Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ekspression, isolation og oprensning af opløselige og uopløselige Biotinylerede Proteiner til nervevæv Regeneration

Published: January 22, 2014 doi: 10.3791/51295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

Summary

Udvikling biotinylatable fusionsproteiner har mange potentielle anvendelsesmuligheder på forskellige forskningsområder. Rekombinant protein engineering er en ligetil procedure, der er omkostningseffektiv, der giver høje udbytter af specialdesignede proteiner.

Abstract

Rekombinant protein engineering har udnyttet Escherichia coli (E. coli) ekspressionssystemer til næsten 4 årtier, og i dag E. coli er stadig den mest anvendte værtsorganisme. Fleksibiliteten i systemet giver mulighed for tilføjelse af dele såsom en biotin tag (for streptavidin interaktioner) og større funktionelle proteiner som grønt fluorescerende protein eller kirsebærrød protein. Desuden er integrationen af ​​unaturlige aminosyrer, såsom metal-ion-chelatorer, entydigt reaktive funktionelle grupper, spektroskopiske prober og molekyler overfører posttranslationelle modifikationer aktiveret bedre manipulation af proteiners egenskaber og funktionaliteter. Som et resultat af denne teknik skaber tilpasses fusionsproteiner, der tilbyder betydelig nytte for forskellige forskningsområder. Mere specifikt har biotinylatable proteinsekvens blevet indarbejdet i mange målproteiner på grund af den høje affinitet interaktion mellem biotin med avidin og streptavidin. Denne tilføjelse har hjulpet med at forbedre påvisning og rensning af mærkede proteiner samt bane vejen for sekundære applikationer såsom celle sortering. Således biotinmærkede molekyler viser en stigende og udbredt indflydelse i bioindustrielle og biomedicinske områder. Med henblik på vores forskning, vi har udviklet rekombinante biotinyleret fusionsproteiner indeholdende nerve vækstfaktor (NGF) og semaphorin3A (Sema3A) funktionelle regioner. Vi har tidligere rapporteret, hvordan disse biotinylerede fusionsproteiner, sammen med andre aktive proteinsekvenser, kan tøjret til biomaterialer til vævsopbygning og regenerative formål. Denne protokol beskriver de grundlæggende teknik biotinylatable proteiner i milligram skala, udnytte en T7 lac inducerbare vektor og E. coli ekspressionsværter startende fra transformation opskaleringen og rensning.

Introduction

Proteiner dækker en bred vifte af biomolekyler, der er ansvarlige for mange biologiske funktioner, i sidste ende fører til en ordentlig væv dannelse og organisation. Disse molekyler indlede tusindvis af signalveje, der kontrollerer opregulering og / eller nedregulering af gener og andre proteiner, opretholde ligevægt i det menneskelige legeme. Forstyrrelse af et enkelt protein påvirker hele denne web af signaler, hvilket kan føre til udbrud af ødelæggende lidelser eller sygdomme. Engineering enkelte proteiner i laboratoriet tilbyder én løsning til at bekæmpe disse bivirkninger, og tilbyder et alternativ til små molekyle narkotika. I 1977 et gen, der koder for 14 aminosyrer somatostatin sekvens var en af de første manipuleret polypeptider oprettet ved hjælp af E. coli 1.. Snart efter i 1979 blev insulin klonet i plasmid pBR322, transformeres, udtrykt og renset 2. Siden da har rekombinante proteiner udvidet deres indflydelse til flere områder af research såsom biomaterialer, drug delivery, tissue engineering, biofarmaceutiske, landbrug, industrielle enzymer, biobrændstoffer, etc. (til anmeldelser se referencer 3-8). Dette skyldes i høj grad den alsidighed at teknikken tilbud via tilsætning af applikationsspecifikke kemiske dele eller proteinsekvenser til formål, herunder, men ikke begrænset til, målprotein identifikation, stabilisering og oprensning.

Via rekombinant DNA-teknologi, kan rekombinante proteiner udtrykkes i en række eukaryote og prokaryote værtssystemer, herunder pattedyr, plante-, insekt-, gær, svampe eller bakterier. Hver vært tilbyder forskellige fordele og typisk det bedste system bestemmes på basis af protein funktion, udbytte, stabilitet, samlede omkostninger og skalerbarhed. Bakterier celler mangler ofte de post-translationelle modifikation mekanismer, eukaryote værter give (dvs. glykosylering, disulfidbroer, e tc.) 5.. Som et resultat, pattedyr og insekter sædvanligvis resultere i bedre kompatibilitet og udtryk af eukaryote proteiner, men disse værter er typisk dyrere og tidskrævende 9. Derfor E. coli er den foretrukne vært for vores ekspressionssystem fordi cellerne ekspandere hurtigt i billige vækstbetingelser og de ​​genetiske ekspressionsmekanismer er godt forstået 5,9. Derudover er let at skalere op til produktionsformål og resultater i funktionelle proteiner trods manglen på post-translationelle modifikationer 10 dette system. E. coli K12 stammen er valgt i denne protokol til kloning, fordi denne stamme tilbyder fremragende plasmidudbytter baseret på høje transformationseffektiviteter. Derudover en E. coli BL21-stammen anvendes til ekspression, da denne værtsstamme indeholder T7-RNA-polymerase-genet, der giver kontrolleret proteinekspression og stabilitet 11.

telt "> Efter valget vært skal yderligere omhu vælge den ideelle ekspressionsvektor at lette udvalgt og kontrolleret protein udtryk. Synthesizing rekombinante proteiner begynder med en mål-DNA-sekvens, der er klonet under ledelse af transkription bakteriofag T7 og oversættelse signaler, og ekspression induceres i værtsceller indeholder kromosomale kopier af T7 RNA-polymerase gen 12. Disse vektorer, der stammer fra plasmid pBR322 (til gennemgang se reference 13), er stramt styret af T7-promotoren oprindeligt udviklet af Studier og kolleger 14 og give yderligere kontrol gennem inddragelse af lac-operator og lac-repressor (lac1) 15,16. Til rekombinant protein engineering, dette udtryk system giver mulighed for at skræddersy en specifik aminosyresekvens af et ønsket protein ved at indsætte forskellige mål-DNA-sekvenser eller for at skabe fusionsproteiner består af kombineret domænes fra enkelte proteiner. Derudover nogle vektor serien omfatter peptidmærke ændringer, der skal placeres på N eller C-terminalen. For vores design formål blev en histidin (His) tag tilsat til målsekvensen DNA for rensning og en 15 aminosyre biotinylatable sekvens blev inkluderet for biotinylering 17,18. I denne protokol et plasmid indeholdende et ampicillinresistensgen, blev valgt til at bære vores biotinylatable fusion protein sekvenser. Ekspression kontrolleres i denne vektor via T7 lac-promotoren og er let induceret med isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG).

Test udtryk (små kulturer) anvendes til at bestemme tilstedeværelsen og opløselighed af target protein, som kan udtrykkes i enten opløselig eller uopløselig form til at formulere oprensningsprocedurer. Et opløseligt protein udtrykt i bakterie celle vil gennemgå spontan foldning at bevare sin native struktur 19. Typisk den nativestruktur er termodynamisk gunstig. I mange tilfælde er den metaboliske aktivitet af værten er ikke befordrende for målproteinet, lagt vægt på systemet, der fører til uopløseligt protein produktion og dannelsen af ​​inklusionslegemer sammensat af uopløselige proteinaggregater. Således målproteinet denaturerer, hvilket gør dem generelt biologisk inaktivt 20. Begge test udtryk opskaleret og isoleringsprocedurer bestemmes af opløseligheden af ​​målproteinet. En yderligere renaturering eller refoldning trin er nødvendigt for uopløselige proteiner. De resulterende rekombinante proteiner kan oprenses yderligere under anvendelse af gelpermeationskromatografi.

I hus rekombinant protein produktion tilbyder omkostningseffektive fordele i forhold til kommercielle produkter, da milligram target protein kan isoleres per liter vigtigste kultur. Størstedelen af ​​det nødvendige udstyr er til rådighed i en typisk biologisk eller kemisk laboratorium. Protein engineering tillader skabelseaf brugerdefinerede fusionsproteiner tilsat funktionaliteter, som ikke altid er kommercielt tilgængelige. Figur 1 viser de vigtigste procedurer, der er involveret i teknik rekombinante proteiner. Med dette udtryk-system har vi skabt mange biotinylatable proteiner, såsom interferon-gamma, blodpladeafledt vækstfaktor, og knogle-morfogenetisk protein 21-23, men vi vil fokusere på to proteiner, som vi designet til Axon vejledning, NGF (29 kDa ) og Sema3A (91 kDa) 10 (for gennemgang se reference 24). Biotinylering er en almindelig teknik til identifikation, immobilisering og isolering af mærkede proteiner anvender den velkendte biotin-streptavidin-interaktion 25-27. Biofysiske sonder 28,29, biosensorer 30, og quantum dots 31 er nogle eksempler på systemer, der udnytter den høje affinitet af biotin-streptavidin konjugation med en Kd på størrelsesordenen 10 -15 M 27. E. coli biotin ligase BirA, hjælpemidler i kovalente binding af biotin til lysin-sidekæde findes inden for biotin mærkede sekvens 18,32. Tethering biotin til materialer og biomolekyler har produceret vedvarende levering af vækstfaktorer til celle for flere vævsdyrkningsapplikationer 21,33-35. Derfor ingeniør disse specialdesignede biotinylatable proteiner er et kraftfuldt værktøj, der kan transcendere flere forskning interesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Design af målprotein

  1. Brug af National Center for Biotechnology Information hjemmeside (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) opnå en amino sekvens for målproteinet under hensyntagen til arten af ​​interesse og eventuelle splejsningsvarianter. Vælg aminosyresekvensen, der svarer til det aktive område af interesse af proteinet.
    Bemærk: Sema3A blev aminosyrerne 21-747 valgt. Et fusionsprotein blev designet med NGF, hvor sekvensen af barstar, aminosyre 1-90, blev tilsat til NGF aminosyrerne 122-241.
  2. Til den N-terminale tilføje følgende sekvenser: 6X-His-tag til oprensning (hhhhhh), Tobak Etch Virus (TEV) protease kløvningspunkt til fjernelse af hans tag (ENLYFQG), biotin mærkede sekvens for biotinylering af protein ved K (GLNDIFEAQKIEWHE) og fleksibelt hængsel med huller, der vil give plads til en ordentlig protein foldning (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Bemærk: Disse sekvenser kan variere afhængigt af den ønskede fusion protein.
  3. Send hele aminosyresekvens til et selskab for gen design / optimering for ønskede værtsart og syntese. Subklone i en vektor af valg ved hjælp af BamHI-Notl-stedet under anvendelse af et kit eller ved at anvende kommercielle tjenester.

2. Making Agar Plates

Bemærk: Det er meget vigtigt, at alle lagre af antibiotika, plader, buffere mv opbevares korrekt (temperatur og varighed) og forbliver fri for proteaser (steriliseret).

  1. Afvejes ud agar på 1,5 vægt% og lysogeni bouillon (LB) på 20 g / L og sted i et glas medier flaske. En 500 ml flaske gør omkring 15 plader.
  2. Volumetrisk tilføje ultrarent vand, bland godt, og autoklave.
  3. Lad flasken cool at røre ved, og tilføj de relevante antibiotika. Undgå for tidlig størkning af agar, men hvis flaske køler for meget og løsning begynder at stivne, genopvarmning i mikrobølgeovn.
    Bemærk: Vores plasmid indeholder en ampicillinresistens gene. Derfor skal alle trin indeholde ampicillin ved 100 pg / ml. E. coli kloning K12 stamme kræver tetracyclin (12,5 ug / ml) antibiotikum. BL21 bakterieceller ikke kræver nogen yderligere antibiotika.
  4. Hæld 25-30 ml opløsning i 90 mm petriskåle og give tid til at tørre.
  5. Label fad med passende antibiotika og butik på hovedet i 4 ° C, med Parafilm eller i en genlukkelig pose.
    Bemærk: Plader er gode for omkring en måned.

3. Kloning af Biotin Tagged Plasmid

Bemærk: Betingelser er færdig aseptisk.

  1. Spin ned plasmidvektor ved 6.000 x g i 3 min for at pelletere, og der tilsættes 10 ul steriliseret ultrarent vand.
  2. Fjern 50 pi kemisk kompetente E. coli høj transformationseffektivitet celler fra -80 ° C og straks placere på is i 5-10 min.
  3. Tilsæt 1 pi vektor løsning på 0,5-1 ng/5056. L-celler til 50 gl E. coli-celler og placere den resterende plasmid i -80 ° C.
  4. Placer bakterieceller indeholdende vektoren på is i 5 min.
  5. Heat shock cellen og vektor-blanding i 30-45 sek i 42 ° C vandbad og placere celler tilbage på is i 2 min.
  6. Tilføj 250 pi super optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) medium (2% w / v Bacto-trypton, 0,5% w / v Bacto-gærekstrakt, 8,56 mM NaCI, 2,5 mM KCI, 20 mM MgSO4, 20 mM glucose , ultrarent vand, pH = 7,0) og rystes ved 250 rpm ved 37 ° C i 30 minutter.
    Bemærk: SOC bør ikke autoklaveres men være sterilfiltreret gennem et 0,22 um filter.
  7. Tør plader 10-15 min før udpladning celler.
  8. Pipetter 25, 50, og 100 pi af celle opløsningen på separate agarplader indeholdende ampicillin (100 ug / ml) og tetracyklin (12,5 ug / ml) antibiotika. Brug glasperler til at distribuere løsning jævnt over agar-plader.
    9. <li> Pladerne inkuberes på hovedet ved 37 ° C i 15-18 timer.
  9. Check for små individuelle bakteriekolonier på plader og gemme hovedet ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse (figur 2A).
    1. Hvis ingen kolonier er til stede:
      1. Kontroller friskhed og sterilitet buffere og forsyninger.
      2. Øge mængden af plasmid tilsat til E. E. coli K12-stamme.
    2. Hvis store kolonier er til stede, eller der er en overvækst af kolonier (figur 2B og 2C), restreak en ny agarplade ved hjælp af en steril podning loop eller plade celler ved lavere lydstyrke.
  10. Podes 5 ml LB indeholdende ampicillin (100 ug / ml) og tetracyklin (12,5 ug / ml) antibiotika med en enkelt koloni af transformeret E. coli-celler. Grow up celler natten over ved 37 ° C ved 250-300 rpm.
  11. Den følgende dag, anvender et plasmid isolation kit for at isolere målvektoren fra overnight Grow-og opbevare oprenset plasmid ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
    1. Valgfrit: Kontroller renheden og koncentrationen af plasmid hjælp absorbansaflæsning opnået ved 260 og 280 nm.

4.. Transformation af plasmid i ekspressionsvært

Bemærk: Betingelser er færdig aseptisk.

  1. Gentag trin 3,2-3,10 for E. coli BL21 celler med følgende ændringer:
    Bemærk: BL21 celler kræver ikke nogen yderligere antibiotika, derfor kun ampicillin tilsættes agarpladerne for transformation.
    1. Læg 2-5 ul isolerede plasmid på 0,5-2 ng/50 celler pi fra trin 3,12-50 pi E. coli ekspression værtsceller.
    2. Varmechok-celler til 60-90 sek.
    3. Ryst opløsning indeholdende SOC-medium ved 250 rpm i 60 minutter i stedet for 30 minutter.
  2. Plukke en enkelt koloni af transformerede bakterieceller fra petriskålen med en sterile applikatorpind og anbringes i et reagensglas indeholdende 5 ml LB-bouillon med den passende koncentration af ampicillin (100 ug / ml).
  3. Placer reagensglas shaker natten over ved 37 ° C ved 250 rpm.
  4. Den følgende morgen, tage 200 pi overnight vokse op og føje det til 5 ml LB indeholdende ampicillin på 100 mg / ml.
  5. Frys ned de resterende celler med 250 pi 50% glycerol (sterilt) til 750 ul kultur og holde i -80 ° C.
    Bemærk: Ny test udtryk og skala-up procedurer kan gøres ved hjælp af en steril applikator pind for at få en skrabning af frosne celler og pode LB med de relevante antibiotika.
  6. Placer reagensglasset i ryster ved 250-300 rpm ved 37 ° C, indtil den optiske densitet (OD) måles mellem 0,7-0,8 ved en absorbans på 600 nm.
  7. Inducere celler med IPTG i en slutkoncentration på 1 mM.
  8. Rystes i yderligere 4 timer ved 37 ° C ved 300 rpm. Alternativt celler kan ogsåblive rystet natten over ved 18 ° C ved 250-300 rpm. Dette kan give et højere udbytte af plasmid afhængigt af målproteinet.
  9. Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese gelelektroforese (SDS-PAGE) Analyse af testudtryk
    1. Tag 500 ul kultur og sted i en 1,5 ml rør. Spin ned på 13-15 xg i 5 min. Hæld supernatantvæske og mærke "Opløselig". Resuspender pellet med vortex i 200 pi lastning farvestof (50 ul 2-mercaptoethanol, 950 ul Laemmli prøve buffer).
      Bemærk: Opløselige bakterier pellets vil blive anvendt til at bestemme, om det rekombinante protein i de cytoplasmatiske regioner af bakteriecellerne. Pellets kan opbevares i -80 ° C uden at indlæse farvestof indtil brug. En kontrol bakteriekultur, der ikke er transformeret eller induceret kan behandles som opløselig samt til sammenligning.
    2. Tag 1.000 ul kultur og sted i en 1,5 ml rør. Spin ned på 13-15 xg i 5 min.Hæld supernatantvæske og mærke "uopløseligt".
      Bemærk: Uopløselige pellets vil undergå denaturering nedenstående procedurer for at frigøre proteiner, der findes i inklusionslegemer af bakterieceller. Pellets kan opbevares i -80 ° C indtil brug. En kontrol bakteriekultur, der ikke er transformeret eller induceret kan behandles som uopløselig såvel til sammenligning.
      1. Resuspender uopløselige pellet i 200 ul Bugbuster og henstår ved stuetemperatur i 30 minutter.
      2. Spin ned prøve igen ved 13-15 xg i 5 minutter og tage 50 pi supernatant og føje den til nye "uopløseligt" 1,5 ml rør.
      3. Derefter tilsættes 50 ul lastning farvestof til denne nye prøve.
    3. Kog både opløselige og uopløselige prøver til 5 min til denaturere proteiner til SDS-PAGE analyse.
    4. Load hver prøve i elektroforese gel med standard stige.
    5. For at visualisere protein prøver at bruge en staining reagens og følge virksomheden protokol.
    6. Bestem, om proteinet udtrykker i opløselige og / eller uopløselige fraktioner ved sammenligning af disse to baner samt sammenligning af baner for de opløselige og uopløselige kontrolbaner (se note 4.9.1 og 4.9.2) på SDS-PAGE-gel (figur 2). Et mørkt bånd skal vises omkring molekylvægten af ​​proteinet i opløselig eller uopløselig baner. Dette vil afgøre, hvilken isolation procedure til brug i protokol 6.
      Bemærk: Hvis der er et bånd i begge disse regioner end både isoleret der anvendes i protokol 6 nedenfor kan udføres, eller proteinet kan isoleres begge måder for at afgøre, hvilken isolation metode giver et højere udbytte af rekombinant protein (figur 3) .
    7. Hvis en 4 timer og natten induktion blev udført afgøre, hvilken induktion metode har den højeste proteinproduktion til opskalering proces (figur 2).
    10. 5.. Opskalering Procedure og Main Kultur

    1. Forbered vækstmedier med 85,7 g Terrific Broth og 28,8 ml 50% glycerol i 1,8 liter ultrarent vand og autoklaven på flydende cyklus i 1 time.
    2. Start en overnight kultur fra frossen celle bestand oprettet i trin 4.5.
      Bemærk: Betingelser er færdig aseptisk.
      1. Bland 20 ml LB og med en endelig koncentration af ampicillin ved 100 ug / ml i en steril 125 ml Erlenmeyer-kolbe.
      2. Ved hjælp af en steril applikator pind tage en skrotning af transformeret E. coli-celler og drop applikator i kolben. Fjern applikatorpind og stik kolbe med skum prop eller bomuld og dæk med alufolie for at opretholde sterilitet.
      3. Ryst natten over ved 250 rpm ved 37 ° C.
    3. Main Kultur
      Bemærk: Betingelser er færdig aseptisk.
      1. Hæld natten over kultur i 1,8 L af sterile vækstmedier og tilføj ampicillin ved 100 ug / ml og 6 til 8 dråber steril antiskum 204 under anvendelse af en Pasteur-pipette.
      2. Placer kulturer i et 37 ° C vandbad med 0,2 mm filtreret trykluft boblende i kulturer gennem luftning sten.
      3. Når OD 600 nm når 0,7-0,8 inducere med IPTG (1 mM) og tillade induktion at forekomme i enten 4 timer ved 37 ° C eller natten over ved 18 ° C afhængig af opløselige / uopløselige resultaterne fra SDS-PAGE i trin 4.9.
    4. Indsamling E. coli-celler
      1. Spin ned cellekulturen i 1 L centrifuge-flasker (2 flasker / kultur) i 15 minutter ved 14.000 xg ved 4 ° C.
      2. Hæld supernatanten og ved hjælp af en tynd spatel, scoop bakterierne pelletering i to 50 ml rør. Cellerne kan pelleteres igen ved centrifugering i et par minutter.
        Bemærk: Hver 1,8 liter kultur vil resultere i to bakterier pellets, en i hver 50 ml centrifugerør.
      3. Opbevar træpiller i -80 C indtil protein isolation.
      </ Li>

    6.. Isolering og oprensning af rekombinant protein

    Bemærk: Hvis proteinet er placeret i den opløselige regionen, baseret på SDS-PAGE-analyse fra trin 4.9 derefter "Native Isolation" vil blive anvendt, men uopløselige proteiner "nonnative Isolation" procedurer udføres.

    1. Cellelyse
      1. Nonnative
        1. Fjern transformeret E. coli pellet fra -80 ° C fryser, og der tilsættes 20 ml Lysis / Wash Buffer (tabel 1) til hvert centrifugerør.
        2. Vortex og ryst den frosne pellet indtil det smelter og opløser i bufferen løsning uden nogen store klumper. Inkuber på nutator natten over. Den følgende morgen, bør pelleten nu være en tyktflydende på grund af denaturering af proteinet fra bufferen.
        3. Centrifugeres opslæmningen ved 20.500 xg ved stuetemperatur i 30 minutter. Supernatanten overføres til et nyt rør til isolering og kassere bundfaldet.
      2. Anskaf transformeret E. coli pellet fra -80 ° C fryseren.
      3. Tilføj Lysis Buffer (tabel 1) til centrifugeglas at nå en endelig volumen på 30 ml, og løsne frosne pellet ved vortex og ryste strengt. Placer pellet på is.
      4. Vask sonikator probe med 70% ethanol ved 100% amplitude 1-2 min. Derefter gentage med ultrarent vand.
      5. Soniker bakterier bundfælde mens på is i 5 min (forløbet spilletid for 10 min).
        1. Indstil sonicator ved 30% amplitude med puls på 30 sek on/30 sek slukket.
        2. Bob centrifugeglas op og ned under lydbehandling interval for fuldstændigt at bryde op cellepelleten. Ved afslutningen af ​​den samlede forløbne tid bør der ikke være nogen synlige bakterier pelletere forlader en trævlet viskos opslæmning.
        3. Rengør sonikator sonden mellem forskellige protein isolationer samt oplagring ved hjælp af 70% ethanol og ultrarent vand som beskrevet i trin 6.1.2.3.
        Centrifugeres opslæmningen ved 20.500 xg ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatanten overføres til et nyt rør til isolering og kassere bundfaldet.
  10. Ni-NTA affinitetskromatografi
    1. Nonnative
      1. Tilsæt 1 ml Ni2 +-NTA-harpiks-opløsning til hvert centrifugeglas (2 ml harpiks i alt for en 1,8 L kultur) og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 1 time på nutator.
      2. Hæld opslæmningen i affinitetssøjle og tillade opløsningen at dryppe gennem stophaneventilen helt ind affald bægerglas.
      3. Udfør 10 vaske med 10 ml Lysis / Wash Buffer til hver vask.
        1. For de første to skylninger, tilsæt 10 ml til centrifugerøret for at fjerne yderligere harpiks og derefter hældes i kolonnen. De yderligere vasker kan tilføjes direkte til kolonnen.
        2. Efter hver vask omrøres harpiksen med en glasspatel. Når vasken drypper ind i affaldet bægerglas kan de næste 10 ml tilsættes.
      4. Efter vask helt drips igennem tæt stophaneventil, fjerne affald bæger og erstatte med 50 ml centrifugerør for protein samling.
      5. Der tilsættes 15 ml elueringspuffer (tabel 1) og rør-up harpiks, så løsning til at sidde i 5 min. Åbent stophaneventil og indsamle eluering. Gentag igen med yderligere 15 ml.
    2. Native
      1. Følg nonnative Affinity Chromatography ovenfor (trin 6.2.1.1-6.2.1.4), undtagen justere følgende parametre:
        1. Inkuber Ni 2 +-NTA harpiksopløsning ved 4 ° C i mindst 1 time på nutator.
        2. Brug passende vaskebuffer (tabel 1).
      2. Der tilsættes 5 ml elueringsbuffer (tabel 1) og inkuberes med harpiks i 5 min.
        1. Åben stophaneventilen og indsamle eluering indtil det meste af opløsningen er dryppet igennem.
        2. Tilføj 90 gl / brønd af Bradford-reagens for at fjerne 96-brønds plade. Efter hver eluering tillader 10 pi sålution at dryppe fra søjle i godt indeholdende 90 pi Bradford reagens.
        3. Fortsæt med tilsætning af 5 ml elueringspuffer ad gangen, indtil Bradford assay ikke længere registrerer protein (farve går fra mørkeblå til lyseblå at rydde). Dette tager normalt 4-5 elueringsvolumener.
  11. Dialyse / Renaturering
    1. Sørg nonnative (renaturation) og indfødte dialyse buffere (tabel 1) og butik i 4 ° C.
      Bemærk: pH af dialyse puffere bestemmes af målproteinet isoelektriske punkt (pi). Som en tommelfingerregel proteiner skal bufferet mindst ét helt point over eller under deres PI-værdier.
    2. Overfør native og ikke-native elueringer til dialyserør med passende molekylvægtafskæring (25.000 MWCO for NGF og 50.000 MWCO for Sema3A). Hvert protein prøve anbringes i respektive dialysebuffer 1 i 4 timer ved 4 ° C og derefter erstatte med den respektive buffer 2 overnat ved 4 ° C.
      Bemærk: Protein skal dialyseres i hver puffer i mindst 4 timer for korrekt refoldning og pufferudveksling skal finde sted.
    3. Koncentrer de dialyserede protein elueringer til mindre end 5 ml under anvendelse centrifugerotationsoperationen koncentratorer.
      Bemærk: Proteiner kan renses yderligere ved hjælp af hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) og koncentreret igen.
  12. Bestem proteinkoncentration (mg / ml) ved frysetørring af en 10-50 ml prøve i en i forvejen vejet mikrocentrifugerør.
    1. Valgfrit: bestemme ekstinktionskoefficienten, ε, således at koncentrationen af protein kan bestemmes i fremtidige isoleringer ved at måle absorbansen af en prøve på 280 nm ved hjælp af Lambert-Beers lov: c = a 280 nm / εl, hvor l er vejlængden.

7.. Biotinylering af renset protein

  1. Dialysér proteiner i 10.000 MWCO dialyse kassetter against 10 mM Tris (pH = 8,0), ændre puffer hver 4. time med i alt 6 ændringer.
  2. Overfør de rekombinante proteiner (nu i 10 mM Tris-buffer) til 2 ml mikrocentrifugerør til biotinylering.
  3. Biotinylere proteiner under anvendelse af et biotin-protein ligase kit.
  4. Dialysér proteiner mod PBS (pH = 7,4) under anvendelse af 10.000 MWCO dialyse kassetter med 3 puffer ændrer om dagen i 2 dage.
  5. Bestem procent biotinylering af proteiner ved hjælp af en kvantificering kit.
  6. Bestem koncentrationen igen, som beskrevet i punkt 6.4 og opbevares ved 4 ° C eller alikvot og opbevares ved -20 ° C til langtidsopbevaring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning og Test Expression

Når plettering er udført korrekt, bør enkelte isolerede kolonier danne at øge chancerne for plukning klonal transformerede bakterieceller (figur 2A). Men hvis for mange celler udplades, pladerne inkuberes for længe ved 37 ° C eller transformation er tvivlsom, kolonier kan omfatte agarplade eller danne større aggregater af celler (figur 2B og 2C). Under testudtryk blev NGF og Sema3A først induceret i 4 timer ved 37 ° C og SDS-PAGE-analyse bestemmes begge proteiner blev placeret i den opløselige fraktion (figur 2D). Proteinekspression syntes retfærdig, og derfor en anden test udtryk med overnight induktion ved 18 ° C blev undersøgt. NGF har resulteret i bedre udtryk i den opløselige fraktion, hvorimod der ikke var nogen mærkbar forskel med Sema3A (Figur 2E).

"> Isolering, rensning og Biotinylering

Både NGF og Sema3A blev isoleret under anvendelse native isolation teknik som beskrevet i den ovennævnte protokol og løber gennem FPLC-søjle til rensning. Derudover disse rekombinante proteiner blev isoleret og oprenset nonnatively. Selvom NGF var i den opløselige fraktion under testudtryk indfødte isoleringsprocedurer producerede et lavt udbytte af NGF efter både 37 ° C (4,57 mg / main kultur 2 L) og 18 ° C (6,11 mg / main kultur 2 L; Figur 3A, faste linjer) induktioner. Imidlertid blev et højere udbytte af NGF opnået ved ikke-native isolation med renaturering (10,72 ± 1,8 mg / main kultur 2 L, 3A, stiplet linie) efter 18 ° C natten induktion. På den anden side, ikke-native isolation resulterede ikke i nogen Sema3A produktion (figur 3B, stiplet linie) med 8,61 ± 3,1 mg / main kultur 2 L for nativ isolering (figur 3 B, fast linie). Som følge heraf blev NGF isoleret under native forhold efter overnight induktion ved 18 ° C, mens Sema3A gennemgik indfødte isolation efter 4 timer af induktion ved 37 ° C. FPLC toppe blev opsamlet, og NGF og Sema3A prøver blev analyseret med SDS-PAGE (figur 3). Yderligere protein toppe fundet i FPLC udgang til Sema3A (figur 3B) blev opsamlet og analyseret med SDS-PAGE og blev ikke placeret i Sema3A molekylvægt regionen. Disse fraktioner er mest sandsynlige nedbrydningsprodukter, fordi de ikke opfører sig funktionelt i cellebaserede assays, som gjorde Sema3A højdepunkt angivet i figur 3B. Proteiner blev biotinyleret under anvendelse af et BirA-enzym og dialyseres for at fjerne eventuelle uomsatte arter. Biotinylering blev bekræftet med en biotin kvantificering kit og fluorescerende mikropladelæser.

ftp_upload/51295/51295fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51295/51295fig1.jpg "/>
Figur 1. Protein engineering udnytte en E. coli-ekspressionssystem. Den grundlæggende proces af rekombinant protein engineering involverer udformningen af et plasmid til kloning og ekspression i E. coli. Transformerede kolonier selekteres med anvendelsen af ​​antibiotika. Små test udtryk bruges til at optimere og identificere produktion og opløselighed af målproteinet. Denne procedure er skaleret op til store batchdyrkninger (liter skala). Kromatografi metoder anvendes til at isolere og oprense det ønskede manipuleret protein. Modifikationer, såsom biotinylering kan forekomme under batchdyrkninger eller efter oprensning.

Figur 2
Figur 2. Optimizing test ekspression af NGF og Sema3A. (A) Plating 25 pi transformeret E. coli K12-celler resulterede i små isolerede kolonier. En individuel koloni skal vælges til test udtryk. For BL21 transformerede celler bør lignende koloni fordeling forekomme. (BC) Belægning 50 pi og 100 pi af K12-celler, resulterede i overfyldte bakteriekolonier. Plukning fra disse plader kunne resultere i en lavere sandsynlighed for at vælge en koloni stammer fra en enkelt transformeret celle. (D) Test udtryk for transformerede celler blev induceret i 4 timer ved 37 ° C med IPTG, og SDS-PAGE viser, at NGF-fusionsprotein (29 kDa) og Sema3A fusionsprotein (91 kDa) er udtrykt i den opløselige fraktion. (E) Overnatning induktion ved 18 ° C viser NGF udtryk stadig i den opløselige fraktion, men er udtryk for Sema3A ikke forbedret.


Fig. 3. Oprensning af NGF og Sema3A hjælp af FPLC. (A) ikke-native isolation efter 18 ° C natten over induktion (stiplet linie) resulterede i bedre NGF udbytter i forhold til nativ isolation på begge 4 timer, 37 ° C og natten over, 18 ° C induktioner (fuldt optrukne linier). (B) For Sema3A, induktion ved 37 ° C i 4 timer og indfødte isolation tilstand giver bedre udbytter sammenlignet med nativt isolation på samme dyrknings-parametre. SDS-PAGE viser FPLC peak samlinger (pile) for både (A) NGF og (B) Sema3A. En gelfiltrering protein standard blev kørt for at bekræfte molekylvægtsfordelingen af ​​toppene og angives i baggrunden af ​​FPLC parceller i kDa.

Isolation Buffer Komponenter
Nonnative Lysis / Wash 6 M GuHCI, 100 mM H 2 NaPO4, 10 mM Tris-base, 10 mM imidazol, pH = 8,0
Eluering 6 M GuHCI, 200 mM Iseddike (17,4 M)
Dialyse (Renaturering) Phosphatpuffersaltopløsning (PBS):
21,7 mM NaH 2PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Buffer 1: PBS, 0,2 M GuHCl, 1,99 mM dithiothreitol (DTT) i 4 L ultrarent vand, pH = 7,4
Buffer 2: PBS i 4 L ultrarent vand, pH = 7,4
Native Lysis 50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH = 8,0
Vaske 50 mMNaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH = 8,0
Eluering 50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH = 8,0
Dialyse Phosphatpuffersaltopløsning (PBS):
21,7 mM NaH 2PO 4, 15,3 mM Na 2 HPO 4, 149 mM NaCl
Buffer 1: PBS, 1,99 mM DTT i 4 L ultrarent vand, pH = 7,4
Buffer 2: PBS i 4 L ultrarent vand, pH = 7,4

Tabel 1. Rekombinante Protein Isolation Buffers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein engineering er en meget kraftfuld teknik, der spænder over mange discipliner. Det er omkostningseffektivt, afstemmelige og en forholdsvis enkel procedure, mulighed for produktion af høje udbytter af specialdesignede proteiner. Det er vigtigt at bemærke, at designe og udtrykke målproteiner er ikke altid ligetil. Basal ekspression og rekombinant protein stabilitet afhænger af specifikke valg af vektor, E. coli celle stammer, peptidmærke tilføjelser og dyrkningsmetoder parametre. Vores specifikke design kriterium udnytter veletableret E. coli-stammer for protein engineering. Derudover plasmid vektor indeholder en T7-lac-promotor og ampicillinresistensgen til stabil ekspression af rekombinant protein.

Efter opnåelse af højt oprenset subklonede plasmid, den første større procedure er at kunne omdanne målproteinet i værtscellen og bestemme opløseligheden afproteinet. Test udtryk er det bedste tidspunkt at optimere syntesen af ​​målproteinet. Det er vigtigt at plukke små, isolerede kolonier (figur 2A) for at sikre bedre udvælgelse af bakterieceller indeholdende plasmidet. Fejlfinding strategier såsom genudstrygning at omfordele kolonierne eller inkubere agarplader i kortere perioder kunne støtte i bedre koloni formationer. Det er ingen overraskelse, at produktion af rekombinante proteiner inducerer stress på værtstammen 36.. I denne fase, hvis ekspression er dårlig, kan faktorer såsom antibiotika og IPTG-koncentration samt induktion tid og temperatur justeres for at opnå den optimale målproteinet (for gennemgang se 37-38). Dette blev set for NGF, hvor det bedste udtryk resulterede fra overnight induktion ved 18 ˚ C (Figur 2E).

Sema3A resulterede i proteinproduktion til native betingelser, men nonnative isolation viste intet protein produktion (figur 3B). Vigtigste kulturer af NGF blev induceret i 4 timer ved 37 ˚ C samt natten over ved 18 ˚ C og isoleret under native betingelser. FPLC oprensning produceret en lavere udbytte af NGF i forhold til de vigtigste kulturer, der blev isoleret nonnatively efter nattens induktion ved 18 ˚ C (figur 3A). Dannelsen af ​​proteiner i inklusionslegemer er generelt menes at være uønsket, da renaturering er undertiden vanskeligt og ikke altid lykkes. Dette har ført til udviklingen af teknikker til at øge protein opløselighed herunder tilsætning af opløseligt protein sekvenser 39-41. Proteiner har imidlertid vist sig at besidde former for konformationelle tilstande, mens isoleres i inklusionslegemer, og parametre såsom lavere induktion temperaturer til at opretholde disse aktive strukturer 42-46. Når et protein kan kun udtrykkes i uopløselig form er det normalt muligt at renatur proteinet efter isolering ved hjælp af simple teknikker med meget lidt udbytte tab, som vi har rapporteret tidligere 21.

Vi har vist, hvordan man med succes konstruere og producere biotinylatable proteiner ved hjælp af en E. coli kloning og ekspression systemet som vært gav omkring 8-10 mg / main kultur 2 L. Det er vigtigt at bemærke, at den samlede sekvens af begivenheder, forbliver den samme, når producere nye rekombinante proteiner (figur 1), men hver custom- lavet protein skal behandles fra sag til sag for at afgøre, hvordan man specifikt det højeste udbytte af renset produkt. Vi har vist, hvordan NGF og Sema3A opfører sig anderledes i det samme dyrkning, og hvordan man kan optimere deres produktion. Derudover er vi i øjeblikket bruger en anden E. coli B værtsstamme, der kan biotinylere in vivo 47 for andre målproteiner, hvilket viser betydningen af opholdg velinformeret om de igangværende fremskridt og ændringer vedrørende rekombinant protein engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende The University of Akron til finansiering, der støttede dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
  3. Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
  4. Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
  5. Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
  6. Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
  7. Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
  8. Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
  9. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
  10. McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
  11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
  12. Novagen pET System Manual. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).
  13. Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
  14. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
  15. Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
  18. Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  19. Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
  20. Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
  21. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
  22. Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
  23. Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
  24. McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
  25. Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
  26. Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
  27. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
  28. Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
  29. Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
  30. Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
  31. Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
  32. Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
  33. Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
  34. Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
  35. Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
  36. Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
  37. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
  38. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  39. Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
  40. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
  41. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  42. de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
  43. Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
  44. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
  45. Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
  46. Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
  47. Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).

Tags

Bioteknik protein engineering produktion af rekombinante proteiner AviTag BirA biotinylering pET vektor-system, Ni-NTA gelpermeationskromatografi
Ekspression, isolation og oprensning af opløselige og uopløselige Biotinylerede Proteiner til nervevæv Regeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A.,… More

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter