Summary
Protokol detaljer leveres til in vitro-mærkning af humane embryonale stamceller med anden harmoniske generere nanopartikler. Metoder til hESC undersøgelse af multi-foton mikroskopi og deres differentiering i hjertets klynger er også præsenteret.
Abstract
I denne visualiserede eksperiment, er protokol detaljer i henhold til in vitro-mærkning af humane embryonale stamceller (embryonale) med anden harmonisk generation nanopartikler (HNPs). Sidstnævnte er en ny familie af sonder nylig blev indført til mærkning af biologiske prøver til multi-foton billeddannelse. HNPs er i stand til at fordoble frekvensen af excitation lys ved lineære optiske proces anden harmoniske generation med ingen begrænsning på excitationsbølgelængden.
Multi-foton metoder for hESC differentiering i hjertets klynger (vedligeholdes som langsigtede værelser med flydende kulturer) er præsenteret i detaljer. Især er bevis på hvordan man kan maksimere den intense anden harmoniske (SH) emission af isolerede HNPs under 3D-overvågning for at slå hjertevæv i 3D vist. Analysen af de fremkomne billeder at hente 3D mønstre forskydning ligeledes registreres.
Introduction
Ulineære mikroskopi-systemer, takket være deres iboende tredimensionelle Sektionering kapaciteter, har i stigende grad udløst kravet om foto-stabil fluorophores med to-foton absorption bands i nær-infrarød. Kun i de sidste par år, som supplement til udviklingen af fluorescens-baserede labels (farvestoffer, kvantepunkter, op-konverterende nanopartikler), en anden billeddannende metode er blevet udnytte anvendelsen af en ny familie af sagens natur ikke-lineære nanopartikler som etiketter, dvs harmoniske nanopartikler (HNPs), som er blevet specielt udviklet til multi-foton mikroskopi. Disse etiketter, der er baseret på uorganiske noncentrosymmetric krystaller, udøve optisk kontrast generere SH af ekscitationsfrekvensen: for eksempel ved at konvertere en brøkdel af nær infrarødt pulserende excitation lys (λ = 800 nm) til synligt blåt lys (λ / 2 = 400 nm) . Adskillige forfattere i den seneste tid har testet forskellige materialer, herunder jern iodat Fe (IO
I denne visualiserede eksperiment, er protokol detaljer i henhold til in vitro-mærkning af humane embryonale stamceller (embryonale) med ikke-funktionaliserede HNPs. Syntesen og forberedelse af kolloide suspensioner er nærmere beskrevet i en tidligere publikation og i referencerne deri 16 og er uden for rammerne af dette arbejde. Metoder til hESC undersøgelse af multi-foton mikroskopi og deres differentiering i hjertets klynger (vedligeholdes som langsigtede værelser med flydende kulturer) præsenteres. Menneskelige ESC kan lade til at differentiere indenfor såkaldte embryoid organer (EBS) på to forskellige måder, enten ved EB dannelse af kolonier fragmenter i suspension eller alternativt tvungne sammenlægning af flere celler i EB'er bruger Aggrewell plade, som vist i figur 1A . Dyrkning slå klynger af hjerteceller på polytetrafluorethylen (PTFE) porøse filtre FACilitates deres opretholdelse på lang sigt for yderligere undersøgelser (f.eks elektrofysiologiske målinger af aktionspotentialer).
Ekscitationskilden af scanningmikroskop bør være i stand til at levere ultrakorte impulser (med en impulsvarighed på mindre end 300 fsec på prøve) med henblik på at nå den maksimale effekt er nødvendig for at udføre anden harmonisk billeddannelse af HNPs. For eksempel er den mest almindelige fsec-kilde anvendes til billeddannelse er afstemmelige Ti: safir lasere. Alternativt kan andre ultrahurtige lasere anvendes, for eksempel erbium ion 17, krom forsterit 18 eller Ti: safir pumpes infrarøde optiske parametriske oscillatorer. Mikroskopet kan være udstyret med et objektiv med fortrinsvis en temmelig høj numerisk blænde. Meget vigtigere, før målinger, og hver gang målet er udskiftet, er det obligatorisk at minimere spredningen til stede i set-up (lygteglas) ved at optimere indstillingerne for laserpuls pre-kompressor på arbejdsmiljøetbølgelængde valg. Denne procedure, beskrevet i protokollen, sikrer, at laser puls er så tæt som muligt på den omdanne begrænset varighed (dvs. kortest som muligt) ved brændplanet og maksimerer prøven lineær respons.
Målet med billedanalyse beskrevet i slutningen af protokollen er at identificere og spore i 3D HNPs bevægelser forbundet med de rytmiske sammentrækninger for at slå hjerte klynger. Sporing af nanopartikler i billedplanet er simpelthen realiseres ved at identificere deres positioner i successive filmbilleder. At udtrække oplysninger om aksial bevægelse, en forudgående kalibrering af den ikke-lineære intensitet reaktion som en funktion af aksial forskydning er obligatorisk. Bemærk, at for langsigtede målinger, en aktiv interferometrisk kontrol af prøve aksial position er nødvendig for at opretholde dets gyldighed i kalibreringskurven i overværelse af termiske og / eller mekaniske driver.
De HNPs bruges her til trace slå celler i aggregater er baseret på kalium niobate oxid (KNbO 3), men andre tilgængelige ulineære nanomaterialer gennemgås i detaljer i arbejdet i Staedler et al 16.
De lineære optiske effektivitetsgevinster af de fleste af de nanomaterialer undersøgte hidtil er meget sammenlignelige. Valget for KNbO 3 blev hovedsageligt motiveret af god stabilitet i kolloid opløsning og dens gode biokompatibilitet, testet på adskillige humane cellelinjer selv ved forholdsvis høj koncentration og lange redegørelsen gange 16.
I betragtning af den nyhed af nanomateriale ansat til dette arbejde er de vigtigste karakteristika HNPs sammenlignet med fluorescerende / selvlysende biomarkører vist i en kort oprindelige computer video animation realiseret af forfatterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kultur og Udvidelse af human ESC
- Forbered celle formering medium (kaldet PM) indeholdende Knockout DMEM suppleret med 20% Knockout Serum, 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1% L-glutamin 200mM, 1% penicillin-streptomycin og 3,5 pi β-mercaptoethanol.
- Tø human ESC (embryonale) i 8 ml PM medium og centrifugere dem 5 minutter ved 115 xg at kassere DMSO-suppleret frysning medium.
- Tilsæt 1 ml PM-medium indeholdende 10 mM Rock inhibitor at forhindre apoptose og forbedre celleoverlevelse efter optøning (24 timer kun inkubation).
- Tilføj basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) til PM i den ønskede koncentration (4-10 ng / ml) til vedligeholdelse af pluripotency.
- Plate hESC på bestrålede humane forhuds fødeceller (γHFF) (figur 1A), der tidligere er udpladet i en koncentration på 2 x 10 4 celler / cm2.
- Skift medium dagligt og, når det er nødvendigt, fjerne dele af colonies begynder at differentiere ved aspiration ved anvendelse af en langstrakt skarpt skårne Pasteur-pipette.
- Gang om ugen, kolonier passage enzymatisk:
- Fjern mediet og vask kolonier med 2 ml PBS.
- Fjern PBS og inkuberes dem med 0,5 ml per brønd varm collagenase IV ved 1 mg / ml i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Saml koloni fragmenter i 2 ml ny PM og centrifuger ved 115 xg i 3 min.
- Alternativt kan kolonier passeres mekanisk ved skrabning:
- Fjern mediet og vask kolonier med 2 ml PBS.
- Manuelt skrabe kolonier ved hjælp af StemPro EZPassage valse skraber værktøj (figur 1B).
- Saml koloni fragmenter og centrifugeres derefter i 3 minutter ved 115 xg for at fjerne supernatanten.
- Plate fragmenter på γHFF eller forarbejde dem for differentiering i embryoid organer (EBS).
2.. Menneskelige ESC DifferentieringProtokol
- Forbered differentiering medium (DM) under anvendelse Knockout DMEM suppleret med 2% Hyclone serum, 1,0% MEM ikke-essentielle aminosyrer, 1,0% L-glutamin 200mM, 1% penicillin-streptomycin, 3,5 pi β-mercaptoethanol.
- Fjern mediet og vask kolonier med 2 ml PBS.
- EB dannelse af kolonier fragmenter i suspension:
- Fjern PBS og inkuberes dem med 0,5 ml per brønd varm collagenase IV ved 1 mg / ml i 10 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Saml koloni fragmenter i 2 ml ny DM og centrifuger ved 115 xg i 3 min.
- Kultur dem i suspension i ultra-lav tilknytning plader med 6 brønde (2 ml per brønd) i 4 dage (Figur 1C).
- Saml og pladen de nydannede EB'er på 0,1% gelatine-coatede 24-brønds plader (ca. 3 EB'er / brønd) (figur 1D).
- Alternativt tvungen sammenlægning af flere celler i EB'er vha. Aggrewell plade:
- Fjern PBS ogdissociere kolonier i enkelte celler ved anvendelse af Accutase (0,5 ml / brønd).
- Centrifuge og resuspender cellerne i DM på 1,2 x 10 6 / ml.
- Tilsæt 2 ml pr Aggrewell kammer i 1 dag (figur 1B).
- Saml nydannede EBS (Figur 1C ') og plade dem på 0,1% gelatineovertrukne 24 brønde (ca. 3 EB'er / godt).
- Skift DM hver 2-3 dage, indtil fremkomsten af at slå klynger af cardiomyocytes (15-30 dage).
3.. Air-flydende 3D Kulturer af Beating Klynger og mærkning med HNPs
- Identificere og manuelt dissekere klynger af at slå cardiomyocytter (figur 1D), der normalt optræder efter 2-4 ugers kultur, ved hjælp af et aflangt skarpt skårne Pasteur pipette.
- Depositum 4 PTFE filtre pr indsats, der vil blive placeret på en 6-brønds plade (figur 1F).
- Tilsæt 1 ml medium DM på toppen af EACh godt.
- Tilføj en dissekeret slå klynge på hver PTFE filter (Figur 1E), maks. 4/well, dvs 24 aggregater per plade (figur 1F ").
- Skift medium DM hver 2-3 dage.
- At mærke de klynger, fjerne PTFE filter, der indeholder bankende klynge og sætte det på 3,5 cm glasbund fad (170 um tyk).
- Tilsæt 1 ml HNP ved en koncentration på 50 ug / ml for 30 min.
4.. Ikke-lineære optiske Imaging
- Prøveforberedelse. Efter HNP mærkning (se trin 3.6), overføres enten hele differentierende tidlige HEBS eller hjerte-bankende klynger (dissekeret på sammentrækning udseende) på filtre PTFE over en 170 um tyk glas-bund fad kompatibel med arbejdsmiljøet afstand af målene høj numerisk blænde. Alternativt anvende en direkte belægning for at slå klynger til glas-bund fad præ-belagt med 0,1% gelatine.
- Overfør prøver til enalt-i-én mikroskop udstyret med inkubere kammer sikre en stabil temperatur, fugtighed og CO 2 kontrol over længere perioder.
- Efter indledende inspektion, billede prøven via bredt felt imaging under hvidt lys belysning til at identificere strukturer af interesse inden for differentierede EB'er eller aktive bankende klynger, som vil blive udvalgt til yderligere undersøgelser.
- Hvis celle autofluorescens fra NADH og SH fra HNPs skal samtidig erhvervet, fastsætte en kortere laserexcitation bølgelængde (dvs. 720 nm) til at matche den molekylære absorption. Brug en smal band-pass spektrale filter centreret ved halvdelen excitationsbølgelængden (dvs. λ = 360 ± 10 nm) for at påvise SH, og en anden til at detektere autofluorescens.
- Først udføre en hurtig, lav opløsning, tre-dimensionelle scanning for at genopbygge den overordnede morfologi hjertets klynge og vælg et billede plan inden for klyngen volumen med flere synlige HNPsek.
- Hvis det er nødvendigt, skal du ændre excitationsbølgelængden frit som bedst passer til prøvens optiske egenskaber eller for at undgå fotoblegning, foto skader og billedet dybere ind i væv med en IR bølgelængde (dvs. 790 nm), og udskift den anden harmoniske filter tilsvarende (dvs. 395 nm ). Optimer indstillingerne for laserpuls pre-kompressor på arbejdsmiljøet bølgelængde på valg ved at maksimere den anden harmoniske signal HNPs deponeret på prøven.
- Til overvågning i realtid hjertets klynge sammentrækninger, indstille mikroskop optisk scanner i den hurtigste tilstand såsom resonante mode, så høj hastighed erhvervelse af to-dimensionelle billeder.
- Vælg indstillingerne som bedste kompromis mellem billedets kontrast og erhvervelse hastighed, såsom:
- Scan gennemsnitsberegning: 4
- Pixel opholdstid: 0.1 mikrosekunder
- Billede rate: 3,75 frames per sekund (fps)
- Laser effekt justeres efter brændpunkt size og scanning hastighed. 50 mW (målt ved indgangen af målet) er en typisk værdi for 0,1 usek pixel opholdstid og Plan APO 20X NA 0.75 mål at bevare cellernes levedygtighed.
5.. Image Analysis
- Axial kalibreringen. Vælg et enkelt HNP deponeret på en bar substrat. Juster fokus (dvs. aksiale position nanopartikel) til maksimering af SH intensitet. Varierer på en kontrolleret måde den aksiale position af mikroskopbordet at opnå kalibreringskurven vedrørende SH intensitet som en funktion af HNP forskudt fra brændplanet. Resultatet af denne kalibrering procedure for Plan APO 20X NA 0.75 mål er rapporteret i figur 4C.
- Vælg HNPs stede i alle videobilleder og bestemme deres periodiske bevægelser. Denne procedure kan let automatiseres, for eksempel ved en brugerdefineret kode søger for maksimal signal intensitet pletter i et nærmere defineret område af interesse ogforbinde dem blandt forskellige rammer (et eksempel kode skrevet i Matlab R2009 b at bruge funktionen 'regionens rekvisitter «i Image Processing Toolbox præsenteres).
- Vurdere kvantificering af out-of-plane forskydninger, der er forbundet med ikke-kontinuerligt sporbare HNPs bevæger sig langs den optiske akse, ved at konvertere deres intensitet modulationer i hele forskellige rammer i aksial forskydning ved hjælp af kalibreringskurven optegnes i trin 5.1. Bemærk, at denne procedure giver adgang til aksiale bevægelser, men kan ikke anvendes til at bestemme den absolutte retning (opad eller nedad).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forud for vurdering af bankende aktivitet ved konfokal billeddannelse blev en omhyggelig karakterisering af den ikke-lineære optiske respons af filtre PTFE udføres enten alene eller i nærværelse af HNPs ved høj koncentration (1 mg / ml). Det blev sikret, at: i) den nøgne substrat to-foton exciteret fluorescens er meget svag og kan ikke forhindre at måle de relevante biologiske prøver, og ii) SH emission fra isolerede HNPs let kan erhverves ved billeddannelse gennem underlaget i epi-afsløring tilstand (figur 2). Målet var at have reference-kontrol til kvantificering af 3D-forskydning.
I figur 3 er HNP-mærkede hjerte strukturer og EB'er vises. Den røde (figur 3A), gul (figur 3B og 3C) og grønt (figur 3D) farver svarer til NADH autofluorescens, mens intense blue SH pletter stammer fra isolerede HNP. Det er interessant at point ud meget god optisk kontrast opnås ved denne teknik, og den relativt sparsomme mærkning i forhold til andre nanopartikler-baserede metoder, såsom kvantepunkter eller op-konvertering nanopartikler. I den foreliggende undersøgelse, har meget intense isolerede etiketter var fordelagtig for sporing flere uafhængige individuelle partikel bevægelser og rekonstruere kollektiv bevægelse af stamcelle-afledte strukturer.
Figur 3B viser et udsnit af en HNP-mærket cardiac bankende klynge. Sådanne 3D-strukturer kan derefter optages ved høj hastighed for at overvåge sammentrækning mønster i celle-HNP aggregat som rapporteret i Movie 1. I dette tilfælde at opretholde en høj erhvervelse hastighed sats for at løse NP bevægelse, den samlede erhvervelse følsomhed ikke var tilstrækkelig til optagelse celle autofluorescens sammen med SH emission fra HNPs.
Anvendelsen af billedanalyse beskrevet i afsnit 5 i protocol påføres ensemble af filmbilleder muliggør uddrag af oplysninger om individuel HNP bevægelse (retning, i plan og ude af plan forskydning, frekvens). Resultatet af denne analyse (figur 4) viser, at inden for den samme hjerte-klynge, frekvensen er konstant for ind-og out-of-plane bevægelse (se Fouriertransformation i figur 4B) og forskydninger er af størrelsesordenen nogle få mikrometer (længderne af de pile, der angiver de eksemplariske forskydninger af fem NP i figur 4A svarer til den maksimale forlængelse af svingninger).
Figur 1.. Differentiering af embryonale i hjertets bankende klynger og mærkning med HNPs nanopartikler til anden harmoniske imaging mikroskopi. Undifferentiated hESC kolonier (A), var enten 1) skære ned i mindre stykker ved hjælp af StemPro EZPassage værktøj (B) og lad i suspension for at danne uregelmæssige EBS (C), eller 2) dissocieret i enkeltceller og reclustered bruge Aggrewell systemet (B ") til at danne regelmæssige EBS (C '). Begge typer af EB (C eller C ') blev dyrket i 2 dage i suspension og derefter klæbet til gelatineovertrukne retter. Beating klynger af cardiomyocytes (D) blev derefter manuelt dissekeret ved hjælp af en skalpel og dyrket på filtre PTFE (E) deponeret på indstik at give luft-væske 3D kulturer (F og F '). (Skala stænger til panelerne A, B, B' , C og C ': 100 m; for paneler D og E:. 250 um) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. PTFE substrat optisk karakterisering. (A) Bright felt billede af PTFE filter det alene. (B) To-foton billede af filteret PTFE, som viser en svag fluorescens i forhold til den temmelig høje laserintensiteten anvendes til denne kontrolmåling (13 mW). (C og D) Efter tilføjelse til den nøgne substrat en vanddråbe indeholder HNPs ved 1 mg / ml koncentration, deres SH emission kan nemt erhverves gennem filteret ved forholdsvis lave laser intensitet (2 MW). I D, et 3D-billede af nanopartikler spredes på filteret vist. (skala stænger: 50 pm).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
Figur 3.. Multiphoton billeddannelse af HNP mærket hjerte strukturer og EB'er. (A) De to-foton fluorescens signal af et bankende klynge vises i rødt, og SH signalet fra HNPs vises i blåt. Farverne svarer til intensiteten målt ved fire nondescanned fotoforstærkere udstyret med forskellige spektrale filtre. (Blå 395 ± 11 nm, grøn 485 ± 20 nm, gul 531 ± 40 nm, og rød 607 ± 70 nm). Denne klynge blev afbildet direkte gennem PTFE porøse filter med en 10X objektiv med en excitationsbølgelængde på 720 nm og en gennemsnitlig effekt på 8,8 mW. (B) Et udsnit af en HNP mærket hjertestruktur udvindes fra en z-stak. (C) En EB afbildet gennem PTFE (skala barer for A, B og C: 100 um). (D) Et 3D-billede af en EB mærket med HNPs, rekonstrueret fra z-scanninger ved hjælp af en apochromatic 40X NA 1.25 nedsænkning i vand mål (skala bar: 50 pm). De HNPs er godt spredt rundt i hele EB og hjerte-klynge, så analysen bevægelse.
Figur 4.. (A) Individuel stel af filmen af bankende klynge og vektorielt analyse af in-plane HNPs forskydninger (SH signal vist i sort). Længderne af pilene svarer til den maksimale forlængelse af svingninger. (B) Fouriertransformation af NPS svingninger viser, at inden for den samme hjerte-klynge, frekvensen er konstant i-(sort linie) og out-of-plane bevægelse (orange stiplet linie) og svarer til 0,4 Hz. (C) Kalibreringskurve bruges til at konvertere HNP intensitet i aksial forskydning (Se afsnit 5 i protocol). Circles: eksperimentelle datapoints.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af nanoteknologi til stamcelleforskning er en forholdsvis ny, men hurtigt voksende område. Som påpeget af forskellige oversigtsartikler om emnet, kan anvendelsen af nanopartikler anvendes til at udføre forskellige forsknings-opgaver, der spænder fra celle sporing (både in vitro og in vivo), intracellulær levering af proteiner og gener, ikke mindst oprettelsen af biomimetiske cellulære miljøer for præferentiel stimulering / hæmning af specifik differentiering pathways 19,20. Beskrevet i denne protokol fremgangsmåde er begrænset til optisk registrering, og selv om muligheden for at anvende infrarød excitation fører til øget indtrængningsdybde med hensyn til fluorescens baserede teknikker; optisk billeddannelse kan ikke udvides til hele kroppen, og derfor bør suppleres med magnetisk afsløring 21.. Tidligere offentliggjorte arbejde viste flere tilgange til at vurdere struktur og flytning af hjerte-celle klynger iinklusive mærkning af fluorescerende farvestoffer 22, kvantepunkter 23,24, super-paramagnetiske jernoxid nanopartikler 25, og op-konvertering fluorescerende partikler 26-28. Fordelene ved HNPs med hensyn til disse Måleproberne er forbundet med fravær af blegning over længere tid, øget imaging penetration, bølgelængde justerbarhed for øget kontrast med hensyn til autofluorescens. Den ejendommelige sparsomme cellemærkning (dvs. i figur 3D vi tæller cirka 160 NP i en 100 um side terning), der opnås ved denne fremgangsmåde viser sig at være meget velegnet til at spore celle sammentrækninger i 3d menneskelige ESC-afledte hjerte klynger med høj rumlig opløsning.
Valget af nanomateriale er ikke begrænset til PEG-coatede KNbO 3, men kan omfatte en rig familie af nanopartikler udviser noncentrosymmetric krystalstrukturer, som eventuelt kan inkorporere andre functionalities (magnetisk, radioaktiv) tillader multimodal detektion. Desuden kan sådanne PEG-belagte HNPs yderligere funktionaliseres for specifikt rettet mod epitoper eller bindingsproteiner med henblik på selektivt at målrette specifikke cellesubpopulationer. På den anden side, den billeddannende fremgangsmåde foreslås her, kræver en scanning-mikroskop udstyret med en ultrahurtig laserkilde. En naturlig opfølgning, som kan overvejes fra dette arbejde er at overvåge integrationen af mærkede celler i 3D biomaterialer og Stilladskonstruktioner in vitro og længere ind indfødte væv, til at følge stiftelse og funktionaliteten af transplanterede celler over længere perioder.
En fordel ved at bruge filtre PTFE bærer 3D-aggregater, som i vores tilfælde, er muligheden for at udføre flere målinger over dage og uger, som filtre kan gendannes tilbage på deres indsats understøtter uden risiko for forurening. Endnu vigtigere er, filtre PTFE også muliggøre gentagne vurdering handling potpumpehuset ved hjælp af multi-elektrode arrays.
Cell skadetærskler for multi-foton excitation i nær-infrarødt forhaand er bestemt til mindre end 1 TW / cm 2 ved König et al 29. I vores undersøgelse, under anvendelse af et 0,75 NA 20x objektiv, forbliver den anvendte intensitet under TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2) og den korte pixel opholdstid (0,1 mikrosekunder) sammenlignet med König arbejde (80 mikrosekunder) sikrer mulighed at bevare prøven live og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den delvise finansiering fra EU FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010 til 246.479, http://www.namdiatream.eu) og INTERREG IV Frankrig-Schweiz NAOMI projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
