Summary
提供用于体外标记的人类胚胎干细胞的二次谐波产生的纳米颗粒协议的细节。方法通过对多光子显微镜和其分化成心肌人类胚胎干细胞群的调查也被提出。
Abstract
在这个可视化实验，提供了协议的细节进行体外标记的人类胚胎干细胞的（胚胎干细胞）与二次谐波产生的纳米颗粒（的HNP）。后者是最近推出的用于标记的生物样品的多光子成像探测的一个新的家庭。的HNP是能够通过产生二次谐波的非线性光学过程与激发波长没有限制激发光的频率加倍。
多光子为基础的方法进行人类胚胎干细胞分化成心肌集群（如保持长期的气 - 液培养）将详细介绍。尤其是，显示在如何在三维监测跳动心脏组织中的3D最大化激烈二次谐波（SH）分离的HNP排放的证据。所得到的图像的分析来检索三维位移模式也详细描述。
Introduction
非线性显微镜系统中，由于其固有的三维切片能力，已越来越多地用于触发光稳定的荧光团与双光子吸收带在近红外的需求。仅在过去的几年中，以补充基于荧光的标签（染料，量子点，上转换纳米颗粒），不同的成像方法已被开发利用了一种新的非线性固有的纳米粒子的家庭作为标签， 即发展谐波纳米粒子（的HNP）已对多光子显微镜是专门开发的。这些标签的基础上，无机非中心对称晶体，施加的光学对比度产生激励频率的SH：例如通过转换的近红外脉冲激发光的一小部分（λ= 800纳米）转换成可见光的蓝光（λ/ 2 = 400nm）的。几位作者在最近的过去已经测试了不同的材料，包括铁碘酸铁（IO
在这个可视化实验，提供了协议的细节进行体外标记的人类胚胎干细胞的（胚胎干细胞）与未官能化的HNP。胶体悬浮液的合成与制备详见以前的出版物和参考文献16和超出了工作范围。方法通过对多光子显微镜和其分化成心肌集群（如保持长期气 - 液培养）人类胚胎干细胞研究被提出。人类ESC可以让两种不同的方法，或者通过EB形成集落的碎片在悬浮液，或者，迫使单细胞进入胚体使用Aggrewell板聚集，如示于图1A中所谓的类胚体（EB）内，以区分。培养簇跳动心肌细胞对聚四氟乙烯（PTFE）多孔过滤因子ilitates他们的长期维护进行进一步的研究（例如电动作电位测量）。
扫描显微镜的激发源应当能够提供超短脉冲（与脉冲持续时间超过300飞秒较小的样本），以达到执行的HNP的二次谐波成像所需要的峰值功率。例如，用于成像的最常见FSEC源是可调谐的Ti：蓝宝石激光器。可替换地，其他超快激光器可以采用，例如铒离子17，铬镁橄榄石18或Ti：蓝宝石泵浦红外光参量振荡器。显微镜可以配备一个客观与优选相当高的数值孔径。非常重要的是，之前的测量值，并且目标是，每次更换，这是强制性的，通过优化激光脉冲预压缩机的设置在工作，以减少存在于该集合式（镜片）的分散波长选择。此过程中，在协议中详细描述的，确保了激光脉冲是尽可能接近到变换有限的持续时间（ 即最短可能的话）在焦平面和最大限度地提高了样品的非线性响应。
在协议结束时描述的图像分析的目标是识别并跟踪在跳动的心脏簇的节律性收缩相关联的三维运动的HNP。在图像平面中的跟踪纳米粒子被简单地通过确定它们在连续的动画帧的位置来实现。以提取的轴向运动信息，将非线性响应强度作为轴向位移的一个函数的现有校准是必须的。请注意，对于长期测量，样品的轴向位置的有源干涉控制是必需的，以保持校准曲线的有效性在热和/或机械漂移的存在。
这里使用的TRAC的的HNP聚集在ê跳动电池是基于铌酸钾氧化（的KNbO 3），但其他可用的非线性纳米材料中详细Staedler 等[16]的工作进行检讨。
大部分至今调查纳米材料的非线性光学效率是非常类似的。为的KNbO 3的选择基本上是由胶体溶液的稳定性好，并具有良好的生物相容性，对几种人类细胞系，即使在相当高的浓度和较长的论述16次测试的动机。
鉴于用于这项工作的纳米材料的新颖性，的HNP相比荧光灯/荧光生物标记物的主要特征都显示在很短的原始计算机影视动画由作者来实现。
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Protocol
1，文化与扩展人类的ESC
- 制备含有基因敲除DMEM细胞繁殖培养基（称为PM）的补充有20％敲除血清，1％MEM非必需氨基酸，1％L-谷氨酰胺的200mM，1％青霉素 - 链霉素，和3.5微升β-巯基乙醇。
- 在8ml下午中等解冻人类胚胎（胚胎干细胞）和他们离心5分钟，在115 XG放弃DMSO-辅以冷冻介质。
- 加入1 ml PM培养基含有10mM摇滚抑制剂以阻止细胞凋亡和促进细胞存活时解冻（仅24小时培养）。
- 加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的PM在所需的浓度（4-10纳克/毫升），用于维护多能性的。
- 板状的人类胚胎干细胞上照射的人包皮的饲养细胞（γHFF）（ 图1A），预先以2×10 4个细胞/ cm 2的浓度接种。
- 媒体每天都在变化，必要时，删除的c部分olonies开始吸用细长的大幅削减巴斯德吸管来区分。
- 每周一次，通过菌落酶：
- 除去培养基并用2ml PBS洗涤菌落。
- 除去PBS，用每温暖的胶原酶IV以及0.5毫升在37℃，5％CO 2孵育他们在1毫克/毫升10分钟。
- 收集菌落片段在2毫升新PM和离心机在115×g离心3分钟。
- 或者，菌落可以机械地刮传代：
- 除去培养基并用2ml PBS洗涤菌落。
- 手动刮使用STEMPRO EZPassage辊刮板工具（ 图1B）的菌落。
- 收集菌落片段和离心再进行3分钟，在115×g离心以去除上清液。
- 上γHFF或板碎片处理它们分化成胚状体（EB）。
2，人类胚胎干细胞分化协议
- 制备使用基因敲除DMEM分化培养基（DM）的补充有2％Hyclone公司血清，1.0％MEM非必需氨基酸，1.0％L-谷氨酰胺的200mM，1％青霉素 - 链霉素，3.5微升β-巯基乙醇。
- 除去培养基并用2ml PBS洗涤菌落。
- EB形成菌落片段的悬挂系统：
- 除去PBS，用每温暖的胶原酶IV以及0.5毫升在37℃，5％CO 2孵育他们在1毫克/毫升10分钟。
- 收集菌落片段在2毫升新DM和离心机在115×g离心3分钟。
- 它们培养在悬浮液中的超低附件6孔板中（每孔2毫升）溶液4天（ 图1C）。
- 收集和板新形成拟胚体上0.1％明胶包被的24孔板（约3的EB /孔）（ 图1D）。
- 或者，使用Aggrewell板被迫单细胞聚集成的EB：
- 除去PBS中，使用的Accutase（0.5毫升/孔）分离菌落成单个细胞。
- 离心重悬细胞在糖尿病为1.2×10 6 /毫升。
- 加每Aggrewell室2毫升1天（ 图1B'）。
- 收集新形成拟胚体（ 图1C'）和板他们在0.1％明胶包被的24孔板（约3的EB /孔）。
- 改变糖尿病每隔2-3天，直到跳动的心肌细胞簇（15-30天）的外观。
3，空气液体3D打集群和标签用的HNP的培养
- 识别和手动剖析簇跳动的心肌细胞（ 图1D）的，通常出现2-4周的培养后，用细长的大幅削减巴斯德吸管。
- 每个刀片存款4聚四氟乙烯过滤器将被放置在一个6孔板（ 图1F）。
- 加入1 ml的DM介质对EAC的顶部ħ很好。
- 新增一个解剖上跳动每PTFE过滤器（ 图1E）集群，最大4/well，每盘（ 图1F'）， 即 24集合体。
- 改变DM媒体每隔2-3天。
- 标注集群，删除包含簇跳动的PTFE过滤器，并把它放在3.5厘米玻璃底菜（170微米厚）。
- 加入1 ml的HNP的以50μg/ ml的30分钟的浓度。
4，非线性光学成像
- 样品制备。后HNP标签（见步骤3.6），聚四氟乙烯过滤器在具有高数值孔径物镜的工作距离兼容的170微米厚的玻璃底培养皿或者转让全差分早HEBS或心脏跳动集群（收缩时的外观解剖）。可替换地，应用跳动簇的玻璃底培养皿预先涂有0.1％明胶的直接涂布。
- 转移样品至一个所有功能于一身的显微镜配备孵育室中确保稳定的温度，湿度和CO 2控制在延长的时间周期。
- 经过初步检查，图像在白光照明下通过宽视场成像的样品，以确定拟胚体分化或将要选择作进一步调查活动的跳动集群内的利益结构。
- 如果从NADH细胞的自体荧光和从的HNP SH，必须同时取得，设定更短的激光激发波长（ 即 720纳米），以匹配分子的吸收。使用中心在半激发波长1窄的带通滤波器的频谱（ 即 ，λ= 360±10nm的）来检测SH，另一个用于检测自体荧光。
- 首先执行快速，分辨率低，三维扫描重建心脏簇的整体形态和簇体积与几个可见HNP内选择一个图像平面秒。
- 如果有必要，随意改变激发波长达到最佳匹配样品的光学性能或避免光漂白，光损伤和形象深入到组织中红外波长（ 即 790纳米），因此更换二次谐波滤波器（ 即 395纳米）。通过最大化的HNP沉积在样品的二次谐波信号优化激光脉冲预压缩机的设置在所选择的工作波长。
- 为了实时监控心脏集群收缩，置显微镜光学扫描仪在最快的模式，如谐振模式，允许高速采集的二维图像。
- 选择设置，图像的对比度和采集速度，如之间的最佳折衷：
- 扫描平均：4
- 像素停留时间：0.1微秒
- 图像速率：每秒3.75张（fps）
- 激光功率根据焦光点S调整IZE和扫描速度。 50 mW（在物镜的入射光测定）为0.1微秒像素停留时间和计划的APO 20X NA 0.75物镜保持细胞活力的典型值。
5，图像分析
- 轴向校准程序。选择一个HNP沉积在裸露的基材。调整焦点（ 即在纳米粒子的轴向位置），用于最大化SH强度。变化以受控的方式在显微镜载物台的轴向位置，以获得与SH强度为HNP的函数的校正曲线从焦平面偏移。这个校准程序，为计划的APO 20X NA 0.75物镜的输出报告图4C。
- 选择存在于所有的视频帧的HNP，并确定其周期性波动。这个程序可以很容易地实现自动化，例如通过在一个定义的感兴趣区域寻求信号的最大强度点的自定义代码和连接它们不同的帧之间（写在Matlab R2009 B使用功能的图像处理工具箱的“区域道具'的例子代码提交）。
- 评估出平面的位移，与非连续可追踪的HNP移动沿着光轴，通过将它们的强度调制，在整个不同的帧转换成轴向位移利用在步骤5.1确定的校准曲线相关联的量化。注意，该程序可以访问的轴向移动，但不能用来确定绝对方向（向上或向下）。
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Representative Results
之前评估由共焦成像的打浆作用，进行了仔细表征的PTFE过滤器的非线性光学响应的，单独的或的HNP的存在下，在高浓度（1毫克/毫升）。它确保：i）该裸基材双光子激发荧光很弱，不能防止测量相关的生物样本，以及ii）从孤立的HNP了SH排放可以通过外延检测模式的基板很容易获得通过成像（ 图2）。其目的是有参考控件，用于三维位移的量化。
在图3中 ，HNP-标记的心脏结构和胚被显示。红色（ 图3A），黄色（ 图3B和3C）和绿色（ 图3D）的颜色对应于NADH的自体荧光，而强烈的蓝色斑点SH从孤立HNP干。有趣的是，宝INT出非常良好的光学对比度达到通过这种技术和相对稀疏的标记相对于其他纳米粒子为基础的方法，如量子点，或上转换纳米粒子。在本研究中，有非常强烈的孤立的标签是便于跟踪几个独立的单个粒子的运动和重建干细胞衍生结构的集体运动。
图3B示出了HNP-标记的心脏跳动的簇的切片图。这样的三维结构可以被记录在高速并监控在小区HNP聚合收缩图案所报告的电影1，在这种情况下，保持较高的采集速率为解决NP运动，总的接收灵敏度不充分用于记录细胞的自体荧光与来自的HNP SH排放。
图像分析应用中的原第5节所述适用于动画帧的合奏山坳使的关于个别HNP运动（方向，平面内和外的平面位移，频率）信息的提取物。该分析（ 图4）的结果表明，在相同的心脏簇内，频率是恒定的和出的平面运动（参见图4B傅立叶变换）和位移的几微米量级的（表示纳米粒子5在图4A的示范性位移的箭头的长度对应于振荡的最大伸长率）。
图1：人类胚胎干细胞分化成心脏跳动集群和的HNP纳米粒子的二次谐波成像显微镜。Undifferentiate标签ðhESC克隆（A）要么1）削减成小块使用STEMPRO EZPassage工具（B）和让悬浮液中，以形成不规则的EB（C），或2）解离为单细胞，并使用Aggrewell系统（B reclustered '），以形成常规的EB（C'）。这两种类型的拟胚体（C或C'）中培养悬浮液中2天，然后附着到明胶包被的培养皿。跳动的心肌细胞簇（ 四），然后手动使用沉积在插入，让气-液3D文化（F和F'）上的PTFE过滤器手术刀和培养（E）解剖。（比例尺为板A，B，B' ，C和C'：100微米;对板D和E：250微米） 请点击此处查看该图的放大版本。
单独的PTFE过滤器图2。聚四氟乙烯基材的光学特性（A）明场图像。 PTFE过滤器相比，应用此控制测量（13毫瓦）的相当高的激光强度，其显示微弱的荧光（B）的双光子图像。 （C和D）加入到裸基片含有的HNP为1毫克/毫升浓度的水滴后，其SH排放可以很容易地通过过滤器在相对 较低的激光强度（2毫瓦）购得。在D中，示出了散布在过滤器上的纳米颗粒的三维图像。 （比例尺：50微米）。
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HNP图3。多光子成像标记心脏结构和EBS（A）跳动的群集的双光子荧光信号显示为红色，并从的HNP了SH信号显示为蓝色。颜色对应于通过配备不同的光谱过滤器的四个nondescanned光电倍增管测得的强度。 （蓝395±11纳米，绿色485±20纳米，黄色531±40 nm，而红色607±70纳米）。该簇被直接成像，通过使PTFE多孔过滤器具有10X物镜为720纳米，8.8毫瓦的平均功率的激发波长。 （ 二）从z堆栈中取出一个HNP标记心脏结构的切片视图。通过PTFE（C）的EB成像（比例尺为A，B和C：100微米）。一个EB的使用apoch（D）的3D图像标记的HNP，从Z-扫描重建浪漫之40X NA 1.25水浸泡的目的（比例尺：50微米）。该的HNP是围绕着整个EB和心丛式井蔓延，使运动分析。
图4。跳动集群和平面内的HNP位移（显示为黑色SH信号）的矢量分析的电影（ 一 ）个人框架。箭头的长度对应于振荡的最大伸长率。 （B）傅里叶粒子振荡示出，同样的心簇内，频率是恒定的变换- （黑线）和列的平面内运动（橙色点线）和对应于0.4赫兹。 （C）校准曲线用来转换HNP强度为轴向位移（见普罗特第5OCOL）。圈子：实验数据点。
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Discussion
纳米技术的应用，干细胞研究是一个相对较新的，但迅速扩大的领域。正如关于这一主题的各种评论文章，利用纳米颗粒的可应用来完成不同的任务的研究，从细胞追踪（ 在体外和在体内 ），向细胞内递送的蛋白质和基因，建立至少不仿生蜂窝环境中的特定分化优惠政策刺激/抑制通路19,20。在本协议中所述的方法是有限的，以光学跟踪，虽然采用红外线激发的可能性，导致增加的穿透深度相对于基于荧光技术;光学成像不能扩展到全身，因此，应通过磁检测21来补充。上一页发表的作品表现出几种方法来评估心脏细胞簇的结构和运动，在通过荧光染料22，量子点23,24 cluding标签，超顺磁性氧化铁纳米粒子25，和上转换荧光颗粒26-28。的HNP相对于这些纳米探针的优点是与无漂白的过长时间，增加成像渗透，波长可调谐性为相对于自发荧光增加的对比度相关联。通过这种方法获得的特殊的稀疏细胞标记（ 即 图3D，我们计算一个100微米边立方体约160 NPS），真可谓是非常适合追踪细胞收缩的三维人体ESC源性心脏病集群在高空间分辨率。
纳米材料的选择不限于PEG-涂覆的KNbO 3，但可以包括一个丰富 的纳米颗粒显示非中心对称的晶体结构，它可以有可能将其他functionaliti的家庭ES（磁性，放射性），允许多模式检测。此外，这种聚乙二醇涂层的HNP可以进一步功能化将特别针对以表位或结合蛋白定向选择性地针对特定的细胞亚群。在另一方面，这里所提出的成像方法需要配备一个超快激光源扫描显微镜。一个自然的跟进，可以从这项工作设想是监测标记细胞融入3D生物材料和脚手架结构体外 ，并进一步为本地组织，遵循细胞移植在较长期间内注册成立及功能。
使用PTFE过滤器轴承的三维聚集的优势，因为在我们的情况下，结束了几天和几周内进行多次测量的可能性，如过滤器可以恢复回其插入支持没有污染的风险。更重要的是，PTFE过滤器也使行动壶的重复评估entials使用多电极阵列。
细胞的损伤阈值的近红外多光子激发先前已确定为小于1 TW /厘米2由柯尼希等 29。在我们的研究中，采用了0.75 NA 20X物镜，施加的强度仍然低于TW /厘米2（0.26 TW /厘米2）和短的像素停留时间（0.1微秒）相比，柯尼希的工作（80微秒）可确保的可能性保存样品活着的，与众不同。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢来自欧洲FP7研究项目NAMDIATREAM（NMP4-LA-2010-246479，http://www.namdiatream.eu）和INTERREG IV法国 - 瑞士NAOMI项目的部分资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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