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Bioengineering

तंत्रिका ऊतक उत्थान के लिए घुलनशील और अघुलनशील Biotinylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति, अलगाव, और शोधन

Published: January 22, 2014 doi: 10.3791/51295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Akron

Summary

Biotinylatable संलयन प्रोटीन का विकास अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में कई संभावित आवेदन किया है. पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग कस्टम डिजाइन प्रोटीन की उच्च पैदावार प्रदान करने, लागत प्रभावी है कि एक सीधे आगे की प्रक्रिया है.

Abstract

पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) अभिव्यक्ति लगभग 4 दशकों के लिए सिस्टम, और आज का उपयोग किया गया ई. कोली अभी भी सबसे अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल मेजबान जीव है. प्रणाली का लचीलापन इस तरह के (streptavidin बातचीत के लिए) एक बायोटिन टैग के रूप में moieties और हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन या चेरी लाल प्रोटीन जैसे बड़े कार्यात्मक प्रोटीन के अलावा के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, बाद translational संशोधनों प्रदान धातु आयन chelators, विशिष्ट प्रतिक्रियाशील कार्य समूहों, स्पेक्ट्रोस्कोपी जांच, और अणुओं की तरह अप्राकृतिक अमीनो एसिड के एकीकरण प्रोटीन गुण और functionalities के बेहतर हेरफेर सक्षम है. नतीजतन इस तकनीक अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण उपयोगिता है कि प्रस्ताव अनुकूलन संलयन प्रोटीन बनाता है. अधिक विशेष रूप से, biotinylatable प्रोटीन अनुक्रम क्योंकि avidin और streptavidin के साथ बायोटिन के बीच उच्च आत्मीयता बातचीत के कई लक्ष्य प्रोटीन में शामिल किया गया है. इस के अलावा टैग प्रोटीन का पता लगाने और शुद्धि बढ़ाने के साथ ही इस तरह के सेल छँटाई के रूप में माध्यमिक अनुप्रयोगों के लिए रास्ता खोलने में सहायता की है. इस प्रकार, बायोटिन लेबल अणुओं bioindustrial और जैव चिकित्सा के क्षेत्र में एक वृद्धि और व्यापक प्रभाव दिखा. हमारे शोध के प्रयोजन के लिए हम तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) और semaphorin3A (Sema3A) कार्यात्मक क्षेत्रों युक्त पुनः संयोजक biotinylated संलयन प्रोटीन इंजीनियर है. हम इन biotinylated संलयन प्रोटीन, अन्य सक्रिय प्रोटीन दृश्यों के साथ साथ, ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी उद्देश्यों के लिए biomaterials के लिए सीमित किया जा सकता है जैसा कि पहले बताया गया है. इस प्रोटोकॉल एक T7 लाख inducible वेक्टर और ई. के उपयोग, मिलीग्राम पैमाने पर इंजीनियरिंग biotinylatable प्रोटीन की मूल बातें रूपरेखा परिवर्तन करने के लिए पैमाने अप और शोधन से शुरू कोलाई अभिव्यक्ति मेजबान.

Introduction

प्रोटीन अंततः उचित ऊतक गठन और संगठन के प्रमुख के लिए कई जैविक कार्यों के लिए जिम्मेदार हैं कि biomolecules के एक विस्तृत रेंज को कवर किया. इन अणुओं मानव शरीर के भीतर संतुलन को बनाए रखने, विनियमन अप और / या नीचे विनियमन जीन और अन्य प्रोटीन की है कि नियंत्रण संकेत दे रास्ते के हजारों आरंभ. एक प्रोटीन के विघटन विनाशकारी विकारों या रोगों की शुरुआत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं संकेतों के इस पूरे वेब, को प्रभावित करता है. प्रयोगशाला में व्यक्तिगत प्रोटीन इंजीनियरिंग इन प्रतिकूल प्रभाव का मुकाबला करने के लिए एक समाधान प्रदान करता है और छोटे अणु दवाओं के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. 1977 में, 14 एमिनो एसिड सोमेटोस्टैटिन अनुक्रम एक जीन एन्कोडिंग ई. का उपयोग कर बनाया पहला इंजीनियर polypeptides में से एक था कोली 1. इसके तुरंत बाद 1979 में, इंसुलिन, प्लाज्मिड pBR322 में क्लोन तब्दील, व्यक्त, और 2 शुद्ध किया गया था. तब से, पुनः संयोजक प्रोटीन को छोड़कर के कई क्षेत्रों के लिए अपने प्रभाव का विस्तार कियाearch आदि biomaterials, दवा वितरण, ऊतक इंजीनियरिंग, biopharmaceuticals, खेती, औद्योगिक एंजाइमों, जैव ईंधन के रूप में (समीक्षा के लिए संदर्भ 3-8 देखें). इस तकनीक सहित प्रयोजनों के लिए आवेदन विशिष्ट रासायनिक moieties या प्रोटीन दृश्यों के अलावा के माध्यम से प्रदान करता है, लेकिन, लक्ष्य प्रोटीन की पहचान, स्थिरीकरण और शुद्धि के लिए ही सीमित नहीं हैं कि बहुमुखी प्रतिभा के कारण है.

पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के माध्यम से, पुनः संयोजक प्रोटीन स्तनधारी, पौधे, कीट, खमीर, कवक, या बैक्टीरिया सहित यूकेरियोटिक और prokaryotic मेजबान प्रणालियों की एक किस्म में व्यक्त किया जा सकता है. प्रत्येक मेजबान विभिन्न लाभ प्रदान करता है और आम तौर पर सबसे अच्छा प्रणाली प्रोटीन समारोह, उपज, स्थिरता, कुल लागत, और scalability के आधार पर निर्धारित किया जाता है. बैक्टीरिया कोशिकाओं अक्सर यूकेरियोटिक मेजबान (यानी ग्लाइकोसिलेशन, डाइसल्फ़ाइड ब्रिजिंग, ई प्रदान कि बाद translational संशोधन तंत्र की कमी टीसी.) 5. हालांकि इन मेजबान आमतौर पर अधिक महंगा है और समय लेने वाली 9 रहे हैं, नतीजतन, स्तनधारी और कीट प्रणालियों आमतौर पर यूकेरियोटिक प्रोटीन का बेहतर संगतता और अभिव्यक्ति में परिणाम. इसलिए, ई. कोशिकाओं सस्ती विकास की स्थिति में तेजी से विस्तार और आनुवंशिक अभिव्यक्ति तंत्र अच्छी तरह से 5,9 समझ रहे हैं क्योंकि कोलाई हमारी अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए इष्ट मेजबान है. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली के बाद translational संशोधनों 10 की कमी के बावजूद उत्पादन उद्देश्यों और कार्यात्मक प्रोटीन में परिणाम के लिए ऊपर पैमाने पर करने के लिए आसान है. ई. इस तनाव उच्च परिवर्तन क्षमता पर आधारित उत्कृष्ट प्लाज्मिड पैदावार प्रदान करता है क्योंकि कोलाई K12 तनाव क्लोनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल में चुना जाता है. इसके अतिरिक्त, एक ई. इस मेजबान तनाव नियंत्रित प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थिरता 11 प्रदान करता है जो T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीन होता है क्योंकि कोलाई BL21 तनाव अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाता है.

तम्बू "> मेजबान के चयन के बाद, आगे की देखभाल पुनः संयोजक प्रोटीन synthesizing जीवाणुभोजी T7 प्रतिलेखन और अनुवाद संकेतों के निर्देशन में क्लोन है कि एक लक्ष्य डीएनए अनुक्रम के साथ शुरू होता है. चयनित और नियंत्रित प्रोटीन अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए आदर्श अभिव्यक्ति वेक्टर के चयन में लिया जाना चाहिए, और अभिव्यक्ति T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीन 12 के गुणसूत्र प्रतियां युक्त मेजबान कोशिकाओं में प्रेरित किया है. प्लाज्मिड वेक्टर pBR322 से निकाली गई इन वैक्टर, (समीक्षा के लिए देख 13 संदर्भ), कसकर शुरू में studier और उनके सहयोगियों ने 14 से विकसित T7 प्रमोटर द्वारा नियंत्रित और अतिरिक्त प्रदान कर रहे हैं लाख ऑपरेटर और लाख repressor (lac1) के शामिल किए जाने के माध्यम से नियंत्रण 15,16. पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए, इस अभिव्यक्ति प्रणाली अलग लक्ष्य डीएनए अनुक्रम डालने से एक वांछित प्रोटीन की एक विशिष्ट एमिनो एसिड अनुक्रम दर्जी के लिए या संलयन प्रोटीन बनाने की क्षमता प्रदान करता है संयुक्त डोमेन से बनाएक प्रोटीन से है. साथ ही, कुछ वेक्टर श्रृंखला एन या सी टर्मिनस पर रखा जाना पेप्टाइड टैग संशोधनों में शामिल हैं. हमारे डिजाइन प्रयोजनों के लिए, एक हिस्टडीन (उनकी) टैग शुद्धि के लिए डीएनए लक्ष्य अनुक्रम को जोड़ा गया है और एक 15 अमीनो एसिड biotinylatable अनुक्रम biotinylation 17,18 के लिए शामिल किया गया था. इस प्रोटोकॉल में एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन युक्त प्लाज्मिड, हमारे biotinylatable संलयन प्रोटीन दृश्यों ले जाने के लिए चुना गया था. अभिव्यक्ति T7 लाख प्रमोटर के माध्यम से इस सदिश में नियंत्रित किया जाता है और आसानी से isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित किया है.

टेस्ट अभिव्यक्ति (छोटे पैमाने संस्कृतियों) शोधन प्रक्रियाओं तैयार करने के लिए या तो एक घुलनशील या अघुलनशील रूप में व्यक्त किया जा सकता है जो लक्ष्य प्रोटीन, की उपस्थिति और विलेयता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. बैक्टीरिया कोशिका के भीतर व्यक्त एक घुलनशील प्रोटीन अपने मूल संरचना 19 बनाए रखने के लिए सहज तह से गुजरना होगा. आमतौर पर देशीसंरचना thermodynamically अनुकूल है. कई मामलों में मेजबान की चयापचय गतिविधि अघुलनशील प्रोटीन के उत्पादन और अघुलनशील प्रोटीन समुच्चय से बना शामिल किए जाने निकायों के गठन की ओर जाता है कि प्रणाली पर तनाव रखने, लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल नहीं है. इस प्रकार लक्ष्य प्रोटीन 20 आम तौर पर जैविक रूप से निष्क्रिय उन्हें प्रतिपादन, denatures. दोनों परीक्षण का भाव ऊपर पहुंचा रहे हैं, और अलगाव प्रक्रियाओं लक्ष्य प्रोटीन की घुलनशीलता से निर्धारित होते हैं. एक अतिरिक्त renaturation या कदम refolding अघुलनशील प्रोटीन के लिए आवश्यक है. परिणामस्वरूप पुनः संयोजक प्रोटीन आगे आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है.

घर में पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन लक्ष्य प्रोटीन की मिलीग्राम मुख्य संस्कृति के प्रति लीटर अलग किया जा सकता है के बाद से वाणिज्यिक उत्पादों पर लागत लाभ प्रदान करता है. आवश्यक उपकरणों से अधिकांश एक ठेठ जैविक या रासायनिक प्रयोगशाला में उपलब्ध है. प्रोटीन इंजीनियरिंग निर्माण के लिए अनुमति देता हैहमेशा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, जो जोड़ा functionalities के साथ कस्टम संलयन प्रोटीन की. 1 इंजीनियरिंग पुनः संयोजक प्रोटीन में शामिल मुख्य प्रक्रियाओं को दर्शाया गया है चित्रा. इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ हम ऐसे इंटरफेरॉन गामा, प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक, और हड्डी morphogenetic प्रोटीन 21-23 के रूप में कई biotinylatable प्रोटीन, बनाया है, लेकिन हम हम अक्षतंतु मार्गदर्शन, NGF (29 केडीए के लिए डिज़ाइन किया गया है कि दो प्रोटीन पर ध्यान दिया जाएगा ) और Sema3A (91 केडीए) 10 (समीक्षा के लिए) 24 संदर्भ देखें. Biotinylation पहचान, स्थिरीकरण और प्रसिद्ध बायोटिन-streptavidin बातचीत 25-27 उपयोग लेबल प्रोटीन के अलगाव के लिए एक सामान्य तकनीक है. Biophysical जांच 28,29, 30 biosensors, और क्वांटम डॉट्स 31 10 -15 एम 27 के आदेश पर एक कश्मीर डी के साथ बायोटिन-streptavidin विकार के उच्च आत्मीयता का उपयोग उन सिस्टम्स के कुछ उदाहरण हैं. ई. कोली बायोटिन ligase, बीरा, बायोटिन के भीतर पाया लाइसिन पक्ष श्रृंखला के लिए बायोटिन के सहसंयोजक लगाव में एड्स के अनुक्रम 18,32 टैग किया. सामग्री और biomolecules के लिए tethering बायोटिन कई ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों 21,33-35 के लिए सेल करने के लिए वृद्धि कारकों की निरंतर वितरण का उत्पादन किया गया. इसलिए, इन कस्टम डिजाइन biotinylatable प्रोटीन इंजीनियरिंग कई अनुसंधान के हितों पार कर सकते हैं कि एक शक्तिशाली उपकरण है.

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Protocol

1. लक्ष्य प्रोटीन की डिजाइनिंग

  1. जैव प्रौद्योगिकी सूचना वेबसाइट के लिए राष्ट्रीय केन्द्र का उपयोग करना (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) खाते में ब्याज और किसी भी ब्याह वेरिएंट की प्रजातियों लेने लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक एमिनो अनुक्रम प्राप्त करते हैं. प्रोटीन के हित के सक्रिय क्षेत्र से मेल खाती है कि अमीनो एसिड अनुक्रम का चयन करें.
    नोट: Sema3A के लिए, अमीनो एसिड 21-747 चुने गए हैं. एक संलयन प्रोटीन barstar, अमीनो एसिड 1-90 के अनुक्रम, NGF अमीनो एसिड 122-241 के लिए जोड़ा गया था जहां NGF के साथ डिजाइन किया गया था.
  2. एन टर्मिनस पालन दृश्यों जोड़ने के लिए: शुद्धि के लिए 6X उनकी टैग (hhhhhh), तंबाकू नक़्क़ाशी वायरस उनकी टैग को हटाने के लिए (TEV) प्रोटीज कटौती साइट (ENLYFQG), बायोटिन कश्मीर (GLNDIFEAQKIEWHE) में प्रोटीन की biotinylation के लिए अनुक्रम में चिह्नित और उचित प्रोटीन refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) के लिए कमरे की अनुमति देगा कि अंतराल के साथ लचीला काज.
    नोट: इन दृश्यों वांछित फ्यूजन prot के आधार पर भिन्न हो सकते हैंEin.
  3. वांछित मेजबान प्रजातियों और संश्लेषण के लिए जीन डिजाइन / अनुकूलन के लिए एक कंपनी को पूरा अमीनो एसिड अनुक्रम भेजें. एक किट का उपयोग कर BamHI-चना साइट का उपयोग पसंद का एक वेक्टर में या व्यावसायिक सेवाओं के उपयोग के द्वारा Subclone.

2. अगर प्लेट बनाना

नोट: यह आदि एंटीबायोटिक दवाओं, प्लेटें, buffers, के सभी शेयरों (तापमान और अवधि) ठीक से जमा हो जाती है कि बहुत महत्वपूर्ण है और (निष्फल) proteases से मुक्त रहते हैं.

  1. एक गिलास मीडिया बोतल में 20 ग्राम / एल और जगह में 1.5% wt और lysogeny शोरबा (पौंड) में अगर वजन. एक 500 मिलीलीटर की बोतल के बारे में 15 प्लेटें बनाता है.
  2. Volumetrically, ultrapure पानी जोड़ने के मिश्रण अच्छी तरह से, और आटोक्लेव.
  3. स्पर्श करने के लिए बोतल ठंडा करते हैं और उचित एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ने. बोतल भी ज्यादा ठंडा और समाधान जमाना शुरू होता है, तो हालांकि, माइक्रोवेव में गर्म कर लें, अगर समय से पहले solidification बचें.
    नोट: हमारी प्लाज्मिड एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध जनरल शामिलई. इसलिए, सभी चरणों में 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन शामिल होना चाहिए. ई. कोलाई क्लोनिंग K12 तनाव टेट्रासाइक्लिन (12.5 ग्राम / एमएल) एंटीबायोटिक की आवश्यकता है. BL21 बैक्टीरिया की कोशिकाओं को कोई अतिरिक्त एंटीबायोटिक की आवश्यकता नहीं है.
  4. 90 मिमी पेट्री डिश में समाधान के 25-30 मिलीलीटर डालो और सुखाने के लिए समय की अनुमति.
  5. उचित एंटीबायोटिक दवाओं और parafilm के साथ 4 डिग्री सेल्सियस, में या एक resealable बैग में दुकान ऊपर से नीचे के साथ लेबल पकवान.
    नोट: प्लेट्स के बारे में एक महीने के लिए अच्छे हैं.

3. बायोटिन गईं प्लाज्मिड की क्लोनिंग

नोट: स्थितियां aseptically किया जाता है.

  1. गोली के क्रम में 3 मिनट के लिए 6000 XG पर प्लाज्मिड वेक्टर नीचे स्पिन, और निष्फल ultrapure पानी की 10 μl जोड़ें.
  2. रासायनिक सक्षम ई. के 50 μl निकालें -80 डिग्री सेल्सियस से और तुरंत कोलाई उच्च परिवर्तन दक्षता कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
  3. 0.5-1 ng/50 पर वेक्टर समाधान के 1 μl जोड़ें56, 50 μl ई. एल कोशिकाओं कोली की कोशिकाओं और सेल्सियस -80 में शेष प्लाज्मिड जगह
  4. 5 मिनट के लिए बर्फ पर वेक्टर युक्त बैक्टीरिया कोशिकाओं रखें.
  5. गर्मी झटका वापस 2 मिनट के लिए बर्फ पर 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और जगह कोशिकाओं में 30-45 सेकंड के लिए सेल और वेक्टर मिश्रण.
  6. कैटाबोलाइट दमन (समाज) मध्यम (2% V Bacto-tryptone / डब्ल्यू, 0.5% w / ध् Bacto-खमीर निकालने, 8.56 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 20 मिमी MgSO 4, 20 मिमी ग्लूकोज के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के 250 μl जोड़ें , ultrapure पानी, = पीएच 7.0) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर मिलाते हैं.
    नोट: समाज autoclaved नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन फिल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से निष्फल हो.
  7. सूखी प्लेटें पूर्व चढ़ाना कोशिकाओं को 10-15 मिनट.
  8. पिपेट 25, 50, और एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और टेट्रासाइक्लिन (12.5 ग्राम / एमएल) एंटीबायोटिक दवाओं युक्त अलग अगर प्लेटों पर सेल समाधान के 100 μl. अगर प्लेटों पर समान रूप से समाधान वितरित करने के लिए कांच के मोती का प्रयोग करें.
    9. <ली> 15-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों उलटा सेते हैं.
  9. प्लेटों पर छोटे व्यक्तिगत बैक्टीरिया कालोनियों के लिए जाँच करें और आगे उपयोग (2A चित्रा) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर से नीचे की दुकान.
    1. कोई कालोनियों मौजूद हैं:
      1. Buffers और आपूर्ति की ताजगी और बाँझपन की जाँच करें.
      2. ई. में जोड़ा प्लाज्मिड की राशि में वृद्धि कोलाई K12 तनाव.
    2. बड़ी कालोनियों मौजूद है या कालोनियों (चित्रा 2B और 2C) के एक ऊंचा है, तो कम मात्रा में एक बाँझ टीका पाश या प्लेट कोशिकाओं का उपयोग कर एक नया अगर प्लेट restreak.
  10. टीका लगाना 5 एमएल तब्दील ई. की एक कॉलोनी के साथ एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और टेट्रासाइक्लिन (12.5 ग्राम / एमएल) एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग कोलाई कोशिकाओं. ग्रो अप कोशिकाओं रातोंरात 250-300 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर.
  11. अगले दिन, रात भर gro से लक्ष्य वेक्टर अलग करने के क्रम में एक प्लाज्मिड अलगाव किट का उपयोगडब्ल्यू ऊपर आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस और दुकान शुद्ध किया प्लाज्मिड.
    1. वैकल्पिक: 260 और 280 एनएम पर प्राप्त absorbance के पढ़ने का उपयोग प्लाज्मिड की पवित्रता और एकाग्रता की जाँच करें.

4. अभिव्यक्ति मेजबान में प्लाज्मिड परिवर्तन

नोट: स्थितियां aseptically किया जाता है.

  1. दोहराएँ ई. के लिए 3.2-3.10 कदमों निम्न बदलावों के साथ कोलाई BL21 कोशिकाओं:
    नोट: BL21 कोशिकाओं इसलिए केवल एम्पीसिलीन परिवर्तन के लिए अगर प्लेट को जोड़ा जाता है, किसी भी अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता नहीं है.
    1. 50 μl ई. के लिए कदम 3.12 से 0.5-2 ng/50 μl कोशिकाओं को अलग प्लाज्मिड की 2-5 μl जोड़ें कोली अभिव्यक्ति मेजबान कोशिकाओं.
    2. 60-90 सेकंड के लिए गर्मी झटका कोशिकाओं.
    3. 60 मिनट के बजाय 30 मिनट के लिए 250 rpm पर समाधान युक्त समाज मध्यम हिलाएँ.
  2. एक STER साथ पेट्री डिश से बदल बैक्टीरिया की कोशिकाओं का एक ही कॉलोनी प्लकइले applicator छड़ी और जगह एम्पीसिलीन की उचित एकाग्रता (100 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ 5 एमएल लेग शोरबा युक्त एक टेस्ट ट्यूब में.
  3. 250 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रकार के बरतन में टेस्ट ट्यूब रखें.
  4. अगली सुबह, रात भर बढ़ने से ऊपर के 200 μl लेने और 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन युक्त 5 मिलीलीटर लेग में जोड़ें.
  5. 750 μl संस्कृति को (बाँझ) 250 μl 50% ग्लिसरॉल के साथ शेष कोशिकाओं नीचे रुक और -80 डिग्री सेल्सियस में रखना
    नोट: न्यू परीक्षण अभिव्यक्ति और बड़े पैमाने अप प्रक्रियाओं जमी कोशिकाओं का एक scraping प्राप्त करने के लिए एक बाँझ applicator छड़ी का उपयोग करने और उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग inoculating द्वारा किया जा सकता है.
  6. ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 600 एनएम के एक absorbance पर 0.7-0.8 के बीच मापा जाता है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 250-300 rpm पर एक प्रकार के बरतन में टेस्ट ट्यूब रखें.
  7. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता में IPTG साथ कोशिकाओं को उत्पन्न.
  8. 300 rpm पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 4 घंटे के लिए हिला. वैकल्पिक रूप से कोशिकाओं को भी कर सकते हैं250-300 rpm पर 18 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हिल जाना. इस लक्ष्य प्रोटीन पर निर्भर करता है प्लाज्मिड के एक उच्च उपज उत्पादन कर सकते हैं.
  9. टेस्ट अभिव्यक्ति की सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) विश्लेषण
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में संस्कृति और जगह के 500 μl लो. 5 मिनट के लिए 13-15 XG पर स्पिन. सतह पर तैरनेवाला तरल डालो और लेबल "घुलनशील." लोड हो रहा है डाई (50 μl 2-mercaptoethanol, 950 μl Laemmli नमूना बफर) के 200 μl में vortexing के साथ resuspend गोली.
      नोट: घुलनशील बैक्टीरिया छर्रों पुनः संयोजक प्रोटीन बैक्टीरिया की कोशिकाओं के cytoplasmic क्षेत्रों में है, यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. हिमपात की जरूरत तक डाई लोड के बिना -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है. तब्दील हो या प्रेरित नहीं किया गया है कि एक नियंत्रण बैक्टीरिया संस्कृति घुलनशील और साथ ही तुलना के लिए इलाज किया जा सकता है.
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में संस्कृति और जगह के 1,000 μl ले लो. 5 मिनट के लिए 13-15 XG पर स्पिन.सतह पर तैरनेवाला तरल डालो और लेबल "अघुलनशील."
      नोट: अघुलनशील छर्रों बैक्टीरिया की कोशिकाओं का समावेश शरीर में पाया प्रोटीन को रिहा करने के क्रम में नीचे विकृतीकरण प्रक्रियाओं से गुजरना होगा. जब तक जरूरत के पिंड -80 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है. तब्दील हो या प्रेरित नहीं किया गया है कि एक नियंत्रण बैक्टीरिया संस्कृति अघुलनशील के साथ ही तुलना के लिए इलाज किया जा सकता है.
      1. 200 μl Bugbuster में अघुलनशील गोली Resuspend और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
      2. 5 मिनट के लिए 13-15 XG पर फिर से नमूना नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला के 50 μl ले और नया "अघुलनशील" 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें.
      3. तो फिर यह नया नमूना को लोडिंग डाई के 50 μl जोड़ें.
    3. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए प्रोटीन denature के लिए 5 मिनट के लिए दोनों घुलनशील और अघुलनशील नमूने उबाल लें.
    4. मानक सीढ़ी के साथ वैद्युतकणसंचलन जेल में प्रत्येक नमूना लोड.
    5. कल्पना करने के लिए आदेश में प्रोटीन के नमूने एक stainin उपयोगजी अभिकर्मक और कंपनी के प्रोटोकॉल का पालन करें.
    6. प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ जेल (चित्रा पर (देखें नोट 4.9.1 और 4.9.2) इन दो लेन की तुलना के रूप में अच्छी तरह से घुलनशील और अघुलनशील नियंत्रण गलियों गलियों की तुलना द्वारा घुलनशील और / या अघुलनशील भागों में व्यक्त करता है कि क्या यह निर्धारित 2). एक अंधेरे बैंड घुलनशील या अघुलनशील गलियों में प्रोटीन की आणविक वजन के आसपास दिखाई देनी चाहिए. यह जो अलगाव की प्रक्रिया प्रोटोकॉल 6 में उपयोग करने के लिए निर्धारित करेगा.
      नोट: एक बैंड अलगाव विधि पुनः संयोजक प्रोटीन का एक उच्च उपज (चित्रा 3) पैदा करता है जो निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल 6 में इस्तेमाल किया अलगाव नीचे किया जा सकता है, या प्रोटीन दोनों तरीकों से अलग किया जा सकता है या तो की तुलना में इन क्षेत्रों के दोनों में अगर वहाँ .
    7. 4 घंटा और रात भर प्रेरण आयोजित किया गया है, बड़े पैमाने अप प्रक्रिया के लिए उच्चतम प्रोटीन उत्पादन (चित्रा 2) है जो प्रेरण विधि का निर्धारण.
    10. 5. बड़े पैमाने अप प्रक्रिया और मुख्य संस्कृति

    1. बहुत खूब शोरबा के 85.7 ग्राम और 1.8 ultrapure पानी के एल और 1 घंटे के लिए तरल चक्र पर आटोक्लेव में 50% ग्लिसरॉल के 28.8 मिलीलीटर के साथ विकास मीडिया तैयार करें.
    2. 4.5 कदम में बनाया जमी सेल स्टॉक से एक रात में संस्कृति की शुरुआत करें.
      नोट: स्थितियां aseptically किया जाता है.
      1. एक बाँझ 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में 100 माइक्रोग्राम / एमएल पर 20 पौंड का मिलीलीटर और एम्पीसिलीन के अंतिम एकाग्रता के साथ मिलाएं.
      2. एक बाँझ applicator छड़ी का उपयोग करना तब्दील ई. के एक समाप्त लेना कोली की कोशिकाओं और कुप्पी में ड्रॉप applicator. फोम डाट या कपास के साथ applicator छड़ी और प्लग कुप्पी निकालें और बाँझपन बनाए रखने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया.
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर रातोंरात हिला
    3. मुख्य संस्कृति
      नोट: स्थितियां aseptically किया जाता है.
      1. बाँझ विकास मीडिया के 1.8 एल में रातोंरात संस्कृति डालो और 10 पर एम्पीसिलीन जोड़0 ग्राम / मिलीलीटर और एक पाश्चर पिपेट का उपयोग बाँझ Antifoam 204 की 6-8 बूंदें.
      2. वेंटिलेशन पत्थर के माध्यम से संस्कृतियों में संपीड़ित हवा बुदबुदाती फ़िल्टर्ड 0.2 मिमी के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह संस्कृतियों.
      3. आयुध डिपो 600nm 0.7-0.8 पहुँचता है, IPTG (1 मिमी) के साथ प्रेरित और प्रेरण कदम 4.9 में एसडीएस पृष्ठ से घुलनशील / अघुलनशील परिणामों के आधार पर 18 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस या रातोंरात 4 घंटा या तो के लिए घटित करने के लिए अनुमति देते हैं.
    4. ई. एकत्रित कोलाई कोशिकाओं
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 XG पर 15 मिनट के लिए 1 एल अपकेंद्रित्र बोतलें (2 बोतलों / संस्कृति) में सेल संस्कृति स्पिन
      2. सतह पर तैरनेवाला डालो और एक पतली रंग का उपयोग, जीवाणु दो 50 मिलीलीटर ट्यूबों में गोली स्कूप. कोशिकाओं कुछ मिनट के लिए centrifugation द्वारा फिर से pelleted किया जा सकता है.
        नोट: प्रत्येक 1.8 एल संस्कृति दो बैक्टीरिया छर्रों, प्रत्येक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक का परिणाम देगा.
      3. प्रोटीन अलगाव तक -80 सी में स्टोर छर्रों.
      </ ली>

    6. अलगाव और पुनः संयोजक प्रोटीन का शुद्धीकरण

    प्रोटीन कदम 4.9 से एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के आधार पर घुलनशील क्षेत्र में स्थित है, तो "मूल अलगाव" का उपयोग किया जाएगा, लेकिन अघुलनशील प्रोटीन "nonnative अलगाव" प्रक्रियाओं के लिए प्रदर्शन किया जाएगा: ध्यान दें.

    1. सेल
      1. Nonnative
        1. निकालें ई. तब्दील कोली गोली -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से, और प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 20 मिलीलीटर lysis / धो बफर (तालिका 1) जोड़ें.
        2. भंवर और यह thaws और किसी भी बड़ा हिस्सा बिना बफर समाधान में solubilizes तक जम गोली हिला. रात भर nutator पर सेते हैं. अगली सुबह, गोली अब बफर से प्रोटीन की अप्राकृतिकरण की वजह से एक चिपचिपा घोल होना चाहिए.
        3. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20,500 XG पर घोल अपकेंद्रित्र. अलगाव के लिए एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.
      2. प्राप्त तब्दील ई. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से कोलाई गोली.
      3. 30 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब lysis बफर (तालिका 1) जोड़ें, और vortexing और कड़ाई झटकों से जमे हुए गोली बेदखल. बर्फ पर गोली रखें.
      4. 1-2 मिनट के लिए 100% आयाम पर 70% इथेनॉल के साथ sonicator जांच धो लें. फिर ultrapure पानी के साथ दोहराएँ.
      5. Sonicate बैक्टीरिया 5 मिनट (10 मिनट की कुल बीता समय) के लिए बर्फ पर जबकि गोली.
        1. सेकंड बंद on/30 30 सेकंड की पल्स के साथ 30% आयाम पर sonicator सेट करें.
        2. बॉब अपकेंद्रित्र ट्यूब और पूरी तरह से सेल गोली को तोड़ने के क्रम में sonication के अंतराल के दौरान नीचे. कुल गुजरे समय की समाप्ति पर कोई दिखाई जीवाणु एक चिपचिपा, चिपचिपा घोल छोड़ने गोली होना चाहिए.
        3. विभिन्न प्रोटीन isolations के बीच sonicator जांच को साफ करने के साथ ही कदम 6.1.2.3 में वर्णित के रूप में 70% इथेनॉल और ultrapure पानी का उपयोग भंडारण के लिए.
        30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,500 XG पर घोल अपकेंद्रित्र. अलगाव के लिए एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.
  10. नी NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी
    1. Nonnative
      1. जोड़ें 1 मिलीलीटर नी 2 + NTA प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब (1.8 एल संस्कृति के लिए 2 मिलीलीटर राल कुल) के लिए राल समाधान और nutator पर कम से कम 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं.
      2. आत्मीयता स्तंभ में घोल डालो और समाधान बेकार बीकर में पूरी तरह से पानी निकलने की टोंटी वाल्व के माध्यम से ड्रिप करने की अनुमति.
      3. प्रत्येक धोने के लिए lysis / धो बफर के 10 एमएल के साथ 10 washes के प्रदर्शन.
        1. पहले दो washes के लिए, अतिरिक्त राल हटाने और फिर स्तंभ में डालना अपकेंद्रित्र ट्यूब 10 एमएल जोड़ें. अतिरिक्त washes के स्तंभ को सीधे जोड़ा जा सकता है.
        2. प्रत्येक धोने के बाद, एक गिलास सरगर्मी छड़ी के साथ राल हलचल. धोने बेकार बीकर में भरी जाने के बाद, अगले 10 मिलीलीटर जोड़ा जा सकता है.
      4. बाद पूरी तरह से डॉ. धोनेके माध्यम से आईपीएस, करीब पानी निकलने की टोंटी वाल्व, बेकार बीकर को हटाने और प्रोटीन संग्रह के लिए 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ बदलें.
      5. क्षालन बफर (तालिका 1) के 15 मिलीलीटर जोड़ें और हलचल अप राल, समाधान 5 मिनट के लिए बैठने के लिए अनुमति देता है. ओपन पानी निकलने की टोंटी वाल्व और जमा क्षालन. एक अतिरिक्त 15 मिलीलीटर के साथ फिर से दोहराएँ.
    2. देशी
      1. निम्नलिखित मानकों समायोजित छोड़कर (कदम 6.2.1.1-6.2.1.4) ऊपर nonnative क्रोमैटोग्राफी आकर्षण का पालन करें:
        1. नी 2 nutator पर कम से कम 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस + NTA राल समाधान सेते हैं.
        2. उचित धो बफर (तालिका 1) का प्रयोग करें.
      2. क्षालन बफर (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए राल के साथ सेते हैं.
        1. ओपन पानी निकलने की टोंटी वाल्व और समाधान का सबसे जब तक क्षालन इकट्ठा के माध्यम से dripped गया है.
        2. 96 अच्छी तरह से थाली खाली करने के लिए 90 μl / अच्छी तरह से ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक जोड़ें. प्रत्येक क्षालन की अनुमति के बाद इतनी के 10 μlअच्छी तरह से 90 μl ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक युक्त में स्तंभ से ड्रिप lution.
        3. ब्रैडफोर्ड परख नहीं रह प्रोटीन (रंग साफ करने के लिए हल्के नीले रंग के लिए गहरे नीले रंग से चला जाता है) का पता लगाता है जब तक एक समय में 5 मिलीलीटर क्षालन बफर जोड़ने जारी. यह आमतौर पर 4-5 क्षालन मात्रा में लेता है.
  11. डायलिसिस / Renaturation
    1. 4 डिग्री सेल्सियस में nonnative (renaturation) और देशी डायलिसिस बफ़र्स (1 टेबल) और दुकान
      नोट: डायलिसिस buffers की पीएच लक्ष्य प्रोटीन की isoelectric बिंदु (पीआई) द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. अंगूठे प्रोटीन का एक नियम उनके पीआई मूल्यों से ऊपर या नीचे कम से कम एक पूर्ण बिंदु बफर होना चाहिए.
    2. उपयुक्त आणविक वजन कटौती (Sema3A के लिए NGF और 50,000 MWCO के लिए 25,000 MWCO) के साथ डायलिसिस टयूबिंग के मूल निवासी और nonnative elutions स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए संबंधित डायलिसिस बफर 1 में प्रत्येक प्रोटीन नमूना प्लेस और फिर संबंधित बफर 2 से अधिक के साथ की जगह4 डिग्री सेल्सियस पर रात
      नोट: प्रोटीन उचित refolding और जगह लेने के लिए बफर आदान प्रदान के लिए कम से कम 4 घंटे के लिए प्रत्येक बफर में dialyzed होने की जरूरत है.
    3. अपकेंद्रित्र स्पिन concentrators का उपयोग कम से कम 5 मिलीलीटर dialyzed प्रोटीन elutions ध्यान लगाओ.
      नोट: प्रोटीन आगे तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) का उपयोग कर शुद्ध किया और फिर से ध्यान केंद्रित कर सकते हैं.
  12. फ्रीज एक preweighed microcentrifuge ट्यूब में एक 10-50 मिलीलीटर नमूना सुखाने द्वारा प्रोटीन एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) निर्धारित करते हैं.
    1. वैकल्पिक: सी एल पथ की लंबाई है जहां एक 280nm / εl, =: विलुप्त होने गुणांक का निर्धारण, ε, प्रोटीन की कि एकाग्रता बीयर-Lambert के कानून का उपयोग 280 एनएम पर एक नमूना के absorbance को मापने के द्वारा भविष्य isolations में निर्धारित किया जा सकता है.

7. शुद्ध प्रोटीन की Biotinylation

  1. 10,000 MWCO डायलिसिस कैसेट एजी में प्रोटीन Dialyze10 मिमी Tris ainst (= पीएच 8.0), 6 परिवर्तन की कुल के साथ बफर हर 4 घंटे बदल रहा है.
  2. Biotinylation के लिए 2 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों को (अब 10 मिमी Tris बफर में) पुनः संयोजक प्रोटीन स्थानांतरण.
  3. एक बायोटिन प्रोटीन ligase किट का उपयोग कर Biotinylate प्रोटीन.
  4. 3 बफर के साथ 10,000 MWCO डायलिसिस कैसेट का उपयोग पीबीएस (= पीएच 7.4) के खिलाफ प्रोटीन Dialyze 2 दिनों के लिए एक दिन में बदल जाता है.
  5. एक quantitation किट का उपयोग प्रोटीन का प्रतिशत biotinylation निर्धारित करते हैं.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस या लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान पर 6.4 और दुकान में वर्णित के रूप में फिर से एकाग्रता का निर्धारण.

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Representative Results

क्लोनिंग और टेस्ट अभिव्यक्ति

चढ़ाना ठीक से किया जाता है, एक अलग कालोनियों प्रतिरूप तब्दील बैक्टीरिया की कोशिकाओं (चित्रा 2A) तोड़ के अवसरों को बढ़ाने के रूप में करना चाहिए. बहुत अधिक सेल चढ़ाया जाता है, तो हालांकि, प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस या परिवर्तन पर भी लंबे समय incubated हैं कालोनियों अगर प्लेट कवर या कोशिकाओं का बड़ा समुच्चय (आंकड़े 2 बी और 2 सी) के रूप में हो सकता है, संदिग्ध है. परीक्षण अभिव्यक्ति के दौरान, NGF और Sema3A पहले 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए प्रेरित किया और एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण दोनों प्रोटीन घुलनशील अंश (चित्रा 2 डी) में स्थित थे निर्धारित किया गया है. प्रोटीन अभिव्यक्ति निष्पक्ष और इसलिए 18 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रेरण के साथ एक और परीक्षण अभिव्यक्ति की जांच कर रहा था. Sema3A (चित्रा 2 ई) के साथ कोई उल्लेखनीय अंतर था जबकि NGF, घुलनशील अंश में बेहतर अभिव्यक्ति में हुई.

"> अलगाव, शोधन और Biotinylation

NGF और Sema3A दोनों ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है और शोधन के लिए FPLC स्तंभ के माध्यम से चलाने के रूप में देशी अलगाव तकनीक का उपयोग कर अलग किया गया. इसके अतिरिक्त इन पुनः संयोजक प्रोटीन को अलग किया गया और nonnatively शुद्ध किया. NGF परीक्षण अभिव्यक्ति दौरान घुलनशील अंश में था, भले ही देशी अलगाव प्रक्रियाओं दोनों 37 डिग्री सेल्सियस (2 एल की 4.57 मिलीग्राम / मुख्य संस्कृति) और 18 डिग्री सेल्सियस 2 एल (6.11 मिलीग्राम / मुख्य संस्कृति के बाद NGF की कम उपज का उत्पादन; चित्रा 3 ए, ठोस लाइनों) inductions. हालांकि, NGF के एक उच्च उपज renaturation साथ nonnative अलगाव के माध्यम से प्राप्त हुई थी (10.72 ± 1.8 मिलीग्राम / मुख्य संस्कृति एल 2 के, चित्रा 3 ए, धराशायी लाइन) 18 डिग्री सेल्सियस, रात भर प्रेरण के बाद. दूसरी ओर, nonnative अलगाव 8.61 ± 3.1 मिलीग्राम / मुख्य संस्कृति (चित्रा 3 देशी अलगाव के लिए एल 2 के साथ कोई Sema3A उत्पादन (चित्रा 3 बी, धराशायी लाइन) में हुई बी, ठोस लाइन). Sema3A 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरण के 4 घंटे के बाद देशी अलगाव लिया, जबकि एक परिणाम के रूप में, NGF, 18 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रेरण के बाद nonnative परिस्थितियों में पृथक किया गया FPLC चोटियों एकत्र किए गए थे, और NGF और Sema3A नमूने एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 3) के साथ विश्लेषण किया गया. Sema3A के लिए FPLC निर्गम (3B चित्रा) में मिलने वाली अतिरिक्त प्रोटीन चोटियों एकत्र और विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ के साथ और Sema3A आणविक वजन क्षेत्र में स्थित नहीं थे. चित्रा 3 बी में संकेत दिया Sema3A शिखर किया था कि वे सेल आधारित assays में कार्यात्मक रूप से व्यवहार नहीं किया, क्योंकि इन अंशों की संभावना सबसे अधिक गिरावट उत्पादों रहे हैं. प्रोटीन एक बीरा एंजाइम का उपयोग biotinylated और किसी भी unreacted प्रजातियों को दूर करने के dialyzed थे. Biotinylation एक बायोटिन मात्रा का ठहराव किट और फ्लोरोसेंट microplate रीडर के साथ तय हुई थी.

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चित्रा 1. एक ई. उपयोग प्रोटीन इंजीनियरिंग कोली अभिव्यक्ति प्रणाली. पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग की बुनियादी प्रक्रिया ई. में क्लोनिंग और अभिव्यक्ति के लिए एक प्लाज्मिड के डिजाइन शामिल कोलाई. तब्दील कालोनियों एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग के साथ चुना जाता है. छोटी परीक्षण अभिव्यक्ति लक्ष्य प्रोटीन का उत्पादन और घुलनशीलता अनुकूलन और पहचान के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. यह प्रक्रिया स्केल अप है बड़ा बैच cultivations (लीटर पैमाने पर) करने के लिए. क्रोमैटोग्राफी तरीकों वांछित इंजीनियर प्रोटीन को अलग और शुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है. ऐसे biotinylation के रूप में संशोधन बैच cultivations दौरान या शोधन के बाद हो सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. हेNGF और Sema3A की कसौटी पर अभिव्यक्ति ptimizing. (ए) में तब्दील ई. के 25 μl चढ़ाना कोलाई K12 कोशिकाओं छोटे अलग कालोनियों में हुई. एक व्यक्ति कॉलोनी परीक्षण अभिव्यक्ति के लिए चयनित किया जाना चाहिए. BL21 बदल कोशिकाओं के लिए समान कॉलोनी वितरण हो जाना चाहिए. (ईसा पूर्व) चढ़ाना 50 μl और K12 कोशिकाओं के 100 μl, क्रमशः, बैक्टीरियल कालोनियों की जनसंख्या में हुई. इन प्लेटों से तोड़ एक भी तब्दील सेल से ली गई एक कॉलोनी के चयन का एक कम संभावना हो सकती थी. बदल कोशिकाओं (डी) टेस्ट अभिव्यक्ति IPTG साथ 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए प्रेरित किया, और एसडीएस पृष्ठ NGF संलयन प्रोटीन (29 केडीए) और Sema3A संलयन प्रोटीन (91 केडीए) घुलनशील अंश में व्यक्त कर रहे हैं कि शो थे. हालांकि, Sema3A के लिए अभिव्यक्ति बढ़ाया नहीं है; 18 डिग्री सेल्सियस पर (ई) ओवरनाइट प्रेरण घुलनशील अंश में अभी भी NGF अभिव्यक्ति से पता चलता है.


FPLC का उपयोग NGF और Sema3A की चित्रा 3. शोधन. (ए) nonnative अलगाव 18 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्रेरण के बाद (धराशायी लाइन) देशी दोनों 4 घंटा में अलगाव, 37 डिग्री सेल्सियस और रात भर, 18 डिग्री सेल्सियस inductions की तुलना में बेहतर NGF पैदावार में हुई (ठोस लाइनों). (बी) Sema3A के लिए, 4 घंटा और देशी अलगाव हालत के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरण एक ही खेती मापदंडों पर nonnative अलगाव की तुलना में बेहतर पैदावार का उत्पादन किया. एसडीएस पृष्ठ FPLC शिखर संग्रह (ए) NGF और (बी) Sema3A दोनों के लिए (तीर) से पता चलता है. एक जेल निस्पंदन प्रोटीन मानक चोटियों की आणविक वजन वितरण पुष्टि करने के लिए चलाया गया था और केडीए में FPLC भूखंडों की पृष्ठभूमि में संकेत दिया है.

अलगाव बफर अवयव
Nonnative सेल / धो 6 एम GuHCl, 100 मिमी एच 2 Napo 4, 10 मिमी Tris बेस, 10 मिमी imidazole, = पीएच 8.0
क्षालन 6 एम GuHCl, 200 मिमी बर्फ एसिटिक एसिड (17.4 एम)
डायलिसिस (Renaturation) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस):
21.7 मिमी नाह 2 पीओ 4, 15.3 मिमी ना 2 4 HPO, 149 मिमी NaCl
बफर 1: पीबीएस, 0.2 एम GuHCl, 4 एल ultrapure पानी में 1.99 मिमी dithiothreitol (डीटीटी); = पीएच 7.4
बफर 2: 4 एल ultrapure पानी में पीबीएस, = पीएच 7.4
देशी Lysis 50 मिमी नाह 2 पीओ 4, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole, = पीएच 8.0
धोना 50 मिमीनाह 2 पीओ 4, 300 मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, = पीएच 8.0
क्षालन 50 मिमी नाह 2 पीओ 4, 300 मिमी NaCl, 250 मिमी imidazole, = पीएच 8.0
अपोहन फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस):
21.7 मिमी नाह 2 पीओ 4, 15.3 मिमी ना 2 4 HPO, 149 मिमी NaCl
बफर 1: पीबीएस, 4 एल ultrapure पानी में 1.99 मिमी डीटीटी, = पीएच 7.4
बफर 2: 4 एल ultrapure पानी में पीबीएस, = पीएच 7.4

तालिका 1. पुनः संयोजक प्रोटीन अलगाव बफ़र.

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Discussion

पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग कई विषयों तक फैला है कि एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है. यह कस्टम डिजाइन प्रोटीन की उच्च पैदावार के उत्पादन की अनुमति, लागत प्रभावी, tunable और एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है. यह डिजाइन और लक्ष्य प्रोटीन व्यक्त हमेशा सीधा नहीं है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. बेसल अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन स्थिरता वेक्टर, ई. के विशिष्ट विकल्पों पर निर्भर कोली सेल उपभेदों, पेप्टाइड टैग परिवर्धन और खेती मापदंडों. हमारे विशेष डिजाइन कसौटी अच्छी तरह से स्थापित ई. का इस्तेमाल कोली प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए उपभेदों. इसके अतिरिक्त, प्लाज्मिड वेक्टर एक T7 लाख प्रमोटर और स्थिर पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन होते हैं.

उच्च शुद्ध subcloned प्लाज्मिड प्राप्त करने के बाद, पहली बड़ी प्रक्रिया सफलतापूर्वक मेजबान सेल में लक्ष्य प्रोटीन बदलने और घुलनशीलता का निर्धारण करने के लिए हैप्रोटीन. टेस्ट अभिव्यक्ति लक्ष्य प्रोटीन के संश्लेषण के अनुकूलन करने के लिए सबसे अच्छा समय है. यह प्लाज्मिड युक्त बैक्टीरिया की कोशिकाओं के बेहतर चयन सुनिश्चित करने के लिए छोटे, अलग कालोनियों (2A चित्रा) बांधना जरूरी है. ऐसे में कम समय अवधि के लिए अगर प्लेट कालोनियों फिर से विभाजित करना restreaking या incubating के रूप में समस्या निवारण रणनीतियों बेहतर कॉलोनी संरचनाओं में सहायता कर सकते हैं. यह पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन मेजबान तनाव 36 पर तनाव लाती है कि कोई आश्चर्य की बात है. अभिव्यक्ति गरीब है, तो इस चरण के दौरान, ऐसे एंटीबायोटिक और IPTG एकाग्रता के साथ ही प्रेरण समय और तापमान जैसे कारकों इष्टतम लक्ष्य प्रोटीन (समीक्षा 37-38 देखने के लिए) प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. सर्वश्रेष्ठ अभिव्यक्ति 18 ˚ सी (चित्रा 2 ई) में रात भर प्रेरण से हुई जहां इस NGF के लिए देखा था.

Sema3A देशी स्थितियों के लिए प्रोटीन के उत्पादन में हुई लेकिन nonnativई अलगाव कोई प्रोटीन उत्पादन (3B चित्रा) से पता चला है. NGF के मुख्य संस्कृतियों 18 ˚ सी में 37 ˚ सी के साथ ही रात भर 4 घंटे के लिए प्रेरित किया और देशी परिस्थितियों में अलग थे. FPLC शुद्धि 18 ˚ सी (चित्रा 3) में रात भर प्रेरण के बाद nonnatively अलग थे कि मुख्य संस्कृतियों की तुलना में NGF की एक कम उपज का उत्पादन किया. समावेश शरीर में प्रोटीन के गठन आम तौर पर renaturation कभी कभी मुश्किल और हमेशा सफल नहीं है के बाद से अवांछनीय माना जाता है. यह घुलनशील प्रोटीन दृश्यों 39-41 के अलावा सहित प्रोटीन विलेयता बढ़ाने के लिए तकनीक का विकास करने के लिए प्रेरित किया है. हालांकि, प्रोटीन समावेश शरीर में पृथक जबकि गठनात्मक राज्यों के रूपों के अधिकारी को दिखाया गया है, और इस तरह के कम प्रेरण तापमान के रूप में मानकों इन सक्रिय संरचनाओं 42-46 बनाए रखने में मदद. एक प्रोटीन केवल अघुलनशील रूप में व्यक्त किया जा सकता है जब यह फिर से करने के लिए आमतौर पर संभव हैहम पहले से 21 की सूचना दी है के रूप में बहुत कम उपज हानि के साथ सरल तकनीक का उपयोग अलगाव के बाद प्रकृति प्रोटीन.

हम सफलतापूर्वक इंजीनियर और एक ई. का उपयोग biotinylatable प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए कैसे पता चला है कोलाई क्लोनिंग और मेजबान 2 एल यह के बारे में 8-10 मिलीग्राम / मुख्य संस्कृति उपज के रूप में अभिव्यक्ति प्रणाली (चित्रा 1) नई पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन जब घटनाओं के समग्र अनुक्रम ही रहता है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन, प्रत्येक कस्टम बनाया प्रोटीन विशेष रूप से शुद्ध उत्पाद की सबसे अधिक उपज का उत्पादन करने के लिए कैसे निर्धारित करने के लिए मामले के आधार द्वारा एक मामले पर इलाज किया जाना चाहिए. हम NGF और Sema3A एक ही खेती प्रणाली और कैसे उनके उत्पादन का अनुकूलन करने में अलग तरीके से व्यवहार कैसे पता चला है. इसके अलावा, हम वर्तमान में एक और ई. का उपयोग कर रहे हैं रहने के महत्व का प्रदर्शन, अन्य प्रोटीन लक्ष्य के लिए विवो 47 में biotinylate सकते हैं कि कोलाई बी मेजबान तनावजी पुनः संयोजक प्रोटीन इंजीनियरिंग के बारे में चल रही प्रगति और संशोधनों पर अच्छी तरह से वाकिफ.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक इस काम का समर्थन किया है कि धन के लिए Akron विश्वविद्यालय को स्वीकार करना होगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% Chem-Impex International 127 100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol Chem-Impex International 642 250 ml
Acetic acid, glacial EMD AX0073-9 2.5 L
Agar Bioshop AGR001.500 500 g
Ampicillin sodium salt  Sigma-Aldrich A9518 25 g
Antifoam 204 Sigma-Aldrich A6426 500 g
Barstar-NGF pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 1 ml; Expression Host
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916 500 ml
BugBuster Novagen 70922-3 100 ml
Gel filtration standard Bio-Rad 151-1901 6 vials
Glycerol Bioshop GLY001.1 1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride Chem-Impex International 152 1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88222 100 ml
Hydrochloric acid EMD HX0603-3 2.5 L
Imidazole  Chem-Impex International 418 250 g
IPTG Chem-Impex International 194 100 g
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface Chem-Impex International 270 500 g
LB Broth   Sigma-Aldrich L3022 1 kg
NovaBlue Competent Cells Novagen 69825 1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK 10 pack
Potassium Chloride Chem-Impex International 01247 1 kg
Sema3A-pET-21a(+) GenScript USA Inc. 4 µg
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 1 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886-1KG 1 kg
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-500 500 g
Sodium phosphate diabasic Sigma-Aldrich S5136-500G 500 g
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 500 g
Terrific Broth Bioshop TER409.5 5 kg
Tetracycline hydrochloride Chem-Impex International 667 25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x Bio-Rad 1610732 1 L
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503 1 kg
Tryptone, pancreatic EMD 1.07213.1000 1 kg
Yeast extract, granulated EMD 1.03753.0500 500 g
 ÄKTApurifier10 GE Healthcare 28-4062-64 Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000 MAXQ 4000
BirA500 Avidity BirA500 Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette Thermo Scientific 66380 Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories 132127, 132129 MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923 GE Healthcare 11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit Invitrogen 1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C GE Healthcare 18-6083-13
Fraction Collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00 Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator  VWR 13271-102 Model 1156D
Heating Oven FD Series Binder Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg GE Healthcare 17-1069-01 Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge Beckman Coulter 393126
JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055
JLA 8.1 Rotor Beckman Coulter 969329 Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor Beckman Coulter 368690
Laminar Flow Hood Themo Scientific 1849 Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader TECAN infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 165-8004 4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels Bio-Rad 456-9036 Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column Bio-Rad 737-2512 49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit Omega Bio-Tek D6943-01
PowerPac HC Power Supply Bio-Rad 164-5052 250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes VWR 3119-0050 50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators Corning 431488, 431483  20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service GenScript USA Inc. Protein Services
Ultrasonic Processor  Cole-Parmer 18910445A Model CV18
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236 Model G560

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References

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तंत्रिका ऊतक उत्थान के लिए घुलनशील और अघुलनशील Biotinylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति, अलगाव, और शोधन
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McCormick, A. M., Jarmusik, N. A.,… More

McCormick, A. M., Jarmusik, N. A., Endrizzi, E. J., Leipzig, N. D. Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e51295, doi:10.3791/51295 (2014).

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