Summary
גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.
Abstract
חדירת יקוציט לתוך רקמת כבד אנושית היא תהליך נפוץ בכל המחלות הכבד דלקתיות המבוגרים. חדירה כרונית יכולה לנהוג הפיתוח של סיסטיק והתקדמות לשחמת כבדה. הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים גיוס יקוציט אל הכבד יכולה לזהות מטרות טיפוליות חשובות למחלת כבד. האינטראקציה מפתח במהלך גיוס יקוציט היא זה של תאים דלקתיים עם האנדותל בתנאים של לחץ גזירה. גיוס אל הכבד מתרחש בתוך ערוצי גזירה הנמוך של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאים בכבד סינוסי אנדותל (HSEC). התנאים בתוך sinusoids בכבד יכולים להיות סכמו על ידי מרוסס leucocytes בערוצים בשורה של monolayers HSEC אדם בספיקות מסוימות. בתנאים אלה leucocytes לעבור שלב קצר קשירה ואחרי הפעלה והידבקות משרד, ולאחריו שלב זחילה וגלגול הבא פני אנדותלשכבה. באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב, ניתן דמיינו כל צעד של 'מפל הידבקות' זה ונרשם ואחרי ניתוח מצב לא מקוון. תאי האנדותל או leucocytes ניתן קודם לכן במעכבי כדי לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות בתהליך זה.
Introduction
עכשיו זה מבוסס היטב כי גיוס יקוציט באופן כללי כדלקמן הפרדיגמה של מפל הידבקות הרב שלבי 1. זה כרוך בלכידתו של leucocytes מזורם דם על ידי תאי האנדותל המצפים את דפנות כלי הדם. בתחילה, leucocytes לעבור צעד מתגלגל שמתווך על ידי קולטנים selectin או חברי superfamily אימונוגלובולינים. זה מאפשר קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) הביע על פני השטח יקוציט כדי להיות מופעלים על ידי כמוקינים מוצגים על glycocalyx אנדותל. זה מוביל לשינוי של אישור integrin למדינת 'זיקה גבוהה' על פני השטח יקוציט ולעצור והידבקות משרד לאנדותל. הידבקות המשרד בעקבות כך על ידי שינוי צורה וזחילה של יקוציט על כלי השיט. השלב האחרון הוא גלגול דרך monolayer אנדותל, אשר יכול להתרחש דרך נתיבי paracellular או transcellular.
בעוד מפל הידבקות הרב שלבי לתארשל המנגנון הכללי של גיוס יקוציט בתוך הגוף יש הבדלים ספציפיים איברים. בכבד רוב גיוס יקוציט מתרחש בתוך sinusoids בכבד בניגוד לאיברים אחרים שבו גיוס בדרך כלל מתרחש בתוך venules פוסט הנימים 2. Sinusoids הכבד הם סביבת גזירה נמוכה וleucocytes לעבור צעד קשירה קצר לפני למצק הידבקות אשר selectin 2 עצמאיים. ערוצים אלה בשורה של האנדותל סינוסי בכבד שהוא רציף ומכיל fenestrae, הנקבוביות פתוח ננומטר 100-200 בקוטר, ואין קרום במרתף 3. הבהרת המנגנונים המולקולריים אשר מתווכים גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי כבד אנושי יכולה לזהות איבר מטרות טיפוליות ספציפיות למחלות כבד דלקתיות.
מבחני הידבקות זרימה הם כלים חיוניים בלימוד גיוס יקוציט. הם מאפשרים השחזור של recru יקוציטitment בנוכחות של מתח גזירה לנתח הידבקות תחת כוחות מוגדרים היטב. השימוש התכוף ביותר עבור assay הוא הידבקות יקוציט המחקר לmonolayers אנדותל בתרבית או מצעים מטוהרים. זרימת תאים זמינים באופן מסחרי משמשים לינקבו תאים בתנאים של זרימה למינרית בין שני משטחים שטוחים ולאחר מכן לדמיין את התהליך הדינמי של הידבקות במיקרוסקופ 4. קבוצות קודמות הוכיחו כי אינטראקציות דבקים מסוימות להתרחש רק תחת זרם ולא ניתן ללמוד במבחנים סטטיים 5,6.
יש לנו בשימוש בטכניקה זו כדי לשחזר את sinusoids הכבד וללמוד גיוס יקוציט בתנאים של לחץ גזירה נמוך. HSEC האנושי ראשוני בתרבית microslides וleucocytes אז יכול להיות perfused מעל monolayer זה בשיעור של זרימה מחושב לשחזר את מאמץ הגזירה בתוך sinusoids הכבד. מאמץ הגזירה הוא מתח שמוחל מקביל או משיק למשטח כמו מולosed למתח רגיל שהוא בניצב. כל נוזל שנע לאורך גבול יפעיל לחץ גזירה על גבול זה. מאמץ גזירה הוכח להיות מרכיב חיוני של גלגול הלימפוציטים 7. בתנאים אלה ניתן דמיינו בכל שלב של מפל ההידבקות על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. שיטה זו אפשרה תובנות חשובות הגיוס של leucocytes בתוך הכבד, כולל המחקר של מולקולות הדבקות קונבנציונליות 8, את התפקיד של כמוקינים וקולטנים chemokine 9-11, ומולקולות הדבקות טיפוסיות כגון הידבקות כלי דם חלבון -1 (VAP-1 ) 8,12 והלימפה נפוצה וקולט-1 (פיקח-1) 13 האנדותל של כלי דם. בעוד assay זה כבר מוזכר בכמה מהפרסומים של הקבוצה שלנו, התיאור שלה היה קצר ואנחנו צריכים לקחת את ההזדמנות הזאת כדי לספק צעד מפורט על ידי מדריך צעד כדי לעזור בפתרון בעיות ולמנוע טעויות טכניות בעת ניסיוןing assay. יתר על כן, יש לנו לאחרונה שיניתי את המקור של תאי microslide המאפשר שינויים מדויקים בלחץ גזירה. אנו מאמינים כי זה מרחיב את תחולתו של assay לתאי האנדותל ואחרים של מערכת חיסון. השיטה הבאה מתארת את ההכנה וטכניקה לביצוע assay הידבקות זרימה מבוססת עם תאים אנושיים בכבד סינוסי אנדותל וימפוציטים דם היקפיים.
Protocol
1. Microslide הכנה
- Precoat microslide שישה ערוץ עם סוג קולגן עכברוש זנבי (RTC, בדילול מלא PBS 1:100 נותן דילול עבודה של 220 מיקרוגרם / מיליליטר). זה מבוצע על ידי הזרקת 30 μl של פתרון RTC המדולל ישירות לערוצים ודוגרים במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, ואחרי שלושה שוטף עם PBS.
2. זריעת תאים בMicroslides
- לנתק את בקבוק מחוברות T75 של תאים בתרבית אדם כבד סינוסי אנדותל (HSEC) (מבודד מרקמת כבד כפי שתואר לעיל 13) בטריפסין-EDTA, לשטוף ב-PBS, ו resuspend ב 3 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת מלאה (אנדותל אנושי תקשורת הבסיסית בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין 100μg/ml, 10% בסרום אנושי חום מומת AB, 10 / מיליליטר ng של גורם גדילת אנדותל כלי דם ו10 / מיליליטר ng של גורם גדילת hepatocyte). הזרק 30 μl של השעיה תא נואשctly לכל ערוץ.
- השאר תאים לדבוק במשך שעה 1 בחממה humidified על 37 ° C עם 5% CO 2 אווירה על מדף שקופיות. לאחר שנתן לתאים לדבוק למלא את היציאות בכל צד של כל ערוץ עם מדיום שלם (איור 1).
3. ציטוקין גירוי של תאים
- לצאת מתאים בחממה ל24 שעות. להעריך את צמיחת תא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך. 24 שעות לפני assay הידבקות, לעורר monolayers אנדותל עם ציטוקינים על ידי החלפת תקשורת הצמיחה עם תקשורת מלאה בתוספת גידול הגורם נמק אלפא ואינטרפרון גאמא, הן ב10 ng / ml.
4. בידוד של הדם ההיקפיים לימפוציטים
- לבודד ימפוציטים דם היקפיים מכל דם בתחילה על ידי מטהר את שבריר מונונוקלארים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות על תקשורת צנטריפוגה הפרדת התא מתאימה ל25 דקות ב800x גרם. דגירה התאים על פלסטיק במשך שעה 1 כדי לאפשר היצמדות של מונוציטים.
- בעקבות דבקות לשאוב פלסטיק הלימפוציטים מועשרים supernatant. שטוף את לימפוציטים וresuspend אותם (בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר בזרימה בינונית (תקשורת הבסיסית האנדותל מכילה 0.1% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA)).
5. טיפול מקדים של האנדותל או leucocytes עם המעכבים
- הכן דילולים מומלצים של נוגדני פונקציה חוסמת או מעכבי מולקולה קטנים ב% media/0.1 אנדותל (V / V) BSA. החלף בינוני להשלים עם חסימת פתרון נוגדן / מעכב בערוץ microslide נבחר 30 דקות לפני לזרום assay.
- איפה הטיפול המקדים של קולטני chemokine על לימפוציטים מסוג מתוכנן, resuspend leucocytes המבודד בפתרון RPMI מכיל 0.1% (v / v) BSA ודגירה עם 200 / מיליליטר ng של רעלן שעלת לחסום את פעילות קולטן מצמידים G-חלבון של קולטני chemokine; לחלופין לדלל ספציפי פונקציהחסימת נוגדנים או מעכבי מולקולה קטנים של קולטני chemokine בדילול מומלץ. דגירה leucocytes על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואז לשטוף וresuspend בזרימה בינונית.
6. התקנה של מערכת Assay זרימה
- Prewarm תא שקוף תרמוסטטית מבוקר ל37 ° C. החדר צריך להיות יציאות להחדרת צינורות סיליקון ואספקה אלקטרונית לשסתום סולנואיד אלקטרוני המאפשר מיתוג בין תאים ותקשורת עם כמעט ללא נפח מת. הקאמרית הוא רכוב על מיקרוסקופ הפוכה כדי לאפשר למיקרוסקופ לעומת שלב. איור 2 מדגים את תא הזרימה assay ומיקרוסקופ וmicroslide להציב על הבמה מיקרוסקופ.
- מלא מראש מזרק זכוכית 50 מיליליטר עם מנעול luer עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים ולצרף באורך של צינורות סיליקון 25 סנטימטר ליציאת המזרק. הכנס במשאבת מזרק. לשנות את קצב הנסיגה של משאבת המזרק פיהוראות יצרן microslide כדי לשמור על לחץ גזירה של 0.05 אבא (0.5 דיין / 2 סנטימטר, איור 3).
- קח שני 5 מיליליטר מזרקים, לבטל את הבוכנות ולצרף את החביות לשתי יציאות בזרימה של שסתום סולנואיד אלקטרוני באמצעות צינורות סיליקון.
- צרף 12 סנטימטר של צינורות סיליקון למחוץ זרימת השסתום. השסתום מאפשר התחלפות בין חיץ סלולרי בחינם לשטוף (% media/0.1 אנדותל (V / V) BSA) וההשעיה לימפוציטים.
- לשטוף את שסתום סולנואיד האלקטרוני על ידי הוספת חיץ לשטוף בשתי חביות המזרק ולהבטיח חיץ זורם מחבית אחת דרך השסתום ולתוך צינורות סיליקון מחוץ לזרם.
- השתמש בבורר שסתום החלופי לחבית אחרת ולהבטיח את החיץ זורם ושכל הבועות יוסרו מהמערכת. הסרת חיץ לשטוף מאחת החביות ולהחליף עם איור 4 א השעיה לימפוציטים.
- חבר את טובין סיליקוןg ממשאבת המזרק ליציאה אחת של ערוץ microslide נבחר באמצעות מתאם microslide. ואז לחבר את צינורות סיליקון משסתום יצוא לנמל ההפך באמצעות מתאם microslide. ודא שצינורות סיליקון והמתאמים מלאים חיץ לשטוף לפני חיבור כדי למנוע בועות אוויר שנכנסו למערכת (איור 4).
- ברגע שמחובר למערכת הזרימה, הנח את microslide על הבמה מיקרוסקופ ולצרף עם קליפים או קלטת כדי למנוע תנועה. הגדר את המיקרוסקופ למטרת 10X יחד עם הגדרת השלב המתאימה. ודא monolayer האנדותל הוא מדמיין ובפוקוס באמצעות עדשת העין. יכולות להיות שנתפסו להבטיח תמונות באמצעות מצלמה שמחוברת למיקרוסקופ לפיה ניתן העבירו תמונות למוניטור וקליטות.
7. לזרום טכניקת Assay והקלטה של הידבקות לניתוח
- תנקב את שכבת האנדותל עם לשטוף חיץ עבור 2 דקות על ידי החל withdrawal של משאבת המזרק כדי להסיר כל פסולת או נוגדן חסימה מאוגד ולאחר מכן לעבור את השסתום כדי לאפשר בולוס 5 דקות של פתרון יקוציט במתח קיר גזירה מתמיד של 0.05 אבא
- במהלך 2 דקות האחרונות של בולוס יקוציט, להקליט 10 שדות אקראיים לאורכו של microslide. זה מאפשר ניתוח לא מקוון של מתגלגלים / קשירת הלימפוציטים על monolayer אנדותל. הקלט את כל שדה לכ 10 שניות לפני שעברתי לבא אחריו ולהבטיח כי הקלטות נעשות נגד כיוון הזרימה, כדי למנוע הקלטה באותו התא מתגלגל פעמיים ברצף מהיר.
- עקוב בולוס יקוציט עם בולוס 5 דקות של חיץ לשטוף ידי החזרת השסתום למיקום ההתחלה שלה. במהלך 2 דקות האחרונות של בולוס זה לבצע את השלב שני על ידי בחירת הקלטה לפחות 10 שדות שנבחרו באקראי לאורכו של microslide. הקלט את כל שדה למשך כ 5 שניות לפני שעברתי לבא אחריו ולהבטיח כי monolayer אנדותל וleucoc חסידytes נמצא במוקד ברור. זה מאפשר ניתוח לא מקוון של הדפוס של הידבקות.
Representative Results
Assay זה יש את היכולת לחזות את מפל זרימת הידבקות הרב שלבי ולהבהיר את המנגנונים מולקולריים שבבסיס על ידי השוואת תוצאות של ניסויי שליטה לאלה עם מעכבים מולקולריים. יכולות להיות סכמו מיטות כלי דם שונות על ידי שילוב של תאי האנדותל ספציפיים ושינוי תנאי לחץ גזירה.
כל צעד של מפל ההידבקות ניתן לנתח במצב לא מקוון על ידי ביצוע שיטת ההקלטה שתוארה בפרוטוקול. הצעד הראשון של מפל ההידבקות הוא הגלגול של leucocytes אשר יכול לבוא לידי ביטוי כאחוז מתאים חסיד בסך הכל. ניתוח מנותק מאפשר מספר התאים חסיד להיות מנוי בכל שדה שנרשם במהלך בולוס יקוציט. השמעה של התמונה מאפשרת השוואה של תאים הנמצאים בתוקף חסיד ואלה שעוברים תנועה מתגלגלת על פני האנדותל. תנועת רולינג ניתן דמיינו באמצעות טכניקה זו, כל שדה שנרשם לפחות 10 שניות. תאים מתגלגלים מזוהים במהירות מופחתת שלהם על פני אנדותל לעומת זורם תאים. התנהגות זו חייבת להיות הפגינה במשך לפחות 5 שניות בלי ניתוק. מפל ההידבקות בתוך sinusoids הכבד מתרחש בסביבת גזירה נמוכה במחקרים vivo אישר מתגלגלת מינימאלי עם רק צעד קשירה קצר. יש לנו אישרו כי זרימת assay משקף את הסביבה של sinusoids בכבד על ידי הוכחת כי פחות מ10% מleucocytes חסיד בהתמדה להתהפך מגורה HSEC במבחנים אלה.
הצעד הבא של מפל ההידבקות הוא הידבקות משרד. דבקות סה"כ ניתן לחשב מהשלב השני של הקלטה במהלך בולוס לשטוף חיץ (שלב 7.3). ניתוח מנותק מאפשר את המספר הכולל של תאים חסיד בתקיפות שנספר בכל תחום (איור 5). תאים בתקיפות חסיד מוגדרים כתאים שאינם נייחים או shapechanged עם איטי התנהגות זחילה.המספר הממוצע של תאים לכל שדה ואז יכול להיות מחושב. לאחר מכן ניתן להשתמש נתון זה, בשילוב עם שטח הפנים הכולל של שדה הראייה (שנקבע תוך שימוש graticule או שווה ערך), ריכוז של לימפוציטים (בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר) ואת קצב הזרימה להביע את המידה דבקות הלימפוציטים כתאים חסיד / מ"מ 2/10 6 תאי perfused.
לומד את הדפוס של הידבקות כרוכה בניתוח של שני השלבים האחרונים של מפל ההידבקות כולל לשנות צורה, זחילה וההגירה transendothelial. Leucocytes חסיד אל פני השטח העליונים של monolayer HSEC מופיע שלב בהיר בעוד אלה שהגרו דרך monolayer מופיע שלב כהה (איור 6). אז יכולים להיות מסווגים כתאים מציגים הידבקות 'סטטי' (/ עגול nonmigrated), מורפולוגיה '-שינה צורה' או כ 'היגר' וקטגוריות בודדות לאחר מכן הביעו כאחוז מאוכלוסייה הדבקה בסך הכל.
איור 1. חד שכבתי של תאים ראשוניים בכבד אנושי סינוסי אנדותל בתוך תא זרימה. א) Microslides מלא בתקשורת המכילה monolayer של תאי האנדותל שקדמה לתחילת assay הידבקות זרימת תמונה בניגוד שלב. ב ') של monolayer אנדותל מחוברות, צריכים להיות שנזרעו תאי אנדותל בmicroslide אשר precoated (לתאי אנדותל בכבד אנושיים הזה צריך להיות עם סוג קולגן עכברוש זנב 1) וזה חיוני כי תאי האנדותל בריאים בתרבות ובמחוברות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תא זרימת assay. הגדרת תא הזרימה assay ניתן לראות כאן, זה מורכב מתא שקוף שהוא רכוב על מיקרוסקופ הפוכה. דוד ממוקם בתא וצריך להיות מבוקר תרמוסטטית כדי לשמור על טמפרטורה של 37 ° C. לא צריך להיות יציאות זמינות לחיבור צינורות סיליקון מmicroslide בתוך התא למשאבת מזרק הנמצא בחוץ. Microslide ממוקם ישירות על הבמה מיקרוסקופ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. מזרק משאבה. משאבת מזרק היא להתחברed באמצעות צינורות סיליקון לתא הזרימה. המשאבה מוגדרת שיעור נסיגה ספציפי בהתאם למאמץ הגזירה הרצוי הנדרש עבור assay. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. חיבור שסתום לתא זרימה.) שסתום סולנואיד אלקטרוני מאפשר מעבר בין שתי חביות מזרק המכילות גם תאים או תקשורת עם כמעט ללא שטח מת. ב ') ברגע שהשסתום הוא סמוק ושתי החביות מוגדרות, צינורות סיליקון מהשסתום מחובר לתא הזרימה. זה קריטי, כי בעת חיבור המתאם בצינורות סיליקון ליציאה בחדר הזרימה קיים ממשק נוזל / נוזל. <target = "_blank" href = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 5. מדידה בסך הכל דבקות יקוציט. במהלך שתי דקות האחרונות של שלב בולוס לשטוף חיץ (כפי שתואר בפרוטוקול), מינימום של עשרה שדות אקראיים צריך להיות מוקלט. אלה ניתן לנתח את השורה ואת המספר הכולל של תאים חסיד בחוזקה ניתן לספור בכל תחום. הידבקות כוללת של leucocytes ניתן להשוות בין תאי בקרה ואלה קודם לכן בחסימת נוגדנים, הנה אנחנו מראים שדה נציג משקופית שליטה ושקופיות pretreated עם הידבקות תאית מולקולה-1 נוגדן חסימה (ICAM-1). חיצים נוספו כדי להדגיש את לויקוציטים חסיד, בייצוגיםtive שדה משקופית השליטה יש בסך הכל של 25 לויקוציטים המזוהה ובשקופית לחסום ICAM-1 יש בסך הכל של 13 לויקוציטים המזוהה. ברים סולם = 100 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. גם ניתוח של הדפוס של הידבקות יקוציט על משטחי אנדותל על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. ניתוח מנותק משדות שנרשמו יכול לשמש כדי לחקור את הכיוון ומהירות של הידבקות יקוציט. צעדים ספציפיים של מפל ההידבקות ניתן דמיינו ולכמת באמצעות הדמיה בניגוד שלב. תאים בהירים שלב שהם חסיד בחוזקה אך לא הופעל ניתן לכנות הידבקות 'סיבוב', התאים אשר הפעלד ובהיר שלב יכולים להיקרא 'צורה השתנתה' והתאים שהם כהים שלב הם התאים שעברו הגירת transendothelial וניתן לכנות 'היגר'. התמונה מציגה דוגמאות של כל דפוס של הידבקות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
השלב הקריטי ביותר לביצוע זרימה assay הצלחה הוא להבטיח כי monolayer בריא ומחוברות של תאי האנדותל הוא מוכן לפני assay זרימת ההידבקות. תאי האנדותל ראשוניים יכולים להיות קשים לתרבות ורגישה לשינויים בשיטות culturing. חשוב ש1) זרימת תאים הם מצופים כראוי ואחיד עם תאי אנדותל בשכבה; לHSEC להשתמש בסוג קולגן זנב חולדה אני אבל זה עשוי להיות שונה לאוכלוסיות אנדותל אחרות, 2) תרבות בינונית מתאים לסוג התא, עבור HSEC שתארנו בינוני המלאה שלנו בקטע הפרוטוקול. צעדים חיוניים אחרים כוללים הגדרת משאבת המזרק בקצב המתאים כדי לשקף את הרמות פיסיולוגיות של מאמץ גזירה.
במהלך הזרימה assay זה הכרחי כדי למנוע בועות אוויר בתוך הזרם במעגל אשר עלול לגרום נזק monolayer אנדותל או רצועת תאים חיסוניים מפני שטח אנדותל. זה ניתן למנוע על ידי enSuring שכל צינורות סיליקון ומתאמי perfused עם חיץ לשטוף לפני חיבור, שכל בועות האוויר יוסרו ושהתקשורת prewarmed לפני השימוש. בעת חיבור המתאמים ליציאות בmicroslide זה מאוד חשוב שיש ממשק נוזל / נוזל במהלך חיבור, אם יש אוויר אז זה יהווה פער אוויר בתוך המערכת שתשבש את monolayer אנדותל בזמן נסיגת המזרק צעד. פתרון יקוציט בחבית המזרק צריך תסיסה קבועה על מנת להבטיח שהתאים לא להתפשר, ובכך שמירה על צפיפות תאים קבועה לאורך כל הניסוי.
במהלך שלבי ההקלטה חשוב כדי להבטיח את דמותה של שכבת האנדותל היא כראוי ממוקדת וברורה, כדי לאפשר ניתוח מחובר מדויק, וכי במהלך השלב השני של הזרימה assay (בולוס יקוציט הודעה) שמספיק זמן נותר במהלך לשטוף החיץ שלב לפני ההקלטה התחדש על מנת להבטיח כיכל leucocytes nonadherent יוסרו. כמו כן זה הכרחי להשתמש בתאי אנדותל בשכבה של צפיפות המתאימה כדי למנוע אובדן של תאים אשר יכול להפריע לדפוסי זרימה בנימי דם צרים וגם יכול להיות קשה להבחין מleucocytes חסיד גדול יותר תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. יש לנו תארנו צפיפות זריעה אופטימלית לתאי אנדותל סינוסי כבד אנושיים, אבל עשוי להשתנות בין אוכלוסיות שונות אנדותל ומינים.
התקדמות משמעותית נעשתה בלימוד גיוס יקוציט במודלים של בעלי חיים עם מיקרוסקופיה intravital. היתרון העיקרי של שיטת assay זרימת ההידבקות הוא שגיוס יקוציט ניתן ללמוד במערכת בינארית עם תאי אנדותל אנושיים ראשוניים. יתר על כן, ניתן ללמוד האינטראקציות הללו תחת רמות רלוונטיות הפיזיולוגיות של מאמץ גזירה. זה חשוב כדי לאשר את הממצאים של מחקרים בבעלי החיים intravital עם מערכות סלולריות אדם כייתכנו differences בנכסי אנדותל בין מינים. אחת המגבלות של הזרימה assay הוא שגיוס יקוציט נחקרת בסביבה חד תאית של monolayer אנדותל. בנוסף פעם אחת leucocytes יש דבק וtransmigrated פני האנדותל שהם לא יכולים להיות בהווה במספרים מספיקים כדי להיות מבודדים וחשוף לתהליכים במורד הזרם.
למרות מגבלות אלה, ברגע שassay זרימת ההידבקות כבר שולט בו ניתן לפתח לבצע ניתוח נוסף של מפל הידבקות יקוציט ומותאם לשחזר את הסביבה תאית. הקלטה ממושכת של שדות יחיד והשימוש בתוכנת מעקב יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההתנהגות של leucocytes זחילה. יתר על כן עם השלמת הזרימה assay יכול להיחקר microslides באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר וסימון immunofluorescent ללמוד הידבקות וגלגול ביתר פירוט. בנוסף, יש לנו לפתח בעבראד מודל במבחנה שבי leucocytes זורם יכולים לקיים אינטראקציה עם האנדותל בכבד המותנה בנוכחות של הפטוציטים. assay זה גם יכול להיות שפותח כדי ללמוד אוכלוסיות של leucocytes: הקבוצה שלנו ביצעה מחקרים עם תת כגון תאי T רגולטורים, תאי B, וleucocytes כבד הסתננות.
מחקרים אלה הם הוכחה לכך שassay זרימת ההידבקות הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור גיוס יקוציט ספציפי בכלל ואיברים במערכות אנושיות.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים
Acknowledgments
SS ממומן על ידי מלגה קלינית Wellcome Trust ביניים, CW על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six channel microslide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and precoated slides are available depending on assay requirements. |
| Flow adaptors microslide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
| Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
| Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
| Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
| Electronic solenoid valve | Lee Products Limited, UK | Part Number LFYA1226032H | |
| Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2 mm inner diameter, 4 mm outer diameter |
| Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1 mm inner diameter, 3 mm outer diameter |
| Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
| Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
| Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
- Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
- Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
- Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
- Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
- Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
- Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
- Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. , (2013).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).
