Abstract
Reconstrução de volume Histologia facilita o estudo da forma 3D e variação de volume de um órgão a nível de macroestruturas formadas por células. Ele também pode ser usado para investigar e validar novas técnicas e algoritmos em imagiologia médica volumétrico e terapias. Criação de atlas de alta resolução em 3D de diferentes órgãos 1,2,3 é outra aplicação de reconstrução do volume histologia. Isto fornece um recurso para investigar estruturas de tecidos e as relações espaciais entre várias características celulares. Nós apresentamos uma abordagem registro de imagens para a reconstrução do volume histologia, que utiliza um conjunto de imagens blockface ópticos. O volume histologia reconstruída representa uma forma confiável do espécime processados com nenhum erro de registro de pós-processamento propagada. Os (H & E) cortes corados hematoxilina e eosina de duas glândulas mamárias do rato foram registrados às suas imagens blockface correspondentes usando pontos de fronteira extraídos do edges do espécime em histologia e blockface imagens. A precisão do registro foi avaliada visualmente. O alinhamento das macroestruturas das glândulas mamarias também foi avaliada visualmente em alta resolução.
Este estudo delineia as diferentes etapas deste gasoduto registro de imagens, que vão desde a excisão da glândula mamária por meio de reconstrução 3D volume de histologia. Enquanto as imagens de histologia 2D revelar as diferenças estruturais entre pares de seções, o volume de histologia 3D proporciona a capacidade de visualizar as diferenças de forma e volume das glândulas mamárias.
Introduction
IGFBP7 (insulina como factor de crescimento da proteína de ligação 7) é um membro da família de proteínas de ligação a IGF, e tem sido demonstrado que se ligam ao receptor de IGF1 4. Down-regulação da IGFBP7 é conhecido por ser correlacionados com mau prognóstico no câncer de mama 5, enquanto a reintrodução de IGFBP7 em modelos de tumores Xenoenxerto inibe significativamente os tumores de crescimento de 6 a indução de apoptose e senescência celular 7. A fim de estudar os efeitos da IGFPB7, um mouse IGFBP7 nulo foi criado 5 (dados não publicados). Enquanto estes ratinhos não desenvolveram tumores, que mostram alterações na histologia do ovário, músculo e fígado, assim como defeitos na padronização do desenvolvimento da glândula mamaria (dados não publicados). O fenótipo defeituoso foi indicado pela primeira vez como os ratos nulos têm tamanho das ninhadas menores e são incapazes de sustentar várias ninhadas grandes (dados não publicados).
Volumes de histologia 3D têm o potencial de fornecer informat útilíon para análises quantitativas e comparativas e avaliação de achados patológicos em imagens médicas volumétricos. Confocal tridimensional, microscopia de dois fótons podem fornecer células de alta resolução informação morfológica da glândula em extensão local 14, mas tem um campo de visão limitado e profundidade. Reconstrução volume de Histologia fornece mais informações sobre uma extensão muito maior espacial. Usando abordagens tradicionais alguma distorção é antecipado durante a preparação dos cortes histológicos, como encolhimento, expansão, lágrimas e dobras. Essas distorções dificultam a registar imagens histológicas de série em uma pilha 3D para reconstruir um volume 3D. À medida que o número de secções consecutivas com defeitos aumenta as semelhanças entre as secções intactas é reduzida e, consequentemente, faz com que o processo de registo mais complicado.
Diferentes métodos têm sido propostos para registar cortes histológicos e criar um vo histologia contínualume. Algumas técnicas dependerá variações de intensidade de 8, e os outros são baseados na forma de secções 9. Para alguns espécimes as estruturas anatômicas podem ser usados como pontos de referência 10,11, juntamente com métodos de registo com base em marcos 12,13. Mas estas estruturas internas pode não ser detectável durante todo o volume e para algumas amostras sem estruturas anatómicas fiáveis podem ser identificados. Alguns grupos têm usado uma abordagem de registro de pares e registrou imagens de histologia consecutivos de um para outro usando contornos ou estruturas anatômicas 16-18. Registrando cortes histológicos de série para um outro sem o uso de imagens de referência podem propagar o erro de registro e alterar a forma real do volume de histologia. Abordagem de registro de pares depende da consistência da forma dos cortes histológicos e as estruturas internas em toda a pilha de imagens; portanto, requer amostragem densa da amostra, o quepode nem sempre possível, por exemplo, para amostras clínicas.
Neste oleoduto usamos imagens blockface como um conjunto de imagens de referência para o volume de histologia reconstrução 19. Imagens Blockface são tomadas dos blocos de parafina do tecido após a montagem no micrótomo e antes de cada seção é cortada. Assim, os danos ao indivíduo cortes seriados corte não interfere com o registro de cortes seriados 8,11,15. Nós capturar as imagens blockface de uma maneira diferente dos outros grupos. As imagens da face do bloco óptico são obtidos por uma lente telecêntrica para eliminar ou minimizar a distorção do tambor e em perspectiva, que normalmente ocorre quando se usa lentes regulares em óptica. Esta é uma das vantagens da abordagem proposta em relação aos outros métodos publicados, que realizam imagiologia blockface usando lentes normais. As imagens são obtidas com um ligeiro ângulo oblíquo para usar a reflexão da superfície do bloco, para aumento do contraste entre a tissue e parafina superfície e para eliminar a sombra do tecido em profundidade, abaixo da superfície da parafina. Um filtro fotográfico também é usada para polarizar a luz vinda a partir da superfície do bloco e o tecido para equilibrar o contraste 19. Para corrigir o deslocamento do bloco no micrótomo rotativo, 2-3 orifícios são perfurados nos cantos do bloco, que são facilmente detectáveis nas imagens blockface. Os centróides desses buracos são usados juntamente com registro rígido à base de referência para alinhar as imagens blockface.
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Protocol
1. Espécime
- Especial sobre o consumo das glândulas mamárias cirurgicamente de tipo selvagem CDH1, bem como camundongos IGFBP7 nulo três dias após a início da lactação.
- Espalhe as glândulas em lâminas de vidro para ajudar a recuperar a morfologia natural da glândula mamária.
2. Fixação e processamento de tecidos
- Corrigir as glândulas mamárias em neutro tamponado 4% PFA O / N a 4 o C.
- Armazenar as glândulas em etanol a 70% antes do processamento do tecido.
- Transferir as glândulas para pequenas cassetes de transformação de tecidos.
- Processar os tecidos utilizando um processador automático de tecido
- Desidratar os tecidos no aumento de etanol e de xileno banhos de etanol a 70% durante 45 minutos, duas vezes em etanol a 95% durante 45 minutos, três vezes em etanol a 100% durante 1 hora e duas vezes em xilol durante 45 minutos.
- Permear os tecidos com parafina 3 vezes para cada 1 hora em um vácuo com pressão aplicada.
- Incorporar os tecidos em parafina para formar blocos, Para o corte.
3. Histologia e Blockface Imagem
- Aparar os blocos de parafina utilizando um micrótomo rotativo até que o excesso de parafinas é removido.
- Use uma fresadora vertical para perfurar um milímetro furos em pelo menos dois cantos do bloco de parafina perpendicular à fita.
- Monte o bloco de tecido em micrótomo rotativo.
- Configure o sistema de imagem blockface 19 na frente do micrótomo.
- Capturar imagem blockface óptico antes da corte.
- Corte tiras de quatro seções em 5 mM espessura no micrótomo.
- Transferir as fitas para o banho de água fria.
- Separe as segunda e quarta partes da fita e cole-as em lâminas de microscópio. Escolhendo a segunda ea quarta seções fornece uma lacuna 5 mm entre as seções.
- Expanda cada seção em um banho de água quente (48 º C) para unwrinkle-lo, em seguida, re-montar-lo na lâmina de microscópio.
NOTA: Cutting, montagem, unwrinkling as seções causar algumas distorções no seção, como lágrima, dobra, contração e expansão. Esses artefatos complicar o registro dos cortes histológicos. - Mancha as seções com H & E usando um corante automática.
- Lamela os slides usando um coverslipper automática.
- Digitalize os slides usando um scanner de slides histologia digitais na resolução de interesse. Para este protocolo a ampliação for 20x ea resolução é de 0,47 m.
- Down-provar as imagens de histologia para a resolução das imagens blockface, 18 mM.
4. Registro da Imagem
- Segmentação de imagem e ponto de Seleção
- Em blockface imagens medir os valores de pixel para os furos de registo e utilizar o valor médio como um limite fixo para o segmento de furos de registo nos cantos do bloco de parafina.
- Uma vez que algumas peças adicionais também pode ser segmentado porutilizando o limiar fixo, utilizar a circularidade e a zona dos objectos segmentados para encontrar os furos e descartar os objectos adicionais. Para fazer isso, escrever um pequeno código e encontrar a relação de (4π x área) / (perímetro) 2 para os objetos segmentados. Esta relação de objetos redondos é 1.
- Para cada glândula mamária, seleccionar uma imagem blockface como referência e alinhar o resto das imagens blockface para a referência, utilizando o centro dos furos de registo e de técnicas de registo baseados em marco.
- Para as imagens blockface alinhados, o segmento manualmente ou extrair o tecido a partir do fundo. Use o objeto mais considerável na máscara para o resto do protocolo.
- Para H & E seções siga os passos abaixo para a segmentação automática.
- Use Otsu técnica limiar de 20 a segmentar imagens do fundo e criar máscaras binárias das imagens histológicas.
- Identificar e selecionar o objeto mais considerável em cada máscara usando o histogram dos objectos etiquetados.
- Extraia os um pixel de largura pontos de fronteira de ambos histologia e máscaras blockface.
- Use o algoritmo de código Cadeia 21, para representar os pontos de fronteira por uma seqüência de linear por partes se encaixa.
- Registro rígida inicial
- Use Descritores de Fourier algoritmo 22, para encontrar o inicial rígida transformar entre os pontos de fronteira de histologia e suas imagens blockface correspondentes. Este inicial transformar inclui os fatores translação, rotação e escala.
- Transformar cada imagem histologia com a inicial transformada obtida no passo anterior.
- Refinamento do Registro rígida
- Remova as seções de alta ponta curvatura do contorno histologia usando um filtro bola rolar 23.
- Selecione 500 pontos a partir dos pontos de fronteira de histologia restantes utilizando aleatoriamente distribuição uniforme.
- Transformar o ahistologia pontos de fronteira aleatórios com a transformação inicial obtida a partir de descritores de Fourier.
- Selecione o conjunto de blockface pontos de fronteira e usar iterativos pontos mais próximos (ICP) algoritmo 24 para encontrar a transformação rígida entre os pontos de fronteira blockface, destino e histologia pontos de fronteira aleatórios.
- Transforme as imagens de histologia alinhados obtidos da etapa anterior e a pilha de imagens de histologia alinhados cria o volume histologia.
- Use um software de visualização 3D para criar uma imagem visual do volume histologia.
- Visualizando a pilha de imagens com ampliação de 5x
- Down-provar as imagens histológicas originais 5x ampliação.
- Cortar a região de interesse em uma das imagens de histologia.
- Calcula-se a localização da região em outras imagens histológicas 5x utilizando a combinação das transformações rígidas das duas etapas de registo.
- Corte a regions de interesse para a mesma região tamanho em todas as outras imagens histologia.
- Finalmente refinar o alinhamento entre as regiões manualmente. Escreva um programa que se sobrepõe a duas imagens e permite selecionar os valores de rotação e translação de uma das imagens mais o outro e, em seguida, salva a imagem transformada quando o alinhamento é aceito.
- Ver as pilhas de regiões histologia 5x alinhadas usando um software de visualização 3D.
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Representative Results
Uma armadilha de técnicas de microscopia tradicionais é que a compreensão de um órgão a nível microscópico é limitado a um campo de visão de cada vez. Mesmo "totais de divulgação" slides, que fornecem seções de slides inteiros, não fornecem informações tridimensional. Com o desenvolvimento de slides todo, tecnologias dinâmicas de verificação, a nossa capacidade de ver uma seção em sua totalidade aumentou, porém extrapolando estruturas 3D requer a reconstrução do volume histologia.
Para melhor caracterizar a deficiência do mouse IGFBP7 nulo, 3D-reconstrução das glândulas mamárias foram realizados em glândulas excisadas 3 dias após o início da lactação. Figura 1 mostra o pipeline da abordagem proposta para histologia reconstrução 3D. As imagens são blockface primeiro alinhadas utilizando os orifícios nos cantos do bloco de parafina. Figuras 2A-B mostram o volume blockface do tipo selvagem e mamm IGFBP7 nuloglândulas ary respectivamente. As imagens de histologia são então registradas por seus correspondentes imagens blockface alinhados para reconstruir os volumes de histologia. Figuras 3A-B mostram os volumes de histologia reconstruído do tipo selvagem e glândulas mamárias IGFBP7 nulos. Ao olhar para as estruturas globais (vídeos A e B), podemos ver a diferença de tamanho entre o tipo mutante e selvagem glândulas. No entanto, usando a abordagem aqui descrita, torna-se evidente que esta diferença de tamanho é em comprimento e largura, mas curiosamente não profundidade. Para as glândulas utilizados nesta experiência piloto, a glândula de tipo selvagem foi de 1,06 mm de espessura, enquanto a glândula IGFBP7 nulo foi de 1,02 mm de profundidade. O outro fenótipo imediatamente perceptível é a diferença em componentes do estroma das duas glândulas, como marcado pela eosina (áreas de rosa). As glândulas do tipo selvagem tem pouco tecido do estroma, enquanto os nulos-glândulas parecem ser predominantemente de tecido estromal. Esta diferença é especialmente evidente quando a visualização de vídeos C e D. Avídeos contêm apenas células nucleadas (coloração com hematoxilina), a partir desses vídeos, podemos ver que a glândula nulo mantém sua densidade, enquanto a glândula do tipo selvagem parece conter estruturas principalmente glandulares. O espaçamento entre as secções em vídeos A a D foi aumentada para o dobro do espaçamento original para auxiliar a visualização. Para investigar mais esta, as imagens foram alinhados perto do nó de linfa em maior resolução, isso nos permite ver como as glândulas estão mudando em cortes seriados. Na glândula de tipo selvagem que pode ver grandes estruturas, o que teria sido enchidos com o leite (vídeos E e F). Em contraste a glândula IGFBP7 nulo tem poucas estruturas bem desenvolvidas. Além disso, estas estruturas estavam cheias de células de fibroblastos-like.
Como um grande defeito com o mouse IGFBP7 nulo é a capacidade de sustentar grandes ninhadas, é evidente através da comparação apresentada que a diferença estrutural entre o tipo selvagem e glândulas nulos poderia contribuirpara o fenótipo observado 25. O volume alveolar é muito reduzida dentro dos nulos-glândulas que indicam o volume de leite insuficiente para alimentar grandes ninhadas. Determinou-se que o volume total da glândula do tipo selvagem foi 82,8879 milímetros 3, enquanto a glândula nulo apenas 19,6291 milímetros 3 medido.
Figura 1. Esquemático que descreve as etapas envolvidas no processo de reconstrução 3D. Fourth inguinais glândulas mamárias de ratinho foram utilizados como exemplos. Glândulas mamárias foram colhidas a partir de camundongos normais e nulos, então processado e incluído em parafina. Buracos de registro foram perfurados nos blocos de parafina seguidos de rosto imagem bloco e cortes seriados das glândulas. Os cortes foram recuperadas em fitas de quatro seções. A primeira parte foi de bloco enfrentou fotografada antes de seccionamento (outl roxoine), enquanto que a 2 ª e 4 ª seções (esboço vermelho) foram escolhidos para H & E coloração e digitalização. Imagens da face do bloco estavam alinhados (com buracos de registro) e segmentado manualmente. Secções H & E foram digitalizadas com resolução de 20x, em seguida, para baixo-amostrado; estas imagens foram automaticamente segmentado. Ambos os conjuntos de imagens segmentadas foram submetidos a seleção de ponto de fronteira e de registro. As saídas são volumes histológicas em 3D, bem como áreas de alta resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Volume Blockface. Imagens ópticas do bloco de parafina montado no micrótomo são obtidos antes de cada secção é cortada. O centróide dos orifícios perfurados nacantos do bloco de parafina é utilizada para alinhar as imagens blockface e criar o volume blockface. Imagem (A) mostra a glândula mamária do tipo selvagem em 3 dias após a indução da lactação e (B) mostra o mesmo ponto de tempo para a glândula mamária IGFBP7 nulo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Volume de Figura 3. Histologia. As imagens de histologia registrados para seus correspondentes imagens blockface alinhados para reconstruir o volume histologia. (A) do tipo selvagem glândula e (B) da glândula mamária IGFBP7 nulo, 3 dias após a indução da lactação. favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de registro das imagens para reconstruir um volume 3D a partir de histologia série de imagens de histologia em 2D, que não requer marcos internos selecionados aleatoriamente ou marcadores fiduciais implantados dentro do tecido, o que pode distorcer o tecido. Pelo método descrito, as próprias imagens blockface ópticos são usados como imagens de referência anteriores a corte. Usamos furos externos perfurados no bloco de parafina para auxiliar no alinhamento das imagens blockface e para corrigir o movimento transversal 2D do bloco de parafina em frente da câmara. As imagens da histologia 2D são alinhadas com as imagens blockface 2D correspondentes para prevenir a propagação do erro de registo e reconstruir um volume histologia preciso, mesmo quando as secções seriadas defeituosos resultam de blocos. A fim de tornar o fluxo de trabalho, independentemente do tipo de tecido e a histologia da mancha utilizado, pontos de contorno são utilizados para realizar o registo. Esta base de pontod abordagem tem a vantagem (sobre abordagens baseadas em intensidade), que é computacionalmente menos exigentes e, portanto, mais capaz de lidar com imagens muito grandes patologia digitais.
Outra vantagem de usar imagens blockface para alinhar as imagens de histologia é que o espaçamento entre as imagens de histologia não afeta a qualidade do seu alinhamento para criar o volume histologia. Isto é importante na prática clínica em que o espaçamento entre as secções pode variar amplamente, muitas vezes, tão grande como metade de um centímetro.
Ao longo deste trabalho nós mostramos que o método é reprodutível por duas glândulas mamárias diferentes, com diferentes estruturas e variações de intensidade. Desde que a abordagem utiliza a fronteira das secções, o grau de variação entre diferentes glândulas é pequena. Anteriormente, também demonstraram a capacidade de a abordagem de outro modelo pré-clínico 19. Como diferentes tipos de tecidos têm diferentes biomecânica propriedades, o erro de registro deverá mudar para diferentes espécimes. Nós pensamos que o gasoduto é aplicável aos espécimes bastante sólidos, por exemplo, tumores humanos transplantados. No futuro, vamos investigar mais a precisão do pipeline de reconstrução 3D usando outros espécimes, tais como tecido mamário humano.
Um dos outros factores limitantes do fluxo de trabalho proposto é a segmentação manual das imagens blockface. Essa limitação pode ser removida através do desenvolvimento de uma abordagem automática textura segmentação, por exemplo, utilizando Markov aleatória Campo modelos (MRF) 26,27 para segmentar as amostras do fundo em imagens blockface.
Através do exame do tipo selvagem e glândulas mamárias IGFBP7 nulos, fomos capazes de identificar diferenças na estrutura e composição das glândulas em 3D através de uma composição completa das seções individuais de ambas as glândulas. Esta técnica auxiliou na caracterização maisterizing o fenótipo IGFBP7-nula ao nível celular, e mostrou que as diferenças distintas em volume alveolar podem contribuir para alguns dos defeitos observados neste modelo 25.
A capacidade importante desta abordagem é que é independente do tipo de tecido e as variações de intensidade e, portanto, podem ser usadas para reconstituir o volume de histologia de diferentes espécimes pré-clínicos e clínicos. Uma das outras vantagens desta abordagem é que não está dependente de uma coloração específica. Esta abordagem baseada contorno é compatível com qualquer mancha, enquanto que proporciona um contorno nítido de toda a secção ou um contorno nítido de uma estrutura, que é detectável em ambos histologia e imagens blockface. A investigação do tumor forma, volume e heterogeneidade é uma das aplicações clínicas de histologia do volume 3D. Neste trabalho nós mostramos que a abordagem proposta é capaz de reconstrução do volume de histologia em 3D e pode ser ainda mais nosed para comparação, visualização e análise de outros espécimes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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