Summary
Protocol details worden verstrekt voor het in vitro merken menselijke embryonale stamcellen met tweede harmonischen genereren nanodeeltjes. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters worden ook gepresenteerd.
Abstract
In dit gevisualiseerd experiment worden protocol gegevens voor het in vitro merken van menselijke embryonale stamcellen (hESC) met tweede harmonische generatie nanodeeltjes (HNPs). De laatste is een nieuwe familie van probes onlangs voor het labelen van biologische monsters voor multi-foton beeldvorming. HNPs kunnen verdubbelen van de frequentie van excitatielicht door lineaire optische proces van tweede harmonische generatie zonder beperking van de excitatiegolflengte.
Multi-foton gebaseerde methodieken voor hESC differentiatie in de hartspier clusters (gehandhaafd als lange termijn culturen lucht-vloeistof) worden gepresenteerd in detail. In het bijzonder is het bewijs over hoe de intense tweede harmonische (SH) emissie van geïsoleerde HNPs tijdens 3D-monitoren van hartweefsel verslagen in 3D te maximaliseren getoond. De analyse van de beelden om 3D verplaatsing patronen ophalen eveneens wordt.
Introduction
Lineaire microscopie systemen dankzij hun inherente driedimensionale snijden capaciteiten steeds geleid vraag naar foto-stabiele fluoroforen met twee-foton absorptiebanden in het nabij-infrarood. Pas in de laatste paar jaar, om de ontwikkeling van fluorescentie gebaseerde labels (kleurstoffen, quantum dots, up-converterende nanodeeltjes), een andere beeldvorming methodiek is het benutten van het gebruik van een nieuwe familie van intrinsiek niet-lineaire nanodeeltjes als labels, dwz vullen harmonische nanodeeltjes (HNPs) die speciaal zijn ontwikkeld voor multi-foton microscopie. Deze labels, op basis van anorganische noncentrosymmetric kristallen, oefenen optisch contrast genereren van de SH van de excitatie frequentie: bijvoorbeeld door het omzetten van een fractie van nabij infrarood gepulste excitatie licht (λ = 800 nm) in zichtbaar blauw licht (λ / 2 = 400 nm) . Verschillende auteurs in het recente verleden hebben verschillende materialen getest, waaronder ijzer iodaat Fe (IO
In dit gevisualiseerd experiment worden protocol gegevens voor het in vitro merken van menselijke embryonale stamcellen (hESC) met ongefunctionaliseerde HNPs. De synthese en bereiding van colloïdale suspensies wordt beschreven in een eerdere publicatie en referenties daarin 16 en valt buiten het bestek van dit werk. Methodologieën voor hESC onderzoek door multi-foton microscopie en hun differentiatie in de hartspier clusters (gehandhaafd als lange termijn culturen lucht-vloeistof) worden gepresenteerd. Menselijke ESC kan laten differentiëren in zogenaamde embryoid organen (EBS) op twee manieren, hetzij door EB vorming van kolonie fragmenten in suspensie of anders gedwongen aggregatie van individuele cellen in EBS met de Aggrewell plaat, zie figuur 1A . kweken slaan clusters van hartcellen op polytetrafluorethyleen (PTFE) poreuze filters facilitates hun behoud op lange termijn voor verdere studies (bijvoorbeeld elektrofysiologische metingen van actiepotentialen).
De excitatie bron van de scanning microscoop moet kunnen ultrakorte pulsen (met een pulsduur kleiner dan 300 FSEC in het monster) om het piekvermogen nodig zijn tweede harmonische beeldvorming van HNPs voeren bereiken. Bijvoorbeeld, de meest voorkomende FSEC-bron gebruikt voor de beeldvorming zijn afstembare Ti: saffier lasers. Als alternatief kunnen andere ultrasnelle lasers worden gebruikt, bijvoorbeeld erbium ionen 17, chroom forsteriet 18 of Ti: saffier gepompt infrarood optische parametrische oscillatoren. De microscoop kan worden uitgerust met een objectief met bij voorkeur een vrij hoge numerieke apertuur. Heel belangrijk, voorafgaand aan de metingen, en elke keer dat de doelstelling wordt vervangen, is het verplicht om de huidige spreiding in de set-up (lenzen) te minimaliseren door het optimaliseren van de instellingen van de laserpuls pre-compressor op de werkplekgolflengte van keuze. Deze procedure, beschreven in het protocol, zodat de laserpuls zo dicht mogelijk bij de transformatie beperkte duur (bijvoorbeeld kort mogelijk) en het brandvlak en maximaliseert het monster lineaire respons.
Het doel van de beeldanalyse beschreven aan het einde van het protocol is het identificeren en te volgen in 3D HNPs bewegingen in verband met de ritmische samentrekkingen van het verslaan van cardiale clusters. Het bijhouden van nanodeeltjes in het beeldvlak wordt eenvoudig gerealiseerd door het identificeren van hun posities in opeenvolgende filmbeelden. Om informatie over axiale beweging extract, een voorafgaande ijking van de lineaire respons intensiteit als functie van de axiale verplaatsing is verplicht. Merk op dat voor langdurige metingen actief interferometrische controle monster axiale positie is vereist om de geldigheid van de ijkcurve in aanwezigheid van thermische en / of mechanische afwijkingen handhaven.
De HNPs hier gebruikt om trace verslaan cellen in aggregaten zijn gebaseerd op kalium Niobate oxide (KNbO 3), maar andere beschikbare niet-lineaire nanomaterialen worden beoordeeld in detail beschreven in het werk van Staedler et al. 16.
De lineaire optische efficiëntie van de tot nu toe onderzochte nanomaterialen zijn zeer vergelijkbaar. De keuze voor KNbO 3 werd hoofdzakelijk ingegeven door de goede stabiliteit van de colloïdale oplossing en de goede biocompatibiliteit, getest op verschillende humane cellijnen, zelfs bij vrij hoge concentratie en lange expositie tijden 16.
Gezien de nieuwheid van het nanomateriaal ingezet voor dit werk worden de belangrijkste kenmerken van HNPs in vergelijking met TL / lichtgevende bio-markers weergegeven in een korte oorspronkelijke computer video-animatie gerealiseerd door de auteurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultuur en uitbreiding van Human ESC
- Bereid de cel propagatiemedium (zogenaamde PM) bevattende Knockout DMEM gesupplementeerd met 20% Knockout Serum, 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine 200 mM, 1% penicilline-streptomycine, en 3,5 pl β-mercaptoethanol.
- Ontdooi menselijke ESC (hESC) in 8 ml PM medium en centrifugeer ze 5 min bij 115 xg to-DMSO aangevuld bevriezing medium weggooien.
- Voeg 1 ml PM medium dat 10 mM Rock remmer apoptose te voorkomen en te verbeteren cel overleving na ontdooien (alleen 24 uur incubatie).
- Voeg basische fibroblastgroeifactor (bFGF) aan de PM in de gewenste concentratie (4-10 ng / ml) voor het onderhoud van pluripotentie.
- Plate de hESC van bestraalde humane voorhuid feeder-cellen (γHFF) (figuur 1A), eerder uitgeplaat bij een concentratie van 2 x 10 4 cellen / cm 2.
- Medium dagelijks veranderen en, indien nodig, te verwijderen gedeelten van colonies beginnen te differentiëren door aspiratie met behulp van een langgerekte scherp gesneden Pasteur pipet.
- Een keer per week, passage kolonies enzymatisch:
- Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS.
- Verwijder PBS en incubeer ze met 0,5 ml per putje van warme collagenase IV bij 1 mg / ml gedurende 10 min bij 37 ° C, 5% CO2.
- Verzamel kolonie fragmenten in 2 ml nieuwe PM en centrifugeer bij 115 xg gedurende 3 minuten.
- Als alternatief kan kolonies mechanisch worden gepasseerd door schrapen:
- Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS.
- Handmatig schrapen kolonies met behulp van de StemPro EZPassage roller schraper (Figuur 1B).
- Verzamel kolonie fragmenten en centrifugeer vervolgens gedurende 3 minuten bij 115 xg om de supernatant te verwijderen.
- Plaat fragmenten op γHFF of verwerken voor differentiatie in embryoid lichamen (EBS).
2. Menselijke ESC DifferentiatieProtocol
- Bereid het differentiatiemedium (DM) met Knockout DMEM gesupplementeerd met 2% Hyclone serum, 1,0% MEM niet-essentiële aminozuren, 1,0% L-glutamine 200 mM, 1% penicilline-streptomycine, 3,5 pi β-mercaptoethanol.
- Verwijder medium en was kolonies met 2 ml PBS.
- EB vorming van kolonie fragmenten in suspensie:
- Verwijder PBS en incubeer ze met 0,5 ml per putje van warme collagenase IV bij 1 mg / ml gedurende 10 min bij 37 ° C, 5% CO2.
- Verzamel kolonie fragmenten in 2 ml nieuwe DM en centrifugeer bij 115 xg gedurende 3 minuten.
- Cultuur hen in suspensie in ultra-low attachment 6-well platen (2 ml per putje) voor 4 dagen (figuur 1C).
- Verzamelen en plaat het nieuw gevormde EBS 0,1% gelatine beklede platen met 24 putjes (ongeveer 3 EBS / putje) (Figuur 1D).
- Alternatief gedwongen samenvoeging van enkele cellen in EBS via de Aggrewell plaat:
- Verwijder PBS endistantiëren kolonies in afzonderlijke cellen met behulp Accutase (0,5 ml / putje).
- Centrifuge en resuspendeer cellen in DM bij 1,2 x 10 6 / ml.
- Voeg 2 ml per Aggrewell kamer voor 1 dag (Figuur 1B).
- Verzamel nieuw gevormde EBS (figuur 1C) en plaat ze op 0,1% gelatine beklede platen met 24 putjes (ongeveer 3 EBS / putje).
- Wijzig DM om de 2-3 dagen tot de verschijning van het verslaan van clusters van hartspiercellen (15-30 dagen).
3. Air-vloeibare 3D Culturen van Beating Clusters en Labeling met HNPs
- Identificeren en handmatig ontleden clusters van het verslaan van hartspiercellen (figuur 1D), normaal verschijnen na 2-4 weken van de cultuur, met behulp van een langgerekte scherp gesneden Pasteur pipet.
- Borg 4 PTFE filters per inzetstuk dat op een 6-well plaat (Figuur 1F) zal worden geplaatst.
- Voeg 1 ml van DM medium bovenop each goed.
- Voeg een ontleed slaan cluster op elke PTFE-filter (figuur 1E), maximale 4/well, dwz 24 aggregaten per plaat (Figuur 1F ').
- Wijzig DM medium om de 2-3 dagen.
- Om de clusters te labelen, verwijder de PTFE-filter met het kloppende cluster en zet het op 3,5 cm glazen bodem schaal (170 micrometer dik).
- Voeg 1 ml HNP bij een concentratie van 50 ug / ml gedurende 30 minuten.
4. Niet-lineaire optische beeldvorming
- Voorbereiding van het monster. Na HNP etikettering (zie Stap 3.6), over te dragen ofwel geheel differentiëren vroeg HeBS of cardiale kloppend clusters (ontleed bij samentrekking uiterlijk) op PTFE filters over een 170 um dikke glazen bodem schaal compatibel met de werkafstand van hoge numerieke apertuur doelstellingen. Ook verzoeken een direct coating van het verslaan van clusters op de glazen bodem schaal pre-gecoat met 0,1% gelatine.
- Doorvoermonsters eenalles-in-een microscoop uitgerust met incubatie kamer zorgen voor stabiele temperatuur, luchtvochtigheid en CO2 controle over langere tijd.
- Na de eerste inspectie, het imago van de steekproef via wide-field imaging onder wit licht verlichting aan structuren van belang in gedifferentieerde EBs of actieve kloppend clusters die zullen worden geselecteerd voor verder onderzoek vast te stellen.
- Als cel autofluorescentie van NADH en SH van HNPs moeten gelijktijdig worden verkregen, stelt een kortere laser excitatie golflengte (bijvoorbeeld 720 nm) de moleculaire absorptie passen. Gebruik een smalle banddoorlaat-spectraal filter gecentreerd op de helft van de golflengte (dat wil zeggen, λ = 360 ± 10 nm) te detecteren SH, en een andere om autofluorescentie detecteren.
- Ten eerste het uitvoeren van een snelle, lage resolutie, drie-dimensionale scan naar de algemene morfologie van de cardiale cluster herbouwen en selecteer een beeldvlak binnen het cluster volume met diverse zichtbare HNPs.
- Wijzig indien nodig de excitatie golflengte vrij het beste overeenkomen met het monster optische eigenschappen of photobleaching, foto schade en op de foto te voorkomen dieper in weefsels met een IR golflengte (dwz, 790 nm) en vervang de tweede harmonische filter dienovereenkomstig (dat wil zeggen, 395 nm ). Optimaliseer de instellingen van de laserpuls pre-compressor bij de werkende golflengte van keuze door het maximaliseren van de tweede harmonische signaal HNPs afgezet op het monster.
- Om toezicht te houden in real time de cardiale cluster weeën, stel de microscoop optische scanner in de snelste modus, zoals resonantiemodus, waardoor hoge snelheid overname van twee-dimensionale beelden.
- Kies de instellingen als beste compromis tussen beeldcontrast en acquisitie snelheid, zoals:
- Scan middeling: 4
- Pixelverblijftijd: 0,1 msec
- Afbeelding tarief: 3,75 frames per seconde (fps)
- Laservermogen wordt aangepast aan brandpunt size en scansnelheid. 50 mW (gemeten bij de ingang van de doelstelling) is een typische waarde voor 0,1 usee pixelverblijftijd en Plan APO 20X NA 0.75 doel het behoud van levensvatbaarheid van de cellen.
5. Beeldanalyse
- Axiale kalibratie procedure. Selecteer een HNP afgezet op een kale ondergrond. Pas de scherpstelling (dwz de axiale positie van de nanodeeltjes) voor het maximaliseren van de SH intensiteit. Verschillen op gecontroleerde wijze de axiale positie van de microscooptafel afgelezen betreffende SH intensiteit als een functie van de HNP verkrijgen opzichte van het brandpuntsvlak. De uitgang van deze kalibratieprocedure voor de plan APO 20X NA 0,75 doel wordt gerapporteerd in Figuur 4C.
- Selecteer HNPs aanwezig in alle video frames en bepalen hun periodieke bewegingen. Deze procedure kan gemakkelijk worden geautomatiseerd, bijvoorbeeld door aangepaste code die maximale signaalintensiteit plekken in een bepaald gebied van belang enze te verbinden tussen verschillende frames (een voorbeeld code geschreven in Matlab R2009 b met behulp van de functie 'regio props' van de Beeldverwerking Toolbox wordt gepresenteerd).
- Beoordelen van de kwantificering van de out-of-plane verplaatsingen, in verband met niet-continu traceerbaar HNPs verplaatsen langs de optische as, door het omzetten van hun intensiteit modulaties over verschillende frames in axiale verplaatsing met behulp van de ijklijn bij stap 5.1 vastgesteld. Merk op dat deze procedure geeft toegang tot axiale bewegingen, maar kan niet worden gebruikt om de absolute richting (naar boven of naar beneden) te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan beoordeling van het kloppende activiteit door confocale beeldvorming, een nauwkeurige karakterisering van de niet-lineaire optische respons van het PTFE filters werd uitgevoerd, alleen of in aanwezigheid van HNPs bij hoge concentraties (1 mg / ml). Er werd voor gezorgd dat: i) kaal metaal twee-foton aangeslagen fluorescentie is zeer zwak en kan niet voorkomen meting van de relevante biologische monsters, en ii) de SH emissie van geïsoleerde HNPs kan eenvoudig worden verkregen door beeldvorming door het substraat epi-detectiewijze (Figuur 2). Het doel was om verwijzing controles hebben voor de kwantificering van 3D-verplaatsing.
In figuur 3 worden HNP-gelabeld cardiale structuren en EBS weergegeven. De rode (figuur 3A), geel (Figuren 3B en 3C) en groene (figuur 3D) kleuren corresponderen met NADH autofluorescentie, terwijl de intense blauwe SH vlekken voort uit geïsoleerde HNP. Het is interessant om point het zeer goed optisch contrast bereikt door deze techniek en de relatief schaars etikettering in vergelijking met andere nanodeeltjes gebaseerde methoden, zoals quantum dots of opwaartse omzetting nanodeeltjes. In de huidige studie, die zeer intens etiketten geïsoleerd was voordelig voor het bijhouden van verschillende onafhankelijke individueel deeltje bewegingen en het reconstrueren van collectieve beweging van de stamcellen afgeleide structuren.
Figuur 3B toont een aanzicht van een segment HNP-gemerkte cardiale slaan cluster. Dergelijke 3D-structuren kunnen vervolgens worden opgenomen op hoge snelheid te controleren contractie patroon in de mobiele HNP aggregeren als vermeld in Film 1. In dit geval, hogesnelheidsacquisitie te handhaven voor het oplossen van de NP beweging, de algehele verwerving sensitiviteit ontoereikend voor het opnemen van cel autofluorescence samen met SH emissie van HNPs.
De toepassing van beeldanalyse in hoofdstuk 5 van de proto beschrevencol toegepast op het geheel van de film frames maakt het extract van informatie over individuele HNP beweging (richting, in-plane en out-of-plane verplaatsing, frequentie). Het resultaat van deze analyse (figuur 4) geeft aan dat, binnen dezelfde cardiale cluster, de frequentie constant in-en out-of-plane beweging (zie Fourier transformatie in figuur 4B) en verplaatsingen in de orde van enkele micrometers (de lengte van de pijlen die de voorbeeldige verplaatsingen van vijf NP in figuur 4A overeen met de maximale rek van de oscillaties).
Figuur 1. Differentiatie van hESC in de hartspier slaan clusters en labeling met HNPs nanodeeltjes voor de tweede harmonische beeldvorming microscopie. Undifferentiated hESC kolonies (A) waren ofwel 1) gesneden in kleinere stukken met behulp van de StemPro EZPassage gereedschap (B) en laat in suspensie om onregelmatige EBS (C) te vormen, of 2) gescheiden in afzonderlijke cellen en reclustered met de Aggrewell systeem (B ') regelmatig EBS (C vormen'). Beide EBS (C en C ') werden gedurende 2 dagen in suspensie en vervolgens gehecht aan gelatine beklede schotels. Slaan clusters van hartspiercellen (D) werden vervolgens handmatig ontleed met behulp van een scalpel en gekweekt op PTFE filters (E) afgezet op inserts lucht-vloeistof 3D kweken (F en F ') staan. (Schaalbalken voor panelen A, B, B' , C en C ': 100 micrometer; voor panelen D en E:. 250 pm) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. PTFE substraat optische karakterisatie. (A) het veld afbeelding van de PTFE-filter alleen Bright. (B) van twee-foton beeld van de PTFE-filter, die een zwakke fluorescentie geeft de tamelijk hoge laserintensiteit aangevraagd voor deze controlemeting (13 mW). (C en D) Na het toevoegen van het kale substraat een waterdruppel die HNPs 1 mg / ml concentratie, de SH emissie eenvoudig worden verkregen door het filter op relatief lage laserintensiteit (2 mW). In D, is een 3D-beeld van de nanodeeltjes verspreid over de filter getoond. (Schaalbalken: 50 pm).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
Figuur 3. Multiphoton beeldvorming van HNP gelabeld cardiale structuren en EBS. (A) De twee-foton fluorescentie-signaal van een kloppend cluster wordt weergegeven in rood en de SH signaal van de HNPs wordt weergegeven in blauw. De kleuren corresponderen met de gemeten intensiteit van de vier nondescanned fotomultipliers met verschillende spectrale filters. (Blauw 395 ± 11 nm, groen 485 ± 20 nm, geel 531 ± 40 nm, en rode 607 ± 70 nm). Deze cluster direct afgebeeld door het poreuze PTFE-filter met een 10x objectief met een excitatiegolflengte van 720 nm en een gemiddeld vermogen van 8,8 mW. (B) Een stuk aanzicht HNP gemerkte cardiale structuur geëxtraheerd uit een z-stack. (C) De EB afgebeeld door de PTFE (schaalbalken voor A, B en C: 100 pm). (D) een 3D-beeld van een EB gelabeld met HNPs, gereconstrueerd uit z-scans met behulp van een apochromatic 40X NA 1.25 water immersie objectief (schaal bar: 50 pm). De HNPs zijn goed verspreid over de hele EB en de cardiale cluster, waardoor de bewegingsanalyse.
Figuur 4. (A) individuele frame van de film van het kloppende cluster en vectoriële analyse van in-plane HNPs verplaatsingen (SH-signaal weergegeven in zwart). De lengten van de pijlen corresponderen met de maximale rek van de oscillaties. (B) Fourier-transformatie van de NP's oscillaties waaruit blijkt dat binnen dezelfde cardiale cluster, de frequentie constant is voor in-(zwarte lijn) en out-of-plane beweging (oranje stippellijn) en komt overeen met 0,4 Hz. (C) IJkgrafiek gebruikt om HNP intensiteit zetten in axiale verplaatsing (zie hoofdstuk 5 van de protOCOL). Cirkels: experimentele datapunten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toepassing van nanotechnologie tot stamcelonderzoek is een relatief nieuwe, maar snel groeiende sector. Zoals door diverse overzichtsartikelen over dit onderwerp, kan het gebruik van nanodeeltjes worden toegepast om verschillende taken uit te voeren onderzoek, van cel volgen (zowel in vitro als in vivo), intracellulaire afgifte van eiwitten en genen, ook de creatie van biomimetic cellulaire omgevingen voor preferentiële stimulatie / inhibitie van specifieke differentiatie signaalwegen 19,20. De in dit protocol beschreven benadering is beperkt tot optische tracking en, hoewel de mogelijkheid van het gebruik van infrarood excitatie leidt tot verhoogde indringdiepte ten opzichte gebaseerde technieken fluorescentie; optische beeldvorming kan niet worden uitgebreid tot het hele lichaam en daarom moet worden aangevuld met magnetische detectie 21. Vorige gepubliceerde werk toonden verschillende benaderingen van structuur en beweging van cardiale cel clusters te beoordelen, including etikettering van fluorescerende kleurstoffen 22, quantum dots 23,24, super-paramagnetische ijzeroxide nanodeeltjes 25 en up-conversie fluorescerende deeltjes 26-28. De voordelen van HNPs voor die nanosondes geassocieerd met afwezigheid van bleken over langere perioden, verhoogde weergave penetratie, golflengte tunability voor meer contrast ten opzichte van autofluorescentie. De eigenaardige schaars cel etikettering (dwz in figuur 3D tellen we ongeveer 160 NP's in een 100 micrometer kant kubus) dat wordt verkregen door deze aanpak blijkt zeer goed te zijn afgestemd op cel contracties traceren in 3D menselijke ESC-afgeleide cardiale clusters bij hoge ruimtelijke resolutie.
De keuze van het nanomateriaal is niet beperkt tot PEG-beklede KNbO 3, maar kan een rijke familie van nanodeeltjes weergeven noncentrosymmetric kristalstructuren, die eventueel kan nemen andere functionaliti omvattenes (magnetisch, radioactief) waardoor multimodale detectie. Bovendien kan een dergelijke PEG-beklede HNPs verder worden gefunctionaliseerd specifiek gericht tegen epitopen of bindingseiwitten om specifieke celtypes selectief richten. Anderzijds, de hier voorgestelde imaging benadering vereist een scanning microscoop uitgerust met een ultrasnelle laserbron. Een natuurlijke follow-up die uit dit werk kan worden overwogen is monitoring van de integratie van gelabelde cellen in 3D biomaterialen en steigers structuren in vitro en verder in inheemse weefsels, om de oprichting en de functionaliteit van getransplanteerde cellen gedurende langere perioden volgen.
Een voordeel van het gebruik van PTFE filters richting 3D aggregaten, zoals in ons geval, is de mogelijkheid om meerdere metingen over dagen en weken, als filters weer op hun insert kan worden hersteld ondersteunt zonder risico van verontreinigingen. Wat nog belangrijker is, PTFE filters de repetitieve beoordeling van de actie pot ook in staat stellenentials gebruik van multi-elektrode arrays.
Celbeschadiging drempels voor multi-foton excitatie in het nabije infrarood vooraf is bepaald minder dan 1 TW / cm 2 König et al. 29. In ons onderzoek met een 0,75 NA 20X objectief, de toegepaste intensiteit blijft onder de TW / cm 2 (0.26 TW / cm 2) en de korte pixelverblijftijd (0,1 psec) tegenover König werk (80 usec) verzekert de mogelijkheid het monster levend en differentiëren behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de gedeeltelijke financiering van de Europese FP7 Research Project NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) en het INTERREG IV France-Zwitserland NAOMI project erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
