Summary
Diagnostiske ultralydundersøkelser har vist seg å være effektive i å diagnostisere ulike luftveissykdommer hos mennesker og dyr. Vi viser en omfattende ultralyd protokollen benyttes av Dr. Zuo laboratorium for å analysere membrankinetikk spesielt i musemodeller. Dette er også en ikke-invasiv teknikk for forskning som kan gi kvantitativ informasjon om mus respiratorisk muskelfunksjon.
Abstract
Funksjonsanalyse av gnager respiratoriske skjelettmuskulatur, særlig mellomgulvet, som vanligvis utføres ved å isolere muskelstrimler ved hjelp av invasive kirurgiske prosedyrer. Selv om dette er en effektiv metode for å vurdere in vitro membranaktivitet, omfatter det ikke-overlevelse kirurgi. Anvendelsen av ikke-invasiv ultralydavbildning som en in vivo fremgangsmåte er fordelaktig siden det ikke bare reduserer antallet av dyr avlivet, men er også egnet for å overvåke sykdomsprogresjon hos levende mus. Dermed kan vår ultralyd avbildningsmetode sannsynlig bistå i utviklingen av nye behandlingsformer som lindre muskel skader forårsaket av ulike luftveissykdommer. Spesielt, i kliniske diagnoser av obstruktive lungesykdommer, har ultralydavbildning potensiale til å bli brukt i forbindelse med andre standardtester for å påvise tidlig innsettende diafragma muskeltretthet. I dagens protokollen beskriver vi hvordan du vurdere nøyaktig membran contractiheten i en musemodell ved hjelp av en diagnostisk ultralyd avbildningsteknikk.
Introduction
Nylig har diagnostiske ultralyd imaging teknikker blitt brukt til musemodeller av renovaskulær hypertensjon og kreft i bukspyttkjertelen 1,2. Imidlertid er disse teknikker ikke har blitt mye brukt i gnager respiratorisk muskelfunksjon assay. Derfor har vi utviklet en diagnostisk ultralyd avbildningsmetode som et verdifullt verktøy for in vivo langsgående vurderinger av membran mobilitet i mus.
Det er flere fordeler med å diagnostisk ultralydavbildning. For eksempel er det ikke-invasiv, safe, bærbar, og gir mulighet for sanntidsmålinger på en relativt lav kostnad tre. Spesielt er visse lavfrekvente ultralydapparater ble stand til å oppdage luft fangst, en klinisk karakteristisk for kronisk obstruktiv lungesykdom (COPD) med mild til alvorlig luftveisobstruksjon 4.. Dermed kan diagnostisk ultralydavbildning tjene som en lett tilgjengelig og reproduserbar screeningmetode for sanntids overvåking av respirasjonsproblemer.
Diagnostiske ultralyd imaging teknikker er ofte brukt til større dyr eller mennesker. Men det har vært et begrenset antall ultralyd imaging studier på musemodeller, noe som er sannsynlig på grunn av utfordringene i å utføre ultralyd på småskala fag. Den aktuelle protokoll beskriver en ny fremgangsmåte for måling av membranfunksjonen hos mus. I tillegg, selv om det har vært flere gnagere på membran-funksjon, de fleste av de resultater ble generert ved å isolere muskelstrimler direkte fra avlives dyret 5-7. I motsetning til dette vil ved bruk av en in vivo diagnostisk ultralydavbildning metode for analyse av membranaktivitet redusere antall dyrene avlivet for eksperimentering. Videre kan langsiktige behandlinger fokusert på å styrke membran kontraktilitet være nøyaktig vurderes via ultralyd i gnager modeller uten å ofre dyr.
ntent "> I vårt laboratorium, har vi utviklet en effektiv metode for å visualisere samt analysere mus membran aktivitet ved hjelp av en ultralyd-maskin, noe som bidrar til forståelsen av membran funksjon in vivo, unngår invasive metoder til dyr, og hjelpemidler i utviklingen av terapeutisk behandlinger for luft dysfunksjon.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr fag ble godkjent og gjennomført i samsvar og overholdelse av The Ohio State University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) forskrifter og retningslinjer.
En. Mouse Anesthesia
- Sett opp en ren prosedyre bord med et oppvarmet isoterm pad innpakket i en kirurgisk håndkle. Den varmeputen skal opprettholdes mellom 30 ° C og 34 ° C for å stabilisere dyret kjernetemperatur og samtidig redusere potensiell stress til dyret.
- Plasser mus i en anestesi-induksjon kammer med de følgende parametere: oksygenstrømningshastighet innstilt til 1,5 l / min, og isofluran fordamper satt til 3,5%. Komplett sedasjon bør skje innen 1-2 min. Dersom en induksjonskammeret ikke er tilgjengelig, kan en glassklokke brukes med en netting plassert på bunnen for å unngå direkte kontakt med dyre isofluran.
- Umiddelbart fjerne musen fra induksjonskammeret når deter helt bedøvet (oppnås når musen mister frivillig motorisk funksjon). Påfør en nese-konus til dyret for opprettholdelse av anestesi. Den oksygenstrømningshastigheten skulle bli redusert til ca 0,5 l / min, og isofluran fordamperen skal være satt i området fra 1,5 til 2,5%.
- Påfør en liten mengde av ophthalmica salve direkte til hornhinner å redusere øye tørrhet åtte. I tillegg, under bedøvelse, bør mus opprettholde et fravær av pedalen tilbaketrekking refleksen skal slimhinnene forbli en rosa farge, og puste skal vises jevn.
2. Forberedelse til Diagnostic Ultrasound Imaging Prosedyre
- Beherske hver etappe av musen på den oppvarmede prosedyre bordet med en flyttbar lim, slik som kirurgisk tape.
- Ved hjelp av en elektrisk barberhøvel, fjerne håret på ventral kroppsoverflate mellom magen og halvveis opp brysthula. Påfør hårfjerning krem til ytterligere rebevege den gjenværende hår som ikke er kuttet av høvelen. Tørk av kremen med en fuktig kompress etter 2-3 min.
- Fjern overflødig hår ved hjelp av en fuktig kompress og rengjør barbert regionen med 70% alkohol eller tilsvarende antiseptisk. Den ultralyd-probe blir anvendt på dette området for å visualisere membranfunksjonen. En aktuell smertestillende kan gis til dyr som opplever mindre hudirritasjon på grunn av hårfjerning.
Tre. Diagnostic Ultrasound Imaging Protocol
- Slå på ultralydenheten og justere utgangseffekten (om nødvendig) på anordningen prosentvis for å oppnå en optimal oppløsning.
- Sett ultralyd maskinen til enten B (lysstyrke)-modus, M (bevegelse)-modus, eller både før bildebehandling, noe som gjør det mulig for riktig visualisering av musen gulvet sammentrekning.
- Påfør en liten mengde av ultralyd gel på musens øvre del av magen og massere gelen mot brysthulen.
- Plasser den superlydomsetteren i dette området, og vinkle den oppover mot hjertet. Juster sonden inntil en optimal oppløsning av bildet oppnås. Merk: for denne protokollen, er en mikro-konveks matrise eller lineær faset array svinger en ideell probe å bruke på grunn av liten plass og utmerket aksial oppløsning 9; frekvensen må justeres på tvers av båndbredden, og for disse eksperimentene en rekke 6,5 til 12 MHz kan benyttes.
- Trykk på fryse-knappen for å midlertidig lagre membran bilder og vise de valgte sammentrekninger.
- Lagre opptaket som en cine loop, som gjør det mulig for senere målinger av magen ekskursjon samt pusterytme. Merk: rammer av bilder kan lagres i datamaskinens minne eller på en ekstern harddisk for fremtidig analyse 9.
- Nettopp måle dybden i diafragmabevegelse fra avslapning til sammentrekning ved hjelp av elektroniske målepunktene som er en del av ultralyd programvare.
- Konvertercine sløyfe-fil til en MPEG-fil og bestemme respirasjonsfrekvensen ved å telle antall mellomgulvs sammentrekninger i opptaksperioden. Alternativt kan antallet kontraksjoner pr min (respirasjonsfrekvens) telles fra M-modus bilde.
4. Post Anesthesia Animal Recovery
- Musen bør helt gjenopprette fra anestesi innen en time. Ikke la dyret uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk ultralyd-bilde av en musemembran er vist i Figur 1A. Musen membran maksimal vertikal forskyvning ble spilt inn. Denne avstanden ble beregnet ved nettopp å måle dybden av diafragmabevegelse fra avslapning til sammentrekning ved hjelp av de elektroniske målepunktene som er en del av ultralyd programvare. Tabell 1 viser disse avstandsmålinger av mellomgulvs sammentrekninger fra tre forskjellige mus. Etter konvertering cine sløyfe-fil til en MPEG-fil, ble respirasjonsfrekvensen bestemmes ved å telle antall mellomgulvs sammentrekninger i løpet av en seks andre opptaksperiode. Denne analyse kan utføres ved hjelp av B-modus. Alternativt gir M-modus et visualisert bilde av membranen vertikal bevegelse samt respirasjonsfrekvens som vist i figur 1B. Disse resultater viser at denne metoden er effektiv i nøyaktig observere mus membran sammentrekninger. Videre, ved recordi ng membran funksjon, gjør at denne protokollen også for å vurdere to viktige parametere inkludert membran utflukt og respirasjonsfrekvens. Denne avbildningsmetoden er nyttig for direkte sammenligning mellom friske og syke membran muskel. Men Figur 2 viser de potensielle bildebehandling gjenstander som kan oppstå når du utfører diagnostisk ultralydavbildning.
Figur 1. A. En representant ultralyd bilde av en mus diafragma muskelen (B-mode). Den solide og stiplede linjer skildre mellomgulvet under kontrakt og avslappet stater, henholdsvis. B. En representant ultralydbilde av et entreprenør mus membran (M-modus).pg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Et ultralydbilde av mus diafragma muskelen med tilstedeværelse av mulig etterklang (A) og komet-hale (B) artefakter (angitt med piler). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 1 st måling (mm) | 2 nd måling(Mm) | 3. måling (mm) | Gjennomsnitt (mm) ± SD | |
| Mus 1 | 0,96 | 0,92 | 1,06 | 0.980 ± 0.072 |
| Mouse 2 | 0,93 | 0,99 | 1,01 | 0.977 ± 0.042 |
| Mus 3 | 0,91 | 0,93 | 0,89 | 0,910 ± 0,020 |
Tabell 1. Avstand målinger av muse diafragmabevegelse. Midlerees ble beregnet ut fra tre separate registrerte verdier for hver enkelt mus. Standardavvik er definert som SD. Obs, dyr varians har ingen signifikant effekt på måling av membran sammentrekninger (p = 0,1224).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuelle forsøksprotokoll utvikler diagnostiske ultralydavbildningsteknikker som er spesifikke for membranaktivitet i en musemodell via en ikke-invasiv, in vivo tilnærming. Anestesi apparater innstillingene er tilnærma verdier, noe som kan bli noe justert for hvert dyr, siden enkelte mus kan reagere forskjellig på anestesi. For å forhindre feilaktig anestesi administrasjon, er det viktig å jevnlig overvåke muse vitale tegn inkludert hjertefrekvens, pustefrekvens, og kroppstemperatur. Videre må håret fjernes før ultralydundersøkelse fordi ubarbert hår kan dimme bildet og hindre nøyaktig visualisering av membran sammentrekninger.
Vi brukte B-mode ultralyd for å tilveiebringe en to-dimensjonal (2D) tverrsnittsbilde av musemembran og brukt M-modus for å overvåke membranfilm kinetikk. Det er viktig å bruke en mikro-konveks rekke svinger for 2D-bilder fordi det provides forbedret aksial oppløsning på overfladisk plassert anatomiske strukturer i forhold til tradisjonelle lineære array-transdusere 10. Det er også viktig å merke seg at elektronisk fokusering av det bilde som forringer brennvidden er utvidet 9.. I tillegg bør en tilstrekkelig mengde av en gel påføres musens abdomen for å skaffe forskjellige bilder. Gelen begrenser muligheten for luftlommer mellom huden og transduseren for å produsere et bilde med høy oppløsning 11.
Selv om anvendelsen av diagnostiske ultralydundersøkelser er lovende, er det begrensninger i å bruke denne teknikken som et analyseverktøy. For eksempel er det viktig at sluttbrukeren er godt trent i å skaffe nøyaktige og reproduserbare bilder og er i stand til å tolke membran aktivitet konsekvent. Videre speilbilde gjenstander forekommer når en anatomisk struktur, slik som membranen, vises to ganger på monitoren. Dette er ansered en forplantnings gjenstand og resulterer i refleksjon blir feilaktig plassert innenfor ultralyd operativsystemet 12,13. For eksempel kan ultralydtransdusere produsere flere off-axis bjelker som kan reflektere av en anatomisk struktur som ikke er i veien for fjernlys 12,14. Dessuten, på grunn av brytning, strålen kan ikke alltid bevege seg i en rett linje fra reflektoren. Siden ultralyd kan bare behandle signalet som returneres til transduseren og kan ikke bestemme tidspunktet for brytning, kan monitoren sannsynlig viser den samme anatomiske strukturen to ganger i forskjellige avstander og således oppviser et speilbilde gjenstand.
En ekstra forplantning artefakt som er oppstått er etterklang. Dette artefakt viser jevnt fordelt parallelle linjer som er generelt plassert vinkelrett på ultralydstrålen (Figur 2A) 15. Denne type gjenstand kan forstyrre en sann feltvisjon og maske spesifikke anatomiske strukturer av interesse. Derfor bør man vise forsiktighet når analysere dataene. En undergruppe av etterklang artefakt er kometen-tail eller B-linjer. Dette er en type av etterklangs gjenstand som danner en vertikal bane av tett ekkoer, som strekker seg fra membranen til kanten av ultralyd-skjermen 16 (som illustrert i figur 2B). Disse gjenstander er fremstilt av multiple refleksjoner som oppstår mellom eller innenfor en struktur og transduktoren 13, som kan bli minimalisert ved å vinkle transduktoren for å unngå en perpendikulær kontakt med den speilende objekter 17.. Til tross for disse begrensningene, gir diagnostisk ultralydavbildning en trygg, sensitiv og rask analyse av membran funksjon i en musemodell, noe som potensielt kan vurdere gnager membran dysfunksjon og bidra til å utvikle nye pre-kliniske behandlingsformer for luftveislidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet med tilskudd av OU Generelt Fund G110 og forsknings Excellence Fund of Biomedical Research og OSU-HRS Fund 013000. Forfatterne ønsker å takke Lauren Chen for hennes hjelp i å forberede dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Veterinary digital ultrasonic diagnostic imaging system | Edan | DUS 3 VET | Ultrasound parameters include: frequency of 6.5 MHz, Depth of 29 mm. Note: An equivalent ultrasound machine may be used for this protocol |
| Micro-convex array transducer | Edan | C611 | Or equivalent |
| GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | GE Healthcare | GE Logiq i hand-carried unit (HCU) | Or equivalent |
| GE 12 MHz linear array probe | GE Healthcare | 12L-RS | Or equivalent |
| Veterinary anesthetic vaporizer | Webster Veterinary | Serial #: W422021 | Isoflurane was exclusively used with this vaporizer (or equivalent). A custom made induction chamber for anesthesia was assembled for initial anesthesia. Maintenance anesthesia was performed using a nose cone |
| Isothesia (Isoflurane, USP) | Butler Schein | 29405 250ML PVL | Or equivalent |
| Enviro-pure anesthesia absorbing canister | Surgivet Smiths Medical PM, Inc. | Part #: 32373B10 | Or equivalent |
| Ultrasound transmission gel | HM Sonic | N/A | Or equivalent |
| Puralube vet ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | Or equivalent |
| Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific Inc. | 39DP | Or equivalent |
| Hair remover | Nair | N/A | Or equivalent |
| Electric razor | Remington | HC-5015 | Or equivalent |
| Surgical tape | 3M Micropore | 1530-1 | Or equivalent |
| Gauze sponges | Dynarex | 3262 | Or equivalent |
References
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Franchi, F., et al. Non-invasive assessment of cardiac function in a mouse model of renovascular hypertension. Hypertension Research: Official Journal of the Japanese Society of Hypertension. , (2013).
- Coatney, R. W. Ultrasound imaging: principles and applications in rodent research. ILAR Journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 42, 233-247 (2001).
- Morenz, K., et al. Detection of air trapping in chronic obstructive pulmonary disease by low frequency ultrasound. BMC Pulmonary Medicine. 12, 8 (2012).
- Gilliam, L. A., Moylan, J. S., Ann Callahan, L., Sumandea, M. P., Reid, M. B. Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy. Muscle & Nerve. 43, 94-102 (2011).
- Ferreira, L. F., Campbell, K. S., Reid, M. B. Effectiveness of sulfur-containing antioxidants in delaying skeletal muscle fatigue. Medicine and Science in Sports and Exercise. 43, 1025-1031 (2011).
- Zuo, L., Clanton, T. L. Reactive oxygen species formation in the transition to hypoxia in skeletal muscle. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 289, 207-216 (2005).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J. Vis. Exp. , (2010).
- Hedrick, W. R., Hykes, D. L., Starchman, D. E. Ultrasound Physics and Instrumentation. , 4th edn, Elsevier Mosby. 445 (2005).
- von Sarnowski, B., Khaw, A. V., Kessler, C., Schminke, U. Evaluation of a microconvex array transducer for the ultrasonographic examination of the intrathoracic segments of the supraaortic arteries. Journal of Neuroimaging: Official Journal of the American Society of Neuroimaging. 20, 246-250 (2010).
- Stocksley, M. Abdominal Ultrasound. , Cambridge University Press. 7-8 (2001).
- Kremkau, F. W., Taylor, K. J. Artifacts in ultrasound imaging. Journal of Ultrasound in Medicine: Official Journal of the American Institute of Ultrasound in Medicine. 5, 227-237 (1986).
- Kremkau, F. W. Diagnostic Ultrasound: Principles and Instruments. Saunders Elsevier. , 7th edn, 521 (2006).
- Laing, F. C., Kurtz, A. B. The importance of ultrasonic side-lobe artifacts. Radiology. 145, 763-768 (1982).
- Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. 4, 501-503 (2011).
- Gargani, L. Lung ultrasound: a new tool for the cardiologist. Cardiovascular Ultrasound. 9, 6 (2011).
- Sanders, R. C., Winter, T. Clinical Sonography A Practical Guide. , 4th edn, Lippincott Williams & Wilkins. 632 (2007).
