Summary
Echografie heeft bewezen effectief te diagnosticeren verschillende ademhalingsziekten bij menselijke en dierlijke patiënten zijn. We tonen een uitgebreide echo protocol gebruikt door Dr Zuo het lab tot middenrif kinetiek analyseren specifiek in muismodellen. Dit is een niet-invasieve onderzoekstechniek kwantitatieve gegevens over muis respiratoire spierfunctie kan bieden.
Abstract
Functie analyse van knaagdieren respiratoire skeletspieren, vooral het middenrif, wordt vaak uitgevoerd door het isoleren spierstrips middels invasieve chirurgische procedures. Hoewel dit een effectieve methode voor de beoordeling in vitro activiteit membraan, het gaat niet overleven chirurgie. De toepassing van niet-invasieve ultrasone beeldvorming als een in vivo methode is gunstig omdat het vermindert niet alleen het aantal dieren gedood, maar is ook geschikt voor het toezicht ziekteprogressie in levende muizen. Derhalve kunnen onze echografie methode waarschijnlijk helpen bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën die spierverwonding geïnduceerd door verschillende ademhalingsziekten verlichten. Vooral in klinische diagnose van obstructieve longziekten, echografie heeft het potentieel om te worden gebruikt in combinatie met andere standaard tests om de vroege fase van diafragma spiervermoeidheid detecteren. In het huidige protocol beschrijven we hoe je middenrif contracti nauwkeurig evaluerenteit in een muismodel met behulp van een echografie techniek.
Introduction
Onlangs hebben echografie technieken toegepast op muismodellen van renovasculaire hypertensie en alvleesklierkanker 1,2. Echter, deze technieken niet op grote schaal gebruikt in knaagdieren respiratoire spierfunctie assay. Daarom hebben we een echografie methode ontwikkeld als waardevol instrument voor in vivo evaluatie van longitudinale diafragma mobiliteit in muizen.
Er zijn verschillende voordelen aan echografie. Zo is invasief, veilig, draagbaar en maakt real time metingen tegen relatief lage kosten 3. Bijzonder bepaalde laagfrequente ultrasone inrichtingen konden lucht trapping, een klinisch kenmerk van chronische obstructieve longziekte (COPD) met milde tot ernstige luchtwegobstructie 4 sporen. Zo kan echografie als een gemakkelijk toegankelijke en reproduceerbare screening methode voor real-time monitoring dienen van respiratoire aandoeningen.
Echografie technieken worden vaak toegepast op grotere dieren of menselijke proefpersonen. Echter een beperkt aantal echografie studies muismodellen, die waarschijnlijk te wijten aan de uitdaging van het uitvoeren van ultrageluid op kleine schaal onderwerpen zijn. Het huidige protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het meten diafragmafunctie in de muis. Bovendien, hoewel er meerdere knaagdieren studies over diafragmafunctie geweest, de meeste resultaten werden gegenereerd door het isoleren spierstrips rechtstreeks van de dieren geëuthanaseerd 5-7. Daarentegen toepassing van een in vivo diagnostische ultrasonografie werkwijze voor het analyseren membraan activiteit zou verminderen het aantal dieren opgeofferd voor experimenten. Bovendien, langdurige behandelingen gericht op het verbeteren membraan contractiliteit kan nauwkeurig worden via echografie in knaagdier modellen beoordeeld zonder offeren van dieren.
ntent "> In ons laboratorium hebben we een effectieve methode ontwikkeld voor het visualiseren en analyseren muis diafragma activiteit met een ultrasone machine, die het begrip van diafragmafunctie in vivo helpt vermijdt invasieve dieren en helpt bij de ontwikkeling van therapeutische behandelingen voor respiratoire dysfunctie.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij proefdieren werden goedgekeurd en in overeenstemming en de naleving van de Ohio State University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) voorschriften en richtlijnen voltooid.
1. Mouse Anesthesie
- Het opzetten van een schone procedure tafel met een verwarmde isothermische pad gewikkeld in een chirurgische handdoek. De verwarming pad moet worden gehandhaafd tussen 30 ° C en 34 ° C tot een kerntemperatuur van het dier te stabiliseren terwijl het verminderen van de potentiële belasting van het dier.
- Plaats de muis per anesthesie inductie kamer met de volgende parameters: zuurstof stroomsnelheid ingesteld op 1,5 L / min en isofluraan vaporizer ingesteld op 3,5%. Compleet sedatie dient plaats te vinden binnen 1-2 minuten. Als een inductie kamer niet beschikbaar is, kan een stolp worden gebruikt met een gaas geplaatst aan de onderkant om direct contact dier met de isofluraan vermijden.
- Verwijder direct de muis van de inductie kamer zodra hetis volledig verdoofd (bereikt wanneer de muis verliest vrijwillige motorische functie). Breng een neuskegel het dier voor het onderhoud van de anesthesie. De zuurstoftoevoer verlaagd worden tot ongeveer 0,5 L / min en de isofluraan vaporizer worden ingesteld binnen het bereik van 1,5 tot 2,5%.
- Breng een kleine hoeveelheid oogzalf rechtstreeks aan de hoornvliezen te droge ogen 8 verminderen. Bovendien, tijdens de anesthesie, de muis moet een afwezigheid van het pedaal terugtrekking reflex te houden, moet de slijmvliezen een roze kleur te blijven, en de ademhaling moet gelijkmatig worden weergegeven.
2. Voorbereidingen voor Diagnostic Ultrasound Imaging Procedure
- Beperk elk been van de muis in de verwarmde procedure tafel met een verwijderbare kleefstof, zoals chirurgische tape.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, verwijdert het haar op het ventrale lichaamsoppervlak tussen de buik en halverwege de borstholte. Solliciteer ontharingscrème van bijkomende reverplaats de resterende haar dat niet wordt doorsneden door het scheermes. Veeg de crème met een vochtig gaasje na 2-3 minuten.
- Verwijder het overtollige haren met behulp van een met water bevochtigd gaasje en reinig de geschoren regio met 70% alcohol of gelijkwaardig antiseptische. De ultrasone sonde wordt toegepast op dit gebied diafragmafunctie visualiseren. Een actueel pijnstillend kan worden verleend voor dieren ervaren van lichte huidirritatie als gevolg van ontharing.
3. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol
- Zet het ultrasone apparaat en stel het uitgangsvermogen (indien nodig) op het apparaat door percentage optimale resolutie te verkrijgen.
- Stel de ultrasone machine of B (helderheid)-modus, M (motion)-modus, of zowel voor beeldvorming, die zorgt voor een goede visualisatie van de muis membraan contractie.
- Breng een kleine hoeveelheid gel op echografie bovenbuik van de muis en masseer de gel in de richting van de borstholte.
- Plaats de ultraklinken transducer op dit gebied en de hoek het omhoog naar het hart. Stel de sonde tot een geoptimaliseerde resolutie van het beeld wordt bereikt. Opmerking: voor dit protocol, een micro-array of convexe lineaire phased array transducer ideaal sonde te gebruiken vanwege de kleine footprint en uitstekende axiale resolutie 9; de frequentie moet over de bandbreedte in te stellen en voor deze experimenten een reeks 6,5-12 MHz worden gebruikt.
- Druk op de FREEZE-knop om het diafragma beelden tijdelijk op te slaan en bekijk de geselecteerde samentrekkingen.
- Sla de opname als een cine lus, die het mogelijk maakt voor latere metingen van het middenrif excursie en ademfrequentie. Opmerking: frames van afbeeldingen kunnen worden opgeslagen in het geheugen van de computer of op een externe harde schijf voor toekomstige analyse 9.
- Juist meten van de diepte van membraan beweging van ontspanning krimp met de elektronische passer die deel uitmaken van de ultrasone software.
- Zetten decine lus bestand in een MPEG-bestand en bepaal de ademhalingsfrequentie door het tellen van het aantal samentrekkingen van het middenrif tijdens de opnameperiode. Als alternatief kan het aantal contracties per min (ademfrequentie) worden geteld vanaf het imago van de M-modus.
4. Bericht Anesthesie Animal Recovery
- De muis moet volledig herstellen van anesthesie binnen 1 uur. Heeft het dier niet onbeheerd verlaten totdat het voldoende weer bij bewustzijn is om borstligging handhaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch ultrasoon beeld van een muis membraan is weergegeven in figuur 1A. De muis membraan maximale verticale verplaatsing opgenomen. Deze afstand werd berekend door nauwkeurig de diepte van membraan beweging meten van relaxatie samentrekking met de elektronische passer die deel uitmaken van de ultrasone software. Tabel 1 toont deze afstandsmetingen van middenrif contracties uit drie verschillende muizen. Na het omzetten van de cine lus bestand in een MPEG-bestand, werd de ademhalingsfrequentie bepaald door het tellen van het aantal samentrekkingen van het middenrif tijdens een zes tweede opnameperiode. Deze analyse kan worden uitgevoerd met B-mode. Alternatief M-modus levert een zichtbaar beeld van membraan verticale beweging en ademhaling zoals weergegeven in figuur 1B. Deze resultaten tonen aan dat deze werkwijze effectief nauwkeurig te observeren muis membraan contracties. Bovendien, door het recordi ng diafragmafunctie, dit protocol maakt het ook voor de evaluatie van twee belangrijke parameters met inbegrip van diafragma excursie en ademfrequentie. Deze beeldvorming methode is handig voor directe vergelijking tussen gezonde en zieke middenrif spier. Echter, Figuur 2 toont het vermogen beeldvormingsartefacten die kunnen optreden bij het uitvoeren van echografie.
Figuur 1. A. Een vertegenwoordiger echografie beeld van een muis diafragmaspier (B-mode). De solide en onderbroken lijnen verbeelden het middenrif tijdens gecontracteerd en ontspannen staten, respectievelijk. B. Een vertegenwoordiger echografie beeld van een aanbestedende muis membraan (M-stand).pg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Een echografie beeld van de muis diafragmaspier met de aanwezigheid van mogelijke galm (A) en komeet-staart (B) artefacten (aangeduid door de pijlen) figuur 2.. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| 1e meting (mm) | 2e meting(Mm) | 3e meting (mm) | Gemiddeld (mm) ± SD | |
| Muis 1 | 0.96 | 0,92 | 1.06 | 0.980 ± 0.072 |
| Muis 2 | 0.93 | 0.99 | 1.01 | 0.977 ± 0.042 |
| Mouse 3 | 0,91 | 0.93 | 0,89 | 0.910 ± 0.020 |
Tabel 1. Afstand metingen van de muis middenrif beweging. Averages werden berekend uit drie afzonderlijke geregistreerde waarden voor elke muis. Standaarddeviatie wordt gedefinieerd als SD. Let op, dier variantie heeft geen significant effect op de meting van membraan contracties (P = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige experimentele protocol ontwikkelt echografie techniek voor het membraan activiteit in een muismodel via een niet-invasieve, in vivo benadering. De verdoving instellingen apparaat zijn benaderd waarden, die enigszins kan worden aangepast voor elk dier sinds individuele muizen verschillend kunnen reageren op de anesthesie. Om oneigenlijk anesthesietoediening voorkomen, is het belangrijk de muis vitale functies zoals de hartslag, ademhaling en lichaamstemperatuur regelmatig controleren. Bovendien moet haar voorafgaand aan echoscopie worden verwijderd omdat ongeschoren haar de opname er wazig en voorkomen nauwkeurige visualisatie van het membraan weeën.
We gebruikten B-mode ultrasonografie om een tweedimensionaal (2D) voorzien dwarsdoorsnede afbeelding van de muis membraan en gebruikt M-modus membraan beweging kinetiek volgen. Het is belangrijk om een micro-convexe serie omzetter voor 2D afbeeldingen omdat het provides verbeterde axiale resolutie van oppervlakkig gelegen anatomische structuren in vergelijking met traditionele lineaire array transducers 10. Het is ook belangrijk op te merken dat de elektronische focussering van het beeld degradeert als de brandpuntsafstand wordt verlengd 9. Bovendien moet een voldoende hoeveelheid ultrasone gel worden aangebracht op de buik van de muis voor het verwerven van afzonderlijke beelden. De gel beperkt de mogelijkheid van luchtzakken tussen de huid en de transducer om een hoge resolutie afbeelding 11 te produceren.
Hoewel de toepassing van echografie is veelbelovend, er zijn beperkingen aan het gebruik van deze techniek als een research tool. Zo is het essentieel dat de eindgebruiker goed getraind in het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare beelden en kan membraan activiteit consistent interpreteren. Bovendien spiegelbeeld artefacten optreden wanneer een anatomische structuur, zoals het membraan tweemaal wordt weergegeven op de monitor. Dit is te overwegened een vermeerdering artefact en de resultaten in de reflectie ten onrechte zich binnen het ultrasone besturingssysteem 12,13. Zo kunnen ultrasone transducers verschillende off-axis bundels die gereflecteerd een anatomische structuur die niet in het pad van de hoofdbundel 12,14 produceren. Bovendien, als gevolg van breking, de lichtbundel kan niet altijd in een rechte lijn van de reflector. Aangezien het ultrasone alleen het signaal dat wordt teruggestuurd naar de transducer kan verwerken en kan de timing van de breking niet bepalen de monitor waarschijnlijk dezelfde anatomische structuur tweemaal weergegeven op verschillende afstanden en vertonen dus een spiegelbeeld artefact.
Een extra propagatie artefact dat wordt aangetroffen is galm. Dit artefact weergeven gelijkmatig evenwijdige lijnen die in hoofdzaak loodrecht staan op de ultrasone bundel (Figuur 2A) 15. Dit type artefact kan een echte gebied verstorenvisie en masker specifieke anatomische structuren van belang. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het analyseren van de gegevens. Een subset van galm artefact is de komeet-staart of B-lijnen. Dit zijn een soort galm artefact dat een verticale baan van dichte echo vormt, zich vanaf het membraan naar de rand van de ultrasone scherm 16 (zie figuur 2B). Deze artefacten worden geproduceerd door meervoudige reflecties die plaatsvinden tussen of binnen een structuur en de transducent 13, die kan worden geminimaliseerd door hengelen de transducer een loodrechte contact met het spiegelende objecten 17 te voorkomen. Ondanks deze beperkingen, echografie zorgt voor een veilige, gevoelige en snelle analyse van diafragma functie bij een muismodel, die mogelijk knaagdier diafragma disfunctie kan evalueren en helpen nieuwe pre-klinische therapieën voor aandoeningen aan de luchtwegen te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de OU Algemeen Fonds G110 en Research Excellence Fund van biomedisch onderzoek en OSU-HRS Fonds 013.000. De auteurs willen graag Lauren Chen bedanken voor haar hulp bij de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
