Summary
Isoleringen av kreft stamceller (CSCS) direkte fra humane vev er nødvendige for deres biologiske karakterisering. Dette manuskriptet beskriver en metode for isolering av prostata CSCS fra menneskelig vev, samtidig gir tips om feilsøking vanskelige trinn.
Abstract
Kreften stamcelle (CSC) modellen er betydelig revisited i løpet av de siste to tiårene. I løpet av denne tiden CSCS har blitt identifisert og isolert direkte fra humane vev og serielt dyrket i immundefekte mus, vanligvis gjennom antistoffmerking av subpopulasjoner av celler og fraksjonering ved strømningscytometri. Imidlertid har de unike kliniske funksjoner av prostata kreft betraktelig begrenset studiet av prostata CSCS fra friske humane tumorprøver. Vi har nylig rapportert isolering av prostata CSCS direkte fra humant vev på grunn av HLA klasse I (HLAI)-negativ fenotype. Prostatakreftceller er høstet fra kirurgiske prøver og mekanisk dissosiert. En cellesuspensjon blir generert, og som er merket med fluorescently konjugerte HLAI og stromale antistoffer. Subpopulasjoner av HLAI-negative celler er til slutt isolert ved anvendelse av et flowcytometer. Den viktigste begrensning av denne protokollen er det ofte mikroskopiske og multifokal naturprimære kreft i prostatektomi prøver. Likevel, isolerte levende prostata CSCS er egnet for molekylær karakterisering og funksjonelle validering ved transplantasjon i immunsvikt mus.
Introduction
Intratumoral heterogenitet er ansett å være et kjennetegn på kreft en. Faktisk har mange mekanismer for intratumoral heterogenitet blitt beskrevet, inklusive genetisk mutasjon og interaksjoner med mikromiljøet. I tillegg kan noen kreftformer inneholde en cellulær hierarki med en subpopulasjon av kreft stamceller (CSCS) som oppviser egenskapene til tumor initiere kapasitet og selvfornyelse i serietransplantasjon assays 2-5. Utgangspunktet er beskrevet i hematologisk 6, bryst 7, og hjernen 8 maligniteter, har CSCS også blitt undersøkt i prostatakreft 9-12, så vel som andre tumortyper 2-5.
CSCS er generelt ansett som en cellulær brøkdel innenfor en heterogen befolkning 2-5. Derfor er funksjonell og molekylær karakterisering av CSCS betinget av deres berikelse fra bulk populasjoner. Følgelig, i løpet av de siste to tiårene flere møttehodologies av CSC anrikning har blitt utviklet som typisk involverer separasjon av merket populasjoner ved strømningscytometri. I tillegg er en betydelig faktor i studiet av CSCS at den hierarkiske organiseringen av menneskelig vev kan bli avbrutt av eksperimentelle manipulasjoner slik som seriepassaging i kultur eller i immundefekte mus. Som et resultat, har den direkte isolering av CSCS fra humant vev dukket opp som et viktig metode i CSC-feltet.
Prostatakreft er en ledende årsak til kreft sykelighet og dødelighet i USA og rundt om i verden 13. Derfor er isolert og biologisk karakterisering av prostata CSCS av betydelig interesse. Prostata CSCS har tidligere blitt beriket fra cellelinjer, pasient avledet xenograftene og lav passasje pasient avledet suspensjonskulturer 9,10,12,14.
Vi har nylig rapportert isolering av prostata CSCS direkte fra humane kirurgiske samples i kraft av sin HLAI-negative celleoverflaten fenotype 10. Her har vi detalj fremgangsmåtene implementeres for isolering av disse cellene. Prostatakreft er høstet fra kirurgiske prøver og gjort til cellesuspensjoner. Celler blir deretter farget med antistoffer mot HLAI samt stromale og levedyktighet markører, og CSCS blir isolert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Isolerte CSCS kan deretter brukes for analyser som krever levedyktige celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Fangst og foredling av menneskelig prostatakreft Vev fra Kirurgiske prøver
- Forbered to 50 ml polystyren koniske rør inneholdende 15 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
- Patologi servicepersonell høste primær og metastatisk prostatakreft prøver fra prostatektomi og palliativ kirurgi prøver, med henholdsvis en Institutional Review Board godkjent protokoll. Metastatisk prøver kan fås fra lymfeknute dissections under primær kirurgi, ryggvirvlene under palliativ kirurgiske prosedyrer, for eksempel ryggmarg dekompresjon og lungene ved diagnostisk fjerning av enkelt-metastatiske lesjoner, blant andre.
- Høst skytende bulk vev ikke er nødvendig for klinisk diagnostikk inn i den første 50-ml polystyren konisk rør fra trinn 1.1 og lagre umiddelbart ved 4 ° C. Den harvested vev skal måle i det minste en 4 til 5 cm 2 i området, og 1-2 cm i tykkelse.
- Laboratoriepersonell behandle bulk vev hentet fra patologi tjeneste i forberedelse til histologisk undersøkelse og generering av cellesuspensjoner.
- Behandling av bulk vev bør ikke overstige 24 timer fra kirurgisk reseksjon for å garantere maksimal celle levedyktighet.
- Å arbeide i et biosikkerhet kabinett med en steril skalpell og pinsett, ta 2-4 mm tykke horisontale vevssnitt fra makroskopiske tumor knuter. Umiddelbart lagre delene i den andre 50 ml polystyren konisk rør fra trinn 1.1.
- Når makroskopiske knuter ikke er visualisert fra prostatektomi prøver, samle tilfeldige 2-4 mm tykke horisontale vevssnitt fra bakre lobes og overgangssone.
- Separer en del av den kirurgiske vev ved hjelp av en steril skalpell og pinsetter og løse det i 10% formalin før generasjon av cellesuspensjoner. Arkiv og analysere dette materialet histologisk å bekrefte tilstedeværelse av prostata kreft vev.
2. Generering av cellesuspensjoner fra vevsdelene
- Å arbeide i et sterilt biosikkerhet kabinett, overfører en vev-delen til en 60 x 15 mm dyrkningsskål inneholdende 1 ml steril 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Mekanisk Triturer prøven ved hjelp av en steril skalpell og tang.
- Ingen enzymatiske digestions er i denne protokollen.
- Overfør 1 ml suspensjon inn i et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tilsett 1 ml av dyrkningsskål og gjenta triturering trinnet til vev-delen er fullstendig dissosiert, vanligvis 3-4x.
- Gjenta denne prosedyren serielt til alle vev seksjoner har blitt skilt.
- Resuspender innholdet i 50 ml polystyren konisk rør med en 5 ml serologisk piPette og virvle ved maksimal hastighet (ca. 3200 rpm) i 1 min.
- Filtrer den resulterende suspensjonen gjennom en 35-mikrometer celle sil og samles opp i en andre steril 50 ml polystyren konisk rør.
- Generere en pellet ved sentrifugering ved 450 xg i 10 min.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten med 5 ml av røde blodlegemer lyseringsbuffer og inkuber i oppløsningen i 5 minutter ved RT. Fjern det røde blodcellelyse buffer ved sentrifugering i 5 min ved 450 x g ved romtemperatur.
- Kast supernatanten, resuspender pelleten i 1 x PBS supplert med 5% FBS, og kvantifisere antallet levedyktige (trypanblått-negative) celler ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller. Generere et 1x10 6 celler / ml suspensjon og lagre det på is, men ikke lenger enn en time.
- Levedyktighet og utbytte av celler kan variere betydelig mellom vevsprøver. I prostatektomi innstillingen, kan levedyktighet varierer mellom 45-70%, og five 2-4 mm tykke horisontale vevssnitt fra en tumor makroskopisk nodul kan ventes å gi ca 6 3x10 levedyktige celler.
Tre. Antistoff Farging av celler for FACS
- Etiketten fem 15 ml polystyren koniske rør som vist nedenfor. Bruk CD45 og CD31 antigenet merking for å utelukke blodkreft og endothelial elementer, henholdsvis.
- Unstained
- IgG 2a κ-PE + IgG en κ-FITC
- HLAI-PE + IgG en κ-FITC
- IgG 2a κ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
- HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
- Fordel den kvantifiserte cellesuspensjonen fra forrige avsnitt (trinn 2,7) i de fem rør i trinn 3.1. Tilsett antistoffer ved en fortynning på 1:250 og inkuberes cellesuspensjonen på is i 30 min.
- Sentrifuger cellene ved 450 x g i 3 min ved 4 ° C, og supernatantene kastes. Vask cellene ved å oppslemme hver pellet med steril 1 x PBS supplert med 10% FBS, etterfulgt av sentrifugering ved 450 x g i 3 min ved 4 ° C.
- Resuspender cellene i en 1 ml oppløsning av 1 x PBS inneholdende 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ved en konsentrasjon på 10 ug / ml.
- Filtrere den endelige løsningen gjennom 35 mikrometer sil caps i 12 mm x 75 mm polystyren rør.
4. Isolering av Prostata CSCS ved FACS
- Utnytte et flowcytometer for celle sortering.
- Sett kompensasjon kontroller ved hjelp av celler fra rør nr. 1, nr. 2, nr. 3 og # 4.
- Lag porter som utelukker rusk og klynger av celler ved hjelp av fremtids og side-spredningsparametere.
- Etablere FlTC og PE-portene ved hjelp av suspensjoner fra tube # 3 og tube # 4, henholdsvis.
- Gate levedyktige (DAPI-negative) celler ved hjelp av pacific blue-En kanal.
- Bruke tube # 5 Forkast CD31-positive og CD45-positive celler ogsamle både HLAI-negative og HLAI-positive populasjoner i sterile 15 ml polystyren koniske rør som inneholder 2 ml RPMI supplert med 10% FBS.
- Sentrifuger den sorterte cellesuspensjoner ved 450 xg i 5 min, og deretter resuspender pelleten i 200-500 pl av RPMI supplert med 10% FBS.
- Kvantifisere levedyktige (trypanblått-negative) celler ved hjelp av en hemocytometer eller automatisert celleteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Humant prostata cancer tumor høsting og flowcytometri plott som illustrerer spesifikke populasjoner fra en human prostatakreft. (A) Tumor knuter høstes for å generere en cellesuspensjon. Tumor innholdet i den behandlede prøve er bekreftet ved hjelp av konvensjonelle Hematoxylin og Eosin farging. (B) Celler flekker positivt for DAPI er utelukket å isolere bare levedyktige celler. (C) HLAI-negative gate er opprettet basert på celler farget med kontroll isotyp IgG en κ-FITC og IgG 2a κ-PE antistoffer. Andelen av HLAI-negative og HLAI-positive celler er vist i porten. Vennligst klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver isolering av CSCS fra frisk human prostata kreftvevet. Flere viktige hensyn påvirke det vellykkede resultatet av denne protokollen.
Utvinningen av et høyt antall levedyktige prostatakreftceller er avhengig av forsiktig grov vurdering av kirurgiske prøver. I vår erfaring, er en vellykket isolering av tumorigene prostata celler best sikret når makroskopiske tumor knuter er observert og behandlet 10.
Men nå til dags primær sykdom stammer fra prostatektomi prøver er ofte multifokal og mikroskopisk. I disse tilfellene, når det er mulig utvalgets behandling bør bli informert av tidligere kliniske biopsi resultater for å øke sjansen for høsting prostatakreftceller. I vår erfaring, er det nødvendig for godt kvalifisert laboratoriepersonell til å utføre protokollen ofte for å sikre en vellykket isolering av prostata CSCS fra multiple kliniske prostatektomi prøver.
I tillegg, siden vi beskriver her en negativ seleksjon protokoll som involverer celleoverflate-HLAI uttrykk, er det viktig å fjerne potensielt forurensende HLAI negative elementer fra prostata cancer cellesuspensjoner som behandles av FACS. Spesielt ved bruk av røde blodceller lysis buffer og utelatelse av ikke-levedyktige celler etter DAPI farging er betydelige hensyn. Selv om disse tiltakene ikke kan garantere at nonprostate kreftceller ikke forurense HLAI-negativ befolknings, våre tidligere begrensende fortynning studier tyder på at prostata CSCS er likevel effektivt beriket i denne avdelingen 10.
Endelig isolering av levende celler muliggjør deres funksjonelle karakterisering, for eksempel deres evne til effektivt å initiere xenografts hos immunkompromitterte mus, blant andre. Molekylære studier, blant annet uttrykk profilering, er også oppnåelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Hariri Family Foundation og TJ Martell Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm, 15 mm Cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tube | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
