبيا 3. بشكل خاص، وكانت قادرة على الكشف عن محاصرة الهواء، سمة السريرية لمرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) مع خفيفة الى الحد من تدفق الهواء الشديد 4 أجهزة معينة الموجات فوق الصوتية ذات التردد المنخفض. وبالتالي، التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية قد تكون بمثابة طريقة الفرز يمكن الوصول إليها بسهولة وقابلة للتكرار لرصد الوقت الحقيقي اضطرابات في الجهاز التنفسي.
يتم تطبيق تقنيات التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية في كثير من الأحيان إلى الحيوانات الكبيرة أو البشر. ومع ذلك، فقد كان هناك عدد محدود من الدراسات التصوير بالموجات فوق الصوتية على نماذج الماوس، والتي من المرجح نظرا للتحديات أداء الموجات فوق الصوتية على المواضيع نطاق صغير. يحدد البروتوكول الحالي إجراء رواية لقياس وظيفة الحجاب الحاجز في الماوس. بالإضافة إلى ذلك، وإن كانت هناك العديد من الدراسات القوارض على وظيفة الحجاب الحاجز، وقد تم توليد معظم النتائج من خلال عزل شرائح العضلات مباشرة من الحيوان الموت الرحيم 5-7. في المقابل، فإن التشخيص باستخدام طريقة التصوير بالموجات فوق الصوتية في الجسم الحي لتحليل النشاط الحجاب الحاجز تقليل ضحى عدد الحيوانات للتجريب. وعلاوة على ذلك، والعلاجات الطويلة الأمد التي تركز على تعزيز انقباض الحجاب الحاجز يمكن تقييمها بدقة عن طريق الموجات فوق الصوتية في نماذج القوارض دون التضحية الحيوانات.
ntent "> في مختبرنا، قمنا بتطوير وسيلة فعالة لتصور وكذلك تحليل الماوس النشاط الحجاب الحاجز باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية، مما يساعد على فهم وظيفة الحجاب الحاجز في الجسم الحي، ويتجنب أساليب الغازية للحيوانات، ويساعد في تطوير العلاجية علاجات لضعف الجهاز التنفسي.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات والانتهاء وفقا والامتثال والمؤسسية جنة رعاية الحيوان واستخدام جامعة ولاية أوهايو (IACUC) اللوائح والمبادئ التوجيهية.
1. ماوس التخدير
- إعداد جدول الإجراء نظيفة مع وسادة ساخنة متساوي ملفوفة في منشفة الجراحية. ينبغي الحفاظ على وسادة التدفئة ما بين 30 درجة مئوية و 34 درجة مئوية درجة الحرارة الأساسية لتحقيق الاستقرار الحيوان في حين خفض التوتر المحتملة للحيوان.
- ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير مع المعلمات التالية: معدل تدفق الأوكسجين تعيين إلى 1.5 لتر / دقيقة والمرذاذ isoflurane وتعيين إلى 3.5٪. التخدير الكامل يجب ان تتم في غضون 1-2 دقائق. إذا غرفة الاستقراء غير متوفرة، ويمكن استخدام جرة الجرس مع شبكة سلكية وضعه في أسفل لتجنب الاتصال المباشر مع الحيوانات isoflurane و.
- على الفور إزالة الماوس من غرفة الحث عليه مرة واحدةهو تخدير تماما (يتحقق عندما يفقد الماوس وظيفة الحركة الطوعية). تطبيق الأنف مخروط للحيوان لصيانة التخدير. ينبغي خفض معدل تدفق الأوكسجين إلى ما يقرب من 0.5 لتر / دقيقة ويجب تعيين المرذاذ isoflurane وداخل نطاق بين 1.5 و 2.5٪.
- تنطبق على كمية صغيرة من مرهم للعين مباشرة إلى القرنيات للحد من جفاف العين 8. بالإضافة إلى ذلك، أثناء التخدير، وينبغي الحفاظ على الماوس غياب منعكس دواسة الانسحاب، يجب أن تبقى الأغشية المخاطية لون وردي، ويجب أن تظهر التنفس مطرد.
2. التحضير لإجراء التشخيص بالموجات فوق الصوتية التصوير
- كبح جماح كل ساق من الماوس على الطاولة الإجراء ساخنة مع مادة لاصقة قابلة للإزالة، مثل الشريط الجراحية.
- باستخدام الحلاقة الكهربائية، وإزالة الشعر على سطح الجسم بطني بين الطريقة البطن ونصف يصل التجويف الصدري. تطبيق كريم إزالة الشعر لمزيد من إعادةنقل الشعر المتبقية التي لا يتم قطع أسلاك شائكة قبل. يمسح كريم مع شاش مبللة بعد 2-3 دقيقة.
- إزالة الشعر الزائد باستخدام شاش مبلل بالماء، وتنظيف المنطقة حليق مع الكحول 70٪ أو ما يعادلها مطهر. سيتم تطبيق مسبار الموجات فوق الصوتية لهذا المجال لتصور وظيفة الحجاب الحاجز. ويمكن توفير مسكن موضعي للحيوانات التي تعاني من تهيج الجلد الطفيفة بسبب إزالة الشعر.
3. التشخيص بروتوكول التصوير بالموجات فوق الصوتية
- بدوره على جهاز الموجات فوق الصوتية وضبط انتاج الطاقة (إذا لزم الأمر) على الجهاز عن طريق نسبة مئوية للحصول على الدقة المثلى.
- تعيين جهاز الموجات فوق الصوتية إما ب (السطوع) واسطة، M (الحركة) واسطة، أو كليهما قبل التصوير، والذي يسمح لتصور الصحيح للانكماش الحجاب الحاجز الماوس.
- تنطبق على كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية على البطن العلوي الماوس، وتدليك هلام نحو التجويف الصدري.
- وضع فائقةالصوت محول في هذا المجال وزاوية أنها التصاعدي نحو القلب. ضبط التحقيق حتى يتم تحقيق قرار الأمثل من الصورة. ملاحظة: لهذا البروتوكول، ومجموعة صغيرة محدبة أو خطية مراحل مجموعة المفاتيح هو التحقيق مثالية للاستخدام نظرا لحجم صغير والقرار المحوري ممتازة 9؛ التردد يحتاج إلى تعديل وعرض النطاق الترددي عبر عن هذه التجارب مجموعة من 6،5 حتي 12 ميغاهرتز يمكن الاستفادة منها.
- اضغط على زر التجميد مؤقتا لحفظ الصور الحجاب الحاجز وعرض تقلصات المحدد.
- حفظ التسجيل بمثابة حلقة سينمائية، والذي يسمح للقياسات في وقت لاحق من رحلة حجابي وكذلك معدل التنفس. ملاحظة: يمكن حفظ لقطة من الصور في ذاكرة الكمبيوتر أو على قرص صلب خارجي لتحليل المستقبل 9.
- على وجه التحديد قياس عمق حركة الحجاب الحاجز من الاسترخاء إلى الانكماش باستخدام الفرجار الالكترونية التي هي جزء من برنامج الموجات فوق الصوتية.
- تحويلحلقة سينمائية ملف إلى ملف MPEG وتحديد معدل التنفس عن طريق حساب عدد من تقلصات حجابي خلال فترة التسجيل. بدلا من ذلك، وعدد من تقلصات لكل دقيقة (معدل التنفس) قد تحسب من الصورة M-اسطة.
4. مشاركة التخدير استعادة الحيوان
- الماوس يجب استرداد تماما من التخدير في حدود 1 ساعة. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنها كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت صورة الموجات فوق الصوتية نموذجية من الحجاب الحاجز الماوس في الشكل 1A. وسجلت تشريد العمودي القصوى الماوس الحجاب الحاجز. تم حساب هذه المسافة عن طريق قياس بدقة عمق حركة الحجاب الحاجز من الاسترخاء إلى انكماش باستخدام الفرجار الالكترونية التي هي جزء من برنامج الموجات فوق الصوتية. الجدول 1 يعرض هذه القياسات مسافة تقلصات الحجاب الحاجز من ثلاثة الفئران مختلفة. بعد تحويل الملف حلقة سينمائية في ملف MPEG، تم تحديد معدل التنفس عن طريق حساب عدد من تقلصات حجابي خلال فترة التسجيل الثانية ستة. لا يمكن أن يؤديها هذا التحليل باستخدام B-واسطة. بدلا من ذلك، يوفر M-وضع تصور صورة من الحجاب الحاجز الحركة الرأسية وكذلك معدل التنفس كما هو مبين في الشكل 1B. تثبت هذه النتائج أن هذه الطريقة فعالة في مراقبة بدقة الماوس تقلصات الحجاب الحاجز. وعلاوة على ذلك، من خلال recordi نانوغرام وظيفة الحجاب الحاجز، وهذا البروتوكول يسمح أيضا لتقييم معلمتين هامة بما في ذلك رحلة الحجاب الحاجز ومعدل التنفس. هذا الأسلوب التصوير مفيد للمقارنة المباشرة بين السليمة والمريضة العضلات الحجاب الحاجز. ومع ذلك، يوضح الشكل (2) والتحف التصوير المحتملة التي قد تحدث عند تنفيذ التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية.
الشكل 1. ألف صورة الموجات فوق الصوتية ممثل غشاء العضلات الماوس (B-واسطة). الخطوط الصلبة وانطلق تصوير الحجاب الحاجز أثناء حالات التعاقد والاسترخاء، على التوالي. B. صورة بالموجات فوق الصوتية ممثل الحجاب الحاجز الماوس التعاقد (M-اسطة).خريج "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صورة الموجات فوق الصوتية من الماوس العضلات الحجاب الحاجز مع وجود صدى ممكن (A) وذيل المذنب (B) التحف (المشار إليها بواسطة الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 1 القياس شارع (ملم) | 2 القياس الثاني(مم) | 3 القياس الثالث (ملم) | متوسط (مم) ± SD | |
| الماوس 1 | 0.96 | 0.92 | 1.06 | 0.980 ± 0.072 |
| 2 الماوس | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977 ± 0.042 |
| الماوس 3 | 0.91 | 0.93 | 0.89 | 0.910 ± 0.020 |
قياسات الجدول 1. المسافة من حركة الحجاب الحاجز الماوس. الأغذية متوسطتم حساب وفاق من ثلاث قيم سجلت منفصلة لكل الماوس الفردية. ويعرف الانحراف المعياري كما SD. ملاحظة، التباين الحيوان ليس له تأثير كبير على قياس تقلصات الحجاب الحاجز (P = 0.1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول التجريبية الحالية تطور تقنيات التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية محددة للنشاط الحجاب الحاجز في نموذج الفأر من خلال ذلك، في الجسم الحي النهج غير الغازية. إعدادات جهاز التخدير هي قيم تقريبية، والتي قد يتم تعديلها بشكل طفيف لكل حيوان منذ الفئران الفردية قد تستجيب بشكل مختلف للتخدير. لمنع إدارة التخدير غير لائق، فمن المهم لمراقبة العلامات الحيوية بانتظام الماوس، بما في ذلك معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس، ودرجة حرارة الجسم. وعلاوة على ذلك، يجب إزالة الشعر قبل المسح بالموجات فوق الصوتية لأن الشعر غير محلوق قد طمس الصورة ومنع التصور الدقيق للتقلصات الحجاب الحاجز.
كنا B-وضع التصوير بالموجات فوق الصوتية لتوفير ثنائي الأبعاد (2D) صورة مقطعية من الحجاب الحاجز واستخدام الماوس M-وضع الحجاب الحاجز لرصد حركية الحركة. من المهم استخدام محول مجموعة صغيرة محدبة للصور 2D لأنه المواليةتحسين فيديس القرار المحوري الهياكل التشريحية يقع سطحيا بالمقارنة مع التقليدية محولات مجموعة خطية 10. من المهم أيضا أن نلاحظ أن التركيز الإلكترونية للصورة كما يحط البعد البؤري تم تمديده 9. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تطبق كمية كافية من هلام الموجات فوق الصوتية لالبطن الماوس، للحصول على صور متميزة. هلام يحد من إمكانية جيوب هوائية بين الجلد ومحول لإنتاج صورة عالية الدقة 11.
على الرغم من أن تطبيق التصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية واعدة، وهناك قيود على استخدام هذه التقنية كأداة للبحث. على سبيل المثال، فمن الأهمية بمكان أن المستخدم النهائي هو مدربين تدريبا جيدا في الحصول على صور دقيقة وقابلة للتكرار ويكون قادرا على تفسير النشاط الحجاب الحاجز باستمرار. علاوة على ذلك، تحدث التحف صورة طبق الأصل عندما يتم عرض بنية تشريحية واحدة، مثل الحجاب الحاجز، مرتين على الشاشة. هذا هو النظرإد قطعة أثرية نشر والنتائج في انعكاس غير صحيح كونها تقع ضمن نظام التشغيل 12،13 الموجات فوق الصوتية. على سبيل المثال، يمكن للمحولات الموجات فوق الصوتية تنتج العديد من الحزم خارج المحور الذي يمكن أن تعكس قبالة بنية التشريحية ليست في مسار من 12،14 الشعاع الرئيسي. وعلاوة على ذلك، وذلك بسبب الانكسار، وشعاع قد لا يسافر دائما في خط مستقيم من العاكس. منذ أن الموجات فوق الصوتية فقط معالجة الإشارة التي يتم إرجاعها إلى محول ولا يمكن تحديد توقيت الانكسار، قد رصد المرجح عرض نفس التركيب التشريحي مرتين على مسافات مختلفة، وبالتالي يحمل قطعة أثرية صورة طبق الأصل.
قطعة أثرية الانتشار الإضافية التي واجه هو صدى. يعرض هذا قطعة أثرية متباعدة بشكل متساو خطوط متوازية التي يتم وضعه عموما عموديا على شعاع الموجات فوق الصوتية (الشكل 2A) 15. هذا النوع من القطع الأثرية قد يعطل حقل الحقيقي للالرؤية وقناع هياكل تشريحية محددة من الفائدة. وبالتالي، ينبغي اتخاذ الحذر عند تحليل البيانات. مجموعة فرعية من صدى قطعة أثرية هو المذنب الذيل أو خطوط B. هذه هي نوع من القطع الأثرية التي تشكل صدى مسار الرأسي للأصداء الكثيفة، وتمتد من الحجاب الحاجز إلى حافة الشاشة الموجات فوق الصوتية 16 (كما هو موضح في الشكل 2B). ويتم إنتاج هذه الأعمال الفنية عن طريق انعكاسات متعددة التي تحدث بين أو داخل هيكل ومحول 13، والتي يمكن التقليل من الصيد محول لتجنب الاتصال متعامدة مع المرآة الأجسام 17. على الرغم من هذه القيود، والتصوير بالموجات فوق الصوتية التشخيصية يتيح تحليل آمنة وحساسة، وسريعة من وظيفة الحجاب الحاجز في نموذج الفأر، والذي يمكن أن يحتمل تقييم القوارض الحجاب الحاجز الخلل ويساعد على تطوير علاجات ما قبل السريرية رواية للاضطرابات في الجهاز التنفسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من المنح المقدمة من الصندوق العام وصندوق OU G110 التميز البحثي للبحوث الطبية الحيوية وجامعة ولاية أوهايو-HRS صندوق 013000. فإن الكتاب أود أن أشكر لورين تشن لمساعدتها في إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
