Abstract
reconstruction du volume d'histologie facilite l'étude de la forme 3D et le changement de volume d'un organe au niveau des macrostructures constituées de cellules. Il peut également être utilisé pour étudier et valider de nouvelles techniques et des algorithmes d'imagerie médicale volumétrique et thérapies. Création d'atlas 3D à haute résolution des différents organes 1,2,3 est une autre application de la reconstruction du volume de l'histologie. Ceci fournit une ressource pour l'enquête structures tissulaires et la relation spatiale entre les différentes fonctions cellulaires. Nous présentons une approche d'enregistrement d'image pour la reconstruction du volume de l'histologie, qui utilise un ensemble d'images de côté d'îlot optiques. Le volume de l'histologie reconstruite représente une forme fiable de l'échantillon traitées sans erreur propagée d'inscription post-traitement. Les hématoxyline et éosine (H & E) sections colorées de deux glandes mammaires de souris ont été enregistrés à leurs images correspondantes du côté d'îlot en utilisant des points limites extraites de l'éditionges de l'échantillon en histologie et du côté d'îlot images. La précision de l'enregistrement a été évalué visuellement. L'alignement des macrostructures des glandes mammaires a également été évaluée visuellement à haute résolution.
Cette étude définit les différentes étapes de ce pipeline d'enregistrement d'image, allant de l'excision de la glande mammaire par l'intermédiaire de la reconstruction 3D du volume de l'histologie. Bien 2D images histologiques révèlent les différences structurelles entre les paires de sections, le volume de l'histologie 3D permet de visualiser les différences de forme et de volume des glandes mammaires.
Introduction
IGFBP7 (insuline like growth factor protéine de liaison 7) est un membre de la famille des protéines IGF-contraignant, et a été montré pour se lier au récepteur de l'IGF1 4. Régulation à la baisse de IGFBP7 est connu pour être en corrélation avec un mauvais pronostic dans le cancer du sein 5, tandis que la réintroduction de IGFBP7 dans des modèles de xénogreffe de tumeur inhibe fortement la croissance des tumeurs par le biais 6 induction de l'apoptose et la sénescence cellulaire 7. Afin d'étudier les effets de IGFPB7, une souris IGFBP7 nul a été créé 5 (données non publiées). Bien que ces souris ne développent pas de tumeurs, ils montrent des changements dans l'histologie de l'ovaire, du muscle et du foie, ainsi que des défauts dans la structuration du développement des glandes mammaires (données non publiées). Le phénotype défectueux a été indiqué que les souris nulles ont des portées moins nombreuses et sont incapables de soutenir plusieurs grandes portées (données non publiées).
Volumes d'histologie 3D ont le potentiel de fournir des informat utileion pour les analyses et l'évaluation quantitative et comparative des résultats pathologiques dans les images médicales volumétriques. Confocale tridimensionnelle, la microscopie à deux photons peut fournir à haute résolution cellule information morphologique de la glande à mesure locale 14, mais il a un champ de vision limité et la profondeur. reconstruction du volume d'histologie fournit plus d'informations sur une plus grande étendue spatiale. En utilisant des approches traditionnelles de la distorsion est prévu au cours de la préparation de coupes histologiques, tels que le retrait, l'expansion, de larmes et de plis. Ces déformations, il est difficile d'enregistrer des images histologiques en série dans une pile 3D à reconstruire un volume 3D. Comme le nombre de sections consécutives avec des défauts augmente les similitudes entre les sections intactes est réduite et rend le processus d'enregistrement plus compliqué, par conséquent.
Différentes méthodes ont été proposées pour enregistrer les coupes histologiques et à créer un vo histologie continuelume. Certaines techniques dépendent de la variation d'intensité et 8, et d'autres sont basées sur la forme des sections 9. Pour certains spécimens les structures anatomiques peuvent être utilisés comme points de repère 10,11 ainsi que les méthodes d'enregistrement basé repère-12,13. Mais ces structures internes peuvent ne pas être détectable dans tout le volume et pour certains spécimens pas fiables structures anatomiques peuvent être identifiés. Certains groupes ont utilisé une approche d'inscription par paire et enregistré des images d'histologie consécutives un à l'autre à l'aide des contours ou des structures anatomiques 16-18. Enregistrement des coupes en série d'histologie à l'autre sans l'utilisation d'images de référence peut se propager erreur d'enregistrement et modifier la forme réelle du volume de l'histologie. Approche d'inscription par paire repose sur la cohérence de la forme des coupes histologiques et les structures internes à travers l'empilement des images; par conséquent, il nécessite échantillonnage dense de l'échantillon, quipeut-être pas toujours possible, par exemple, pour les échantillons cliniques.
Dans ce pipeline, nous utilisons des images du côté d'îlot comme un ensemble d'images de référence pour la reconstruction du volume de l'histologie 19. Images du côté d'îlot sont prises des blocs de tissus de paraffine après montage sur le microtome et avant chaque section est coupée. Ainsi, les dommages à l'individu des coupes en série coupe n'interfère pas avec l'enregistrement des coupes en série 8,11,15. Nous capturons les images du côté d'îlot d'une manière différente des autres groupes. Les images de visage de bloc optique sont obtenues par une lentille télécentrique pour éliminer ou minimiser le canon et la distorsion de perspective, ce qui se produit généralement lors de l'utilisation des lentilles de l'optique réguliers. C'est l'un des avantages de l'approche proposée par rapport aux autres méthodes publiées, qui effectuent l'imagerie de côté d'îlot à l'aide de lentilles ordinaires. Les images sont prises avec un léger angle oblique à utiliser la réflexion de la surface du bloc pour un rehaussement du contraste entre le tisssurface ue et de la paraffine et pour éliminer l'ombre du tissu en profondeur, sous la surface de la paraffine. Un filtre photographique est également utilisée pour polariser la lumière provenant de la surface du bloc et le tissu pour équilibrer le contraste 19. Afin de corriger le déplacement du bloc sur le microtome rotatif, de deux à trois trous sont percés dans les coins du bloc, qui sont facilement détectables dans les images du côté d'îlot. Les centres de gravité de ces trous sont utilisés avec inscription rigide à base de point de repère pour aligner les images du côté d'îlot.
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Protocol
1. Spécimen
- Exciser chirurgicalement les glandes mammaires de type sauvage CDH1 ainsi que des souris IGFBP7 nulle ou trois jours après le début de la lactation.
- Répartir les glandes sur des lames de verre pour aider à retrouver natif glande mammaire morphologie.
2. Fixation et Traitement des tissus
- Fixer les glandes mammaires chez neutre tamponné 4% PFA O / N à 4 ° C.
- Conserver les glandes éthanol à 70% avant le traitement des tissus.
- Transférer les glandes de petites cassettes de traitement des tissus.
- Traiter les tissus à l'aide d'un processeur de tissus automatisé
- Déshydrater les tissus dans l'augmentation de l'éthanol et des bains de xylène de 70% d'éthanol pendant 45 minutes, deux fois dans l'éthanol 95% pendant 45 minutes, 3 fois dans 100% d'éthanol pendant 1 heure et 2 heures dans du xylène pendant 45 min.
- Imprégner les tissus de paraffine 3 fois pendant 1 heure chaque dans le vide avec une pression appliquée.
- Incluez les tissus en paraffine pour former des blocs, Pour la coupe.
3. Histologie et d'îlot Imaging
- Couper les blocs de paraffine en utilisant un microtome rotatif jusqu'à ce que l'excès de paraffine est retirée.
- Utiliser une fraiseuse verticale pour percer des trous de 1 mm dans au moins deux coins du bloc de paraffine perpendiculaire à la cassette.
- Monter le bloc de tissu sur le microtome rotatif.
- Mettre en place le système d'imagerie de côté d'îlot 19 à l'avant du microtome.
- Image optique de côté d'îlot capturer avant la coupe.
- Couper des rubans de quatre sections à 5 um d'épaisseur sur le microtome.
- Transférer les rubans au bain d'eau froide.
- Séparer les deuxième et quatrième sections de ruban et les monter sur des lames de microscope. Choisir les deuxième et quatrième sections fournit un écart de 5 um entre les sections.
- Développez chaque section dans un bain d'eau chaude (48 o C) à dérider, puis re-monter sur la lame de microscope.
REMARQUE: CUtting, de montage, unwrinkling les sections provoquent des distorsions sur la section, telles que la déchirure, pli, le retrait et l'expansion. Ces artefacts compliquent l'enregistrement des sections histologiques. - Colorer les sections avec H & E en utilisant une coloration automatique.
- Lamelle les diapositives à l'aide d'une colleuse automatique.
- Numériser les diapositives à l'aide d'un scanner de diapositives de l'histologie numérique à la résolution d'intérêt. Pour ce protocole le grossissement est de 20x et la résolution est de 0,47 um.
- Bas-échantillonner les images d'histologie à la résolution des images du côté d'îlot, 18 um.
4. L'image Enregistrement
- Segmentation de l'image et de la sélection du point
- En images côté d'îlot de mesurer les valeurs de pixel des trous d'enregistrement et d'utiliser la valeur moyenne comme seuil fixe pour segmenter les trous d'enregistrement dans les coins du bloc de paraffine.
- Depuis quelques pièces supplémentaires pourraient aussi être segmentés parutilisant le seuil fixé, utiliser la circularité et la zone des objets segmentés pour trouver les trous et jeter les objets supplémentaires. Pour ce faire, écrire un petit code et trouver le rapport de (4π x surface) / (périmètre) 2 pour les objets segmentés. Ce ratio pour les objets ronds est 1.
- Pour chaque glande mammaire, sélectionner une image de côté d'îlot comme référence et aligner le reste des images du côté d'îlot à la référence à l'aide du centre des trous d'enregistrement et de techniques d'enregistrement basé repère.
- Pour les images alignées du côté d'îlot, un segment ou extrait du tissu de l'arrière-plan manuellement. Utilisez l'objet le plus importante dans le masque pour le reste du protocole.
- Pour H & E sections suivez les étapes ci-dessous pour la segmentation automatique.
- Utilisez Otsu technique de seuillage 20 images de segments de l'arrière-plan et créer des masques binaires des images d'histologie.
- Identifier et sélectionner l'objet le plus importante dans chaque masque en utilisant la histogram des objets marqués.
- Extraire les un pixel de large points limites de deux histologie et masques de côté d'îlot.
- Utilisez le code de la chaîne algorithme 21, pour représenter les points de la frontière par une séquence de linéaire par morceaux s'adapte.
- Inscription rigide initiale
- Utiliser les descripteurs de Fourier algorithme 22, pour trouver la première transformation rigide entre les points limites de l'histologie et de leurs images correspondantes du côté d'îlot. Cette première transformation comprend les facteurs traduction, rotation et échelle.
- Transformer chaque image avec l'histologie initiale transformée obtenue à partir de l'étape précédente.
- Raffinement de l'enregistrement rigide
- Retirer les sections de pointe de haute courbure du contour de l'histologie en utilisant un filtre de roulement à billes 23.
- Sélectionnez 500 points des points limites d'histologie restantes à l'aide de façon aléatoire de distribution uniforme.
- Transformer le lahistologie points limites aléatoires avec la transformation initiale obtenue à partir de descripteurs de Fourier.
- Sélectionner l'ensemble des points de la frontière du côté d'îlot et utiliser itératives points les plus proches (ICP) de l'algorithme 24 pour trouver la transformation rigide entre les points limites de côté d'îlot, de la destination et histologie points limites aléatoires.
- Transformer les images histologiques alignées obtenues à partir de l'étape précédente et de la pile d'images histologiques alignés crée le volume de l'histologie.
- Utiliser un logiciel de visualisation 3D pour créer une image visuelle du volume de l'histologie.
- Affichage de la pile des images au grossissement de 5x
- Bas-échantillonner les images d'histologie originaux 5x grossissement.
- Recadrage de la région d'intérêt dans l'une des images d'histologie.
- Calculer l'emplacement de cette région dans les autres images histologiques 5x utilisant la combinaison des transformations rigides provenant des deux étapes d'enregistrement.
- Recadrer la régions d'intérêt à la même région de la taille de toutes les autres images d'histologie.
- Enfin affiner l'alignement entre les régions manuellement. Écrire un programme qui se superpose deux images et permet de sélectionner les valeurs de rotation et de translation de l'une des images sur l'autre, puis enregistre l'image transformée lorsque l'alignement est acceptée.
- Voir les piles des régions d'histologie 5x alignés en utilisant un logiciel de visualisation 3D.
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Representative Results
Un écueil de techniques de microscopie traditionnels est que la compréhension d'un organe à l'échelle microscopique est limitée à un champ de vision à la fois. Même "divulgation total" diapositives, qui fournissent des sections entières de diapositives, ne parviennent pas à fournir des informations en trois dimensions. Avec le développement de la coulisse ensemble, les technologies de numérisation dynamiques, notre capacité à voir un article dans sa totalité a augmenté, mais l'extrapolation structures nécessite reconstruction 3D du volume de l'histologie.
Afin de mieux caractériser l'insuffisance de la souris IGFBP7 nulle, reconstruction 3D des glandes mammaires ont été effectuées sur les glandes excisées 3 jours après le début de la lactation. Figure 1 montre le pipeline de l'approche proposée pour la reconstruction de l'histologie 3D. Les images du côté d'îlot sont d'abord alignés à l'aide des trous dans les coins du bloc de paraffine. Figures 2A-B montrent le volume du côté d'îlot de type sauvage et nulles pour mamm IGFBP7glandes ary respectivement. Les images histologiques sont ensuite déposées par leurs images de côté d'îlot alignés correspondant à reconstruire les volumes d'histologie. Figures 3A-B montrent les volumes d'histologie reconstruites du type sauvage et des glandes mammaires IGFBP7 nulles. En regardant l'ensemble des structures (vidéos A et B), nous pouvons voir la différence de taille entre les glandes de type mutant et sauvage. Cependant, en utilisant l'approche décrite ici, il devient évident que cette différence de taille est en longueur et en largeur mais curieusement pas la profondeur. Pour les glandes utilisées dans cette expérience pilote, la glande de type sauvage était de 1,06 mm de profondeur, alors que le presse-IGFBP7 nulle était de 1,02 mm de profondeur. L'autre phénotype immédiatement perceptible est la différence dans les composants du stroma des deux glandes, tel que marqué par coloration à l'éosine (zones roses). Les glandes de type sauvage ont peu de tissu stromal, tandis que les null-glandes semblent être principalement tissu stromal. Cette différence est particulièrement évidente lors de la visualisation des vidéos C et D. Levidéos ne contiennent que des cellules nucléées (coloration à l'hématoxyline), à partir de ces vidéos, nous pouvons voir que la glande nulle maintient sa densité, tandis que la glande de type sauvage semble contenir des structures glandulaires principalement. L'espacement entre les sections de vidéos A à D a été augmenté à deux fois l'écartement d'origine pour faciliter la visualisation. Pour approfondir ce, les images étaient alignés près du ganglion lymphatique dans une résolution plus élevée, ce qui nous permet de voir comment les glandes évoluent dans des coupes en série. Dans la glande de type sauvage, nous pouvons voir les grandes structures, qui ont été remplis avec du lait (vidéos E et F). En revanche, la glande IGFBP7 nul a quelques structures bien développées. En outre, ces structures étaient remplis de cellules de fibroblastes.
Comme un défaut majeur avec la souris de l'IGFBP7-nulle est la capacité à maintenir de grandes portées, il est évident par la comparaison a présenté que la différence de structure entre le type sauvage et nulles glandes pourrait contribuerle phénotype observé à 25. Le volume alvéolaire est fortement réduite dans les null-glandes indiquant le volume de lait insuffisante pour nourrir de grandes portées. Nous avons déterminé que le volume total de la glande de type sauvage a été 82,8879 mm 3, tandis que la glande nulle mesure ne 19,6291 mm 3.
Figure 1. Schématique représentant les étapes impliquées dans le processus de reconstruction 3D. Quatrième inguinaux glandes mammaires de souris ont été utilisés comme exemples. Les glandes mammaires ont été récoltées à partir des souris normales et nuls, alors traité et inclus en paraffine. des trous d'enregistrement ont été percés dans les blocs de paraffine, suivie par le bloc imagerie faciale et de coupes sériées des glandes. Les articles ont été récupérés dans les rubans de quatre sections. La première partie a été bloc-face imagée avant la coupe (outl violetine), tandis que le 2 e et 4 e sections de contour (rouge) ont été choisis pour coloration H & E et de numérisation. images de visage de bloc ont été alignées (en utilisant les trous d'enregistrement) et segmentés manuellement. Sections H & E ont été numérisées à une résolution 20x alors sous-échantillonné; ces images ont été segmentées automatiquement. Les deux séries d'images segmentées ont été soumises à une sélection de point limite et d'enregistrement. Les sorties sont volumes histologiques 3D ainsi que les zones à haute résolution. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Volume d'îlot. Des images optiques du bloc de paraffine monté sur le microtome sont obtenus avant chaque section est coupée. Le barycentre des trous percés à l'les coins du bloc de paraffine est utilisée pour aligner les images du côté d'îlot et de créer le volume de côté d'îlot. Image (A) montre le type sauvage glande mammaire à 3 jours après l'induction de la lactation et (B) montre le même point dans le temps pour la glande mammaire IGFBP7 nulle. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Volume de l'histologie. Les images d'histologie inscrits à leurs images correspondantes de côté d'îlot alignés pour reconstruire le volume de l'histologie. (A) de type sauvage glande et (B) de la glande mammaire IGFBP7 nul, 3 jours après la lactation induction. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons développé un enregistrement flux de travail d'image à reconstruire un volume d'histologie 3D de série d'images d'histologie 2D, qui ne nécessitent pas de points de repère internes choisis au hasard ou marqueurs fiduciaires implantés dans le tissu, ce qui pourrait fausser le tissu. Par le procédé décrit, des images du côté d'îlot optiques elles-mêmes sont utilisées comme images de référence avant la coupe. Nous utilisons des trous percés dans extérieures du bloc de paraffine afin d'aider à l'alignement des images du côté d'îlot et pour corriger le mouvement transversal 2D du bloc de paraffine en face de la caméra. Les images histologiques 2D sont alignés sur les images en 2D du côté d'îlot correspondant à prévenir la propagation de l'erreur d'alignement et de reconstituer un volume d'histologie précise, même lorsque des sections en série à partir de blocs défectueux résultent. Afin de rendre le flux de travail indépendant du type de tissu et la coloration histologique utilisée, les points de limite sont utilisées pour effectuer l'enregistrement. Ce point de based approche a l'avantage (par rapport aux approches basées sur l'intensité) qu'il est informatiquement moins exigeant et donc mieux à même de faire face à de très grandes images de pathologie numérique.
Un autre avantage de l'utilisation d'images du côté d'îlot à aligner les images d'histologie est que l'espacement entre les images d'histologie n'affecte pas la qualité de leur alignement pour créer le volume de l'histologie. Ceci est important dans le contexte clinique, où l'espacement entre sections peut varier largement, souvent aussi grand que un demi-centimètre.
Tout au long de cet article, nous avons montré que l'approche est reproductible pour deux glandes mammaires différentes avec des structures et des variations d'intensité. Etant donné que la méthode utilise la limite des sections, le degré de variation entre les différentes glandes est petite. Auparavant, nous avons également montré la capacité de l'approche pour un autre modèle pré-clinique 19. Types de tissus comme différents ont différents p biomécaniqueropriétés, devrait l'erreur d'enregistrement de changer pour différents spécimens. Nous pensons que le pipeline est applicable aux spécimens assez solides, par exemple, xénogreffes de tumeurs humaines. Dans l'avenir, nous allons continuer à enquêter sur la précision de la conduite de la reconstruction 3D à l'aide d'autres spécimens, tels que le tissu mammaire humain.
L'un des autres facteurs limitants du flux de travail proposé est la segmentation manuelle des images du côté d'îlot. Cette limitation pourrait être éliminé par le développement d'une approche automatique de segmentation de texture, par exemple en utilisant un champ de Markov (MRF) 26,27 modèles à segmenter les spécimens de l'arrière-plan des images du côté d'îlot.
Grâce à l'examen de type sauvage et des glandes mammaires IGFBP7 nulles, nous avons pu identifier des différences dans la structure et la composition des glandes en 3D à travers un composite complet des sections individuelles de deux glandes. Cette technique assistée en outre caractéterizing le phénotype IGFBP7-nulle au niveau cellulaire, et ont montré que des différences distinctes dans le volume alvéolaire peuvent contribuer à certains des défauts observés dans ce modèle 25.
La capacité importante de cette approche est qu'elle est indépendante du type de tissu et des variations d'intensité et par conséquent il peut être utilisé pour reconstruire le volume de l'histologie des différents échantillons pré-cliniques et cliniques. Un des autres avantages de cette approche est qu'elle ne dépend pas d'un colorant spécifique. Cette approche basée contour est compatible avec toute tache, tant il offre un contour clair de la section entière ou un contour clair de la structure, qui est détectable dans les deux histologie et images du côté d'îlot. L'étude de la forme de la tumeur, le volume, et l'hétérogénéité est une des applications cliniques de l'histologie volume 3D. Dans cet article, nous avons montré que l'approche proposée est capable de reconstruction du volume d'histologie 3D et peut être encore noused de comparaison, la visualisation et l'analyse des autres échantillons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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