Summary
Protokol bilgilerini, ikinci harmonik üreten nanopartiküller ile in vitro etiketleme insan embriyonik kök hücreleri için temin edilmiştir. Çoklu foton mikroskopi ve kalp kümeler halinde kendi farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler de sunulmuştur.
Abstract
Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini ikinci harmonik üretimi nanopartiküller (HNPs) ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. İkincisi yakın çoklu foton görüntüleme için bir biyolojik numune etiketleme için sunulan prob yeni bir ailesidir. HNPs uyarma dalga boyunda herhangi bir sınırlama ile ikinci harmonik nesil doğrusal olmayan optik işlem ile uyarma ışık sıklığını iki katına yeteneğine sahiptir.
Çok foton (uzun vadeli hava-sıvı kültürler olarak tutulur) kalp kümeler halinde HESC farklılaşması için temel yöntemler detaylı olarak sunulmaktadır. Özellikle, 3D kalp dokusunu yenerek 3D izleme sırasında izole HNPs yoğun ikinci harmonik (SH) emisyonunu maksimize etmek için nasıl kanıt gösterilir. 3D deplasman desenleri almak için, elde edilen görüntülerin analizi de ayrıntılı.
Introduction
Doğrusal olmayan mikroskopi sistemleri, onların doğasında üç boyutlu kesit yetenekleri sayesinde, giderek yakın-kızılötesi iki-foton soğurma bantları ile foto-stabil floroforlar için talebi tetikledi. Sadece son yıllarda çift, flüoresan bazlı etiket (boyalar, kuantum noktaları, yukarıya dönüştürücü nanopartiküller), farklı bir görüntüleme yöntemi etiket gibi doğal doğrusal olmayan nanopartiküller yeni bir ailesinin kullanımını istismar edilmiş, yani gelişimini tamamlamak için özellikle çoklu foton mikroskopi için geliştirilmiştir harmonik nanopartiküller (HNPs). Inorganik noncentrosymmetric kristaller dayanan bu etiketler, uyarma frekans SH üreten optik kontrast uygulamayın: yakın kızılötesi darbeli uyarma ışık bir kısmını dönüştürerek, örneğin görünür mavi ışığa (λ = 800 nm) (λ / 2 = 400 nm) . Yakın geçmişte birkaç yazar demir iyodat Fe (IO dahil, farklı malzemeler test ettik
Bu görsel deneyde, protokol bilgilerini fonksiyonelleştirilmemiş HNPs ile insan embriyonik kök hücrelerinin in vitro etiketleme (HESC) için verilmektedir. Koloid süspansiyonlarının sentezi ve hazırlık önceki yayında ve referanslar içinde 16 ayrıntılı olarak ve bu çalışmanın kapsamı dışındadır edilir. (Uzun vadeli hava-sıvı kültürleri olarak muhafaza) kalp kümeler halinde çoklu foton mikroskopi ve farklılaşma ile HESC soruşturma için metodolojiler sunulmaktadır. İnsan ESC süspansiyon içinde koloni fragmanlarının EB oluşumu ile ya da Şekil 1A 'da gösterildiği gibi, alternatif olarak, Aggrewell plaka kullanılarak EBS içine tek hücrelerin toplanmasını zorunlu ya da iki farklı şekillerde, sözde embriyoit organları (EBS) içinde ayırt etmek için izin olabilir . politetrafloretilenden kardiyak hücre kümeleri yenerek Culturing (PTFE) gözenekli filtreler facdaha fazla çalışmaları (aksiyon potansiyelleri örneğin elektrofizyolojik ölçümler) için uzun vadeli bakım ilitates.
Tarama mikroskobu uyarım kaynağı HNPs ikinci harmonik görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli pik güç ulaşmak için (numuneden 300 FSEC daha küçük bir darbe süresi ile) ultrashort bakliyat teslim etmek gerekir. Örneğin, görüntüleme için kullanılan en yaygın FSEC kaynak ayarlanabilir Ti vardır: Safir lazerler. Safir pompalanan kızılötesi optik parametrik osilatörler: Alternatif olarak, diğer ultra lazerler örneği erbyum iyonu 17, krom forsteritten 18 veya Ti için, istihdam edilebilir. Mikroskop tercihen oldukça yüksek bir sayısal diyafram ile bir objektif ile donatılmış olabilir. En önemlisi, önceki ölçümleri ve amaç değiştirildiği her zaman için, bu çalışma da lazer darbeli ön kompresör ayarlarını optimize ederek set-up (lens) 'de mevcut dispersiyon en aza indirmek için zorunludurseçim dalga boyu. Protokolde ayrıntılı Bu işlem, darbeli lazer odak düzlemi de sınırlı bir süre dönüşümü (örneğin, en kısa sürede) mümkün olduğu kadar yakın ve örnek doğrusal olmayan yanıtı maksimize sağlar.
Protokol sonunda anlatılan görüntü analizi amacı belirlemek ve kardiyak kümeleri dayak ritmik kasılmalar ilişkili 3D HNPs hareketleri takip etmektir. Görüntü düzleminde izleme nanopartiküller, sadece takip eden film dilimlerinde konumlarını belirleyerek gerçekleştirilir. Eksenel hareketi üzerine bilgi elde etmek için, eksenel yer değiştirmesinin bir fonksiyonu olarak lineer olmayan bir şiddet tepkisinin bir ön kalibrasyon zorunludur. Uzun süreli ölçümler, örnek eksenel konumunun aktif interferometrik kontrolü için unutmayın termik ve / veya mekanik sürüklenir mevcudiyetinde kalibrasyon eğrisinin geçerliliği korumak için gereklidir.
Trac için burada kullanılan HNPsbirikintiler içinde e yenerek hücreleri potasyum niobat oksit (KNbO 3) dayalı, ancak mevcut diğer doğrusal olmayan nanomateryaller Staedler ark 16 çalışmalarında ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir.
Şimdiye kadar incelenen nanomalzemelerin çoğunun doğrusal olmayan optik verimleri çok benzer. KNbO 3 için seçim, esas olarak koloidal çözeltinin iyi stabilite ve hatta oldukça yüksek bir konsantrasyonda ve uzun zaman teşhir 16 birkaç insan hücre hatları üzerinde test onun iyi biyolojik uyumluluk, motive oldu.
Bu iş için kullanılan nanomaterial yenilik göz önüne alındığında, floresan / ışıldayan biyo-belirteçler kıyasla HNPs temel özellikleri yazarlar tarafından gerçekleştirilen bir kısa orijinal bilgisayar video animasyon gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kültür ve İnsan ESC Genişleme
- Hazırlama Knockout DMEM ihtiva eden (PM olarak adlandırılır) hücre çoğalma ortamı içinde% 20 Knockout serumu,% 1 MEM gerekli olmayan amino asitler,% 1 L-glutamin, 200 mM,% 1 penisilin-streptomisin, ve 3.5 ul β-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir.
- 8 ml PM ortamda insan ESC (HESC) çözülme ve DMSO-desteklenmiş donma orta atmak için 115 xg'de onları 5 dakika santrifüj.
- (Sadece 24 saat enkübasyon) çözülmesi üzerine apoptozu önlemek ve hücre yaşamını geliştirmek için 10 mM Kaya inhibitörü içeren PM ortamın 1 ml ilave edilir.
- Pluripotensin bakım için istenen konsantrasyonda (4-10 ng / ml) de PM, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ilave edin.
- Daha önce / cm 2 2 x 10 4 hücre konsantrasyonunda kaplama besleyici hücreler sünnet derisi ışınlanmış insan ile ilgili en hESC (γHFF) (Şekil 1A), Plate.
- Gerektiğinde c kısımlarını kaldırmak, orta günlük değiştirin veolonies uzatılmış keskin kesmek Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon ile ayırt başlıyor.
- Enzimatik olarak bir hafta, pasaj koloniler kez:
- Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın.
- PBS çıkarın ve 37 ° C,% 5 CO2 'de 10 dakika boyunca 1 mg / ml' de sıcak kollajenaz IV, oyuk başına 0.5 ml ile inkübe edin.
- 2 ml 3 dakika boyunca 115 x g yeni PM ve santrifüj koloni parçaları toplayın.
- Seçenek olarak ise, koloniler kazınarak mekanik geçişli olabilir:
- Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın.
- Elle StemPro EZPassage silindir kazıyıcı aracı (Şekil 1B) kullanarak koloniler kazıyın.
- Koloni parçalarını toplamak ve süpernatant kaldırmak için 115 g'de 3 dakika sonra santrifüj.
- ΓHFF veya plaka fragmanları embriyoid organları (EBS) içine farklılaşması için onları süreci.
2.. İnsan ESC FarklılaşmaProtokol
- Hazırlama Knockout DMEM kullanılarak farklılaşma ortamı (DM)% 2 Hyclone serumu,% 1.0 MEM gerekli olmayan amino asitler,% 1.0 L-glutamin, 200 mM,% 1 penisilin-streptomisin, 3.5 ul β-merkaptoetanol ile takviye edilmiştir.
- Ortamı çıkarın ve 2 ml PBS ile koloniler yıkayın.
- Süspansiyon içinde koloni parçalarının EB sistemi:
- PBS çıkarın ve 37 ° C,% 5 CO2 'de 10 dakika boyunca 1 mg / ml' de sıcak kollajenaz IV, oyuk başına 0.5 ml ile inkübe edin.
- 2 ml 3 dakika boyunca 115 x g yeni DM ve santrifüj koloni parçaları toplayın.
- 4 gün (Şekil 1C) için ultra-düşük eki 6 oyuklu plakalar (bölme başına 2 mi) içinde süspansiyon halinde kültür bunları.
- Toplama ve% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar (yaklaşık 3 EBS / oyuk) (Şekil 1D) ile ilgili en yeni oluşan EBS plaka.
- Seçenek olarak ise, Aggrewell plaka kullanılarak EBS içine tek hücrelerin toplanmasını zorunlu:
- Kaldırmak PBS veAccutase (0.5 ml / oyuk) kullanılarak bir hücre içine koloniler ayrışır.
- 1,2 x 10 6 / ml DM Santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri.
- 1 gün (Şekil 1B ') için Aggrewell odasının başına 2 ml ekleyin.
- Yeni oluşan EBS (Şekil 1C ') toplamak ve% 0.1 jelatin kaplı 24 oyuklu plakalar (yaklaşık 3 EBS / oyuk) bunları plaka.
- Kardiyomiyositler (15-30 gün) kümeleri dayak görünümünü kadar her 2-3 gün DM değiştirin.
HNPs ile Kümeler ve Etiketleme yenmek 3. Hava-sıvı 3D Kültürler
- Tanımlamak ve el normal bir uzun keskin kesmek Pasteur pipeti kullanarak, kültür 2-4 hafta sonra ortaya çıkan, dayak kardiyomiyositler (Şekil 1D) kümeleri teşrih.
- 6 oyuklu plaka (Şekil 1F) üzerine yerleştirileceği uç başına Deposit 4 PTFE filtresi.
- EAC üstüne DM ortamı 1 ml ekleyinh iyi.
- Her PTFE filtre (Şekil 1E) tek disseke yenerek küme, maksimum 4/well, plaka (Şekil 1F ') başına yani 24 agrega ekleyin.
- 2-3 günde DM orta değiştirin.
- Kümeleri etiketlemek için, (170 mikron kalınlığında) dayak kümesini içeren PTFE filtreyi kaldırmak ve 3.5 cm cam alt çanak üzerine koydu.
- 30 dakika boyunca 50 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda HNP 1 ml ilave edilir.
4. Non-Lineer Optik Görüntüleme
- Örnek hazırlama. HNP etiketleme (Adım 3.6), yüksek sayısal açıklık hedeflerinin çalışma mesafesi ile uyumlu bir 170 mikron kalınlığında cam alt çanak üzerindeki teflon filtreler üzerinde tam ayırt erken hEBs veya (kasılma görünüm üzerine disseke) kalp atış kümeleri ya aktardıktan sonra. Seçenek olarak ise, cam alt çanak% 0.1 jelatin ile ön-kaplanmış kümeler dayak doğrudan bir kaplama uygulanır.
- Bir transfer örnekleriall-in-one sabit sıcaklık, nem ve uzun süre üzerinde CO 2 kontrolü sağlamak odasına kuluçka ile donatılmış mikroskop.
- İlk muayene, görüntü sonra beyaz ışık aydınlatma altında geniş alan görüntüleme yoluyla numune ileri tetkikler için seçilmiş olacaktır farklılaşmış EBS veya aktif dayak kümeleri içinde ilgi yapılarını belirlemek için.
- Hücre NADH otofloresans ve HNPs SH eş zamanlı olarak elde edilmesi varsa, moleküler emilimini maç için kısa bir lazer dalgaboyu (yani 720 nm) ayarlanır. Yarım dalgaboyu merkezli bir dar bant geçiren spektral filtre kullanın (örneğin, λ = 360 ± 10 nm) SH tespit etmek ve başka bir otoflüoresanı algılamak için.
- Öncelikle kalp kümenin genel morfolojisini yeniden ve birkaç görünür HNP ile küme hacmi içinde bir görüntü düzlem seçmek için hızlı, düşük çözünürlüklü, üç boyutlu tarama gerçekleştirins.
- Gerekirse, en numunenin optik özelliklerini maç serbestçe dalgaboyu değiştirmek veya kızılötesi dalga boyu (yani, 790 nm) ile dokulara daha derin photobleaching, fotoğraf hasar ve görüntü önlemek ve (yani, 395 nm buna göre ikinci harmonik filtresini değiştirin .) Numune üzerine biriken HNPs ikinci harmonik sinyali en üst düzeye çıkararak tercih edilen bir çalışma dalga boyunda lazer darbeli ön kompresör ayarlarını optimize.
- , Gerçek zamanlı kalp küme kasılmaları monitör, iki boyutlu görüntüleri yüksek hız edinimi sağlayan, örneğin rezonans modu gibi hızlı modunda mikroskop optik tarayıcıyı ayarlamak için.
- Gibi görüntü kontrast ve toplama hızı arasındaki en iyi uzlaşma olarak ayarları seçin:
- Tarama ortalama: 4
- Pixel bekleme süresi: 0.1 mikro saniye olduğu
- Görüntü oranı: saniyede 3.75 kare (fps)
- Lazer gücü odak nokta s göre ayarlanırize ve tarama hızı. (Objektif girişinde ölçülen) 50 mW 0.1 mikro saniye olduğu piksel bekleme süresi ve hücre canlılığını korurken Planı APO 20X NA 0.75 amaç için tipik bir değerdir.
5. Görüntü Analizi
- Eksenel kalibrasyon prosedürü. Çıplak bir tabaka üzerinde biriken tek HNP seçin. SH yoğunluğunu maksimize etmek için (nanopartikülün eksenel pozisyonda yani) odağı ayarlayın. HNP bir fonksiyonu olarak SH yoğunluğu ile bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için mikroskop kademesinin eksenel konumu odak düzlemi ile denkleştirilmiştir kontrollü bir şekilde değişir. Plan APO 20X NA 0.75 amaç için, bu ayarlama prosedürünün çıkış Şekil 4C'de bildirilmektedir.
- Tüm video çerçeveler mevcut HNPs seçin ve bunların periyodik hareketlerini belirler. Bu prosedür kolayca ilgi tanımlanmış bir bölgede sinyal maksimum yoğunluğu noktalar için arayan bir özel kod, örneğin otomatik edilebilirfarklı kare arasında onları bağlayan (Görüntü İşleme Araç kutusu 'bölge sahne' fonksiyonunu kullanarak b Matlab R2009 yazılmış bir kod örneği sunulmuştur).
- Olmayan sürekli izlenebilir HNPs Adım 5.1 kurulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak eksenel deplasman içine farklı çerçeveler boyunca şiddeti modülasyon dönüştürerek, optik ekseni boyunca hareket ile ilişkili out-of-düzlem değiştirmeler, niceliğini değerlendirin. Bu prosedür eksenel hareketleri erişim sağlar ancak mutlak yön (yukarı veya aşağıya doğru) belirlenmesi için kullanılamaz unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki konfokal görüntüleme ile dövülmesi aktivitesini değerlendirmek için, PTFE filtrelerin doğrusal olmayan optik cevap dikkatli bir karakterizasyonu yüksek bir konsantrasyonda (1 mg / ml), tek başına veya HNPs mevcudiyetinde ya da gerçekleştirildi. I) Çıplak yüzey iki foton heyecanlı floresan çok zayıf ve ilgili biyolojik numunelerin ölçüm engel olamaz, ve ii) izole HNPs gelen SH emisyon kolayca epi-algılama modunda substrat yoluyla görüntüleme ile elde edilebilir: O sağlanmıştır (Şekil 2). Amaç 3D deplasman ölçümü için referans kontrolleri sahip oldu.
Şekil 3'te, kalp HNP etiketli yapılar ve EBS görüntülenir. Yoğun mavi noktalar SH izole HNP kök ise kırmızı (Şekil 3A), sarı (Şekiller 3B ve 3C) ve yeşil (Şekil 3D) renk, NADH otofloresansı karşılık gelir. Bu po ilginçkuantum noktaları gibi veya yukarı-dönüşüm nanopartiküller diğer nanopartikülleri tabanlı yöntemlere göre bu tekniğin ve nispeten seyrek etiketleme ile elde çok iyi bir optik kontrast ortaya int. Bu çalışmada, çok yoğun izole etiketlere sahip birçok bağımsız bireysel parçacık hareketlerini izleme ve kök hücre kaynaklı yapıların kolektif hareketini yeniden inşa için avantajlı oldu.
Şekil 3B, bir HNP etiketli kalp atış kümesinin bir kesitini göstermektedir. Bu 3 boyutlu yapılar daha sonra bu durumda, NP hareket çözme için yüksek hızlı alım hızı korumak için film 1 'de rapor edildiği gibi. Hücre HNP toplu olarak daralma desen izlemek için yüksek hızda kaydedilebilir, genel alma hassasiyeti yeterli değildi HNPs SH emisyonu ile birlikte hücre otoflüoresanı kayıt için.
Görüntü analizinin uygulanması, proto Bölüm 5'te tarifFilm karelerinin topluluğu uygulanan col bireysel HNP hareket (yön, düzlem içi ve düzlem-deplasman, frekans) hakkında bilgi özü sağlar. Bu analiz (Şekil 4) sonucu in-out ve düzlem-dışı hareket (Şekil 4B'de Fourier dönüşümü bakınız) aynı şekilde kalp küme içinde, frekans sabittir ve yer değiştirmeler, birkaç mikrometre mertebesinde olduğu, göstermektedir (Şekil 4A'da beş NPlerin örnek değiştirmeleri gösteren oklar uzunlukları salınımlarının maksimum uzamaya karşılık gelir).
Şekil 1.. Kalp atış kümeler halinde HESC Farklılaşma ve ikinci harmonik görüntüleme mikroskopi. Undifferentiate için HNPs nanopartiküller ile etiketlemed HESC koloniler (A) 1) StemPro EZPassage aracını (B) kullanarak küçük parçalar halinde kesmek ve düzensiz EBS (C) oluşturmak için süspansiyon izin veya 2) tek hücre içine ayrışmış ve Aggrewell sistemini (B kullanarak reclustered vardı ya ) ') düzenli EBS (C oluşturmak için'. EBS (C veya C ') arasında iki tip süspansiyon içinde 2 gün süre ile kültüre edildi ve daha sonra jelatin kaplı kaplar yapıştırılır. Kardiyomiyositler (D) kümeleri yenerek sonra el hava-sıvı 3D kültürleri (F ve F ') izin ekler üzerinde biriken PTFE filtre üzerine bir neşter ve kültürlü (E) kullanılarak disseke edildi. (Panelleri için ölçek barlar, B, B' C ve C ': 100 mikron; paneller D ve E için:. 250 mikron) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Yalnız PTFE filtre Şekil 2.. PTFE yüzey optik karakterizasyonu. (A) Aydınlık alan görüntüsü. Bu kontrol ölçümü (13 mW) için uygulanan oldukça yüksek lazer yoğunluk ile karşılaştırıldığında, zayıf bir flüoresans görüntüleyen PTFE filtresinin (B) iki foton görüntüsü. (C ve D) çıplak substrata 1 mg / ml konsantrasyonda HNPs ihtiva eden bir damla su ilave edildikten sonra, kendi SH emisyon kolayca nispeten düşük yoğunluğu, lazer (2 mW) de filtre yoluyla elde edilebilir. D'de, filtre üzerinde yayılmış nanopartiküllerin bir 3D görüntüsü gösterilir. (Ölçek çubukları: 50 mikron).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
HNP Şekil 3.. Multiphoton görüntüleme. Kalp yapıları ve EBS etiketli (A) bir dayak küme iki-foton floresan sinyali kırmızı olarak görüntülenir ve HNPs gelen SH sinyal mavi renkte gösterilmiştir. Renkler farklı tayf filtreler ile donatılmış dört nondescanned fotomultiplikatörler ile ölçülen yoğunluğuna karşılık gelir. (Mavi 395 ± 11 nm, yeşil 485 ± 20 nm, sarı 531 ± 40 nm, kırmızı ve 607 ± 70 nm). Bu küme, 720 nm ve 8,8 mW bir ortalama gücün bir eksitasyon dalga boyu ile 10X objektif ile PTFE, gözenekli filtre içinden direkt olarak görüntülendi. (B) z-yığını çıkarılan bir HNP etiketli kalp yapısının bir dilim görünümü. (C) Bir EB PTFE üzerinden görüntülü (A, B ve C için ölçek çubukları: 100 mikron). Bir apoch kullanarak z-taramaları yeniden HNPs ile etiketlenmiş bir EB (D) A 3D görüntü,romatic 40X NA 1.25 suya daldırma hedefi (ölçek çubuğu: 50 mikron). HNPs iyi hareket çözümlemesini sağlayan, bütün EB ve kardiyak küme etrafında yayılır.
Şekil 4. Dayak küme ve düzlem HNPs değiştirmeler (siyah gösterilmiştir SH sinyali) vektörel analiz film (A) Bireysel çerçeve. Okların uzunlukları salınımlarının maksimum uzamaya gelmektedir. (B) Fourier aynı kardiyak küme içinde, frekans sabit olduğunu gösteren NPS salınımlarının dönüşümü-(siyah çizgi) ve hareket (turuncu noktalı çizgi)-düzlem-out ve 0.4 Hz karşılık gelir. Eksenel deplasman haline HNP yoğunluğunu dönüştürmek için kullanılan (C) Kalibrasyon eğrisi (prot Bkz Bölüm 5ocol). Circles: deneysel veri noktası.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kök hücre araştırmaları için nanoteknoloji uygulaması nispeten yeni ama hızla genişleyen bir alandır. Konuyla ilgili yorum eşyalar tarafından işaret edildiği gibi, nanopartiküllerin kullanımı azından oluşturma arasında proteinler ve genler hücre içi iletimi için, (in vitro ve hem de in vivo) izleme hücreden değişen, farklı araştırma görevleri yerine uygulanabilir Belirli farklılaşma tercihli stimülasyonu / engellenmesi için biomimetic hücresel ortamlar 19,20 yolaklar. Kızılötesi uyarma kullanma olasılığı dayalı teknikler floresan ile ilgili olarak artan nüfuz derinliğine yol açar, ancak bu protokol açıklanan yaklaşım, optik izleme ve sınırlıdır; optik görüntüleme tüm vücuda uzun olamaz ve bu nedenle manyetik algılama 21 ile tamamlanmalıdır. Önceki yayınlanan çalışma çeşitli yaklaşımlar, kardiyak hücre kümelerinin yapı ve hareketlerini değerlendirmek gösterdifloresan boyalar 22, kuantum noktalar 23,24 ile cluding etiketleme, süper paramanyetik demir oksit 25 nanopartıkullerinın ve yukarı-dönüşüm floresan parçacıklar 26-28. Bu nanoprobes göre HNPs avantajları uzun bir süre, artan görüntüleme penetrasyon, otofloresansı göre artmış kontrast için dalga uzunluğu Ayarlanabilirliğin üzerinde ağartma yokluğu ile ilişkilidir. Bu yaklaşımla elde edilen kendine özgü seyrek hücre etiketleme (yani Şekil 3D'de biz 100 mikron yan küp yaklaşık 160 NPs saymak) çok iyi yüksek uzaysal 3D insan ESC elde edilen kardiyak kümeler hücre kasılmaları iz uygun olduğu ortaya çıkıyor çözünürlük.
Nanomaterial seçimi PEG kaplı KNbO 3 ile sınırlı değildir, fakat muhtemelen diğer functionaliti dahil olabilir noncentrosymmetric kristal yapıları, görüntüleme nanopartiküller zengin bir aile kapsayabilires (manyetik radyoaktif) multi-modal algılama sağlar. Ayrıca, bu gibi PEG-kaplanmış HNPs daha özel olarak selektif bir alt-popülasyonunu spesifik hücre hedeflemek amacıyla epitop veya bağlayıcı proteinlere karşı yönelik olması işlevselleştirilebilir. Öte yandan, burada önerilen görüntüleme yaklaşımı çok hızlı bir lazer kaynağıyla donatılmış bir tarama mikroskobu gerektirir. Bu işten tasavvur edilebilir doğal bir izlem uzun süreler boyunca nakledilen hücrelerin birleştirilmesini ve işlevselliğini takip etmek, in vitro ve daha doğal dokuların içine 3D biyomalzeme ve iskele yapılarına etiketli hücreleri entegrasyonu izlemektedir.
Filtreler kontaminasyonlarına riskleri olmadan destekler geri ekleme restore edilebilir gibi 3D agrega taşıyan PTFE filtreleri kullanarak bir avantajı, bizim durumumuzda olduğu gibi, günler ve haftalarda birden ölçümler yapmak imkanı vardır. Daha da önemlisi, PTFE filtreleri de eylem pot tekrarlayan değerlendirilmesini sağlamakmulti-elektrot dizileri kullanarak entials.
Yakın-kızılötesi bölgesindeki çoklu foton uyarılması için hücre zarar eşikleri, daha önce König ve diğerleri 29 'den az 1 TW / cm 2 tespit edilmiştir. Bizim çalışmamızda, 0.75 NA 20X objektif kullanılarak, uygulanan yoğunluk König çalışmaları (80 mikro-saniye) ile karşılaştırıldığında, TW / cm 2 (0.26 TW / cm 2) ve kısa piksel kalma süresi (0.1 mikro-saniye) altında kalan olasılığını sağlar canlı ve ayırt örnek korumak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Avrupa FP7 Araştırma Projesi NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) ve INTERREG IV Fransa-İsviçre NAOMI projeden kısmi fon kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H.
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
