Summary
Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit zweiten Harmonischen Nanopartikel (HNPs) vorgesehen ist. Letztere sind eine neue Gruppe von Sonden kürzlich zur Markierung von biologischen Proben für Mehrphotonenabbildungs eingeführt. HNPs der Lage sind, eine Verdoppelung der Frequenz der Anregungslicht durch die nichtlinearen optischen Prozeß der Erzeugung der zweiten Harmonischen, ohne Beschränkung auf die Anregungswellenlänge.
Multi-Photonen-basierte Methoden für die hESC Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden im Detail vorgestellt. Insbesondere ist Beweis, wie die intensive zweiten Harmonischen (SH) Emission von isolierten HNPs während der 3D-Überwachung von Herzgewebe zu schlagen in 3D gezeigt maximieren. Die Analyse der entstandenen Bilder, 3D-Verschiebungsmuster abzurufen ist auch beschrieben.
Introduction
Lineare Mikroskopiesysteme, die dank ihrer inhärenten dreidimensionalen Schneidefunktionen ausgelöst zunehmend die Nachfrage nach fotostabilen Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsbanden im nahen Infrarot. Nur in den letzten paar Jahren, um die Entwicklung der Fluoreszenz-basierten Etiketten (Farbstoffe, Quantenpunkte Up-Converting-Nanopartikel), eine unterschiedliche bildgebende Methode ist die Verwendung einer neuen Familie von Natur aus nicht-linearen Nanopartikel als Etiketten zu nutzen, dh ergänzen Harmonische Nanopartikel (HNPs), die speziell für Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden. Diese Etiketten, basierend auf nicht-zentrosymmetrischen anorganischen Kristallen, ausüben optischen Kontrast Erzeugen des SH der Anregungsfrequenz: z. B. durch Umsetzen einer Fraktion von Nahinfrarot-Pulsanregungslicht (λ = 800 nm) in sichtbares blaues Licht (λ / 2 = 400 nm) . Mehrere Autoren in der jüngsten Vergangenheit haben verschiedene Materialien getestet, darunter Eisen Fe Jodat (IO
In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit nicht funktionalisierten HNPs Verfügung gestellt. Die Synthese und Herstellung von kolloidalen Suspensionen in einer früheren Veröffentlichung und die darin aufgeführten 16 und geht über den Umfang dieser Arbeit. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden vorgestellt. Menschliche ESC lassen kann innerhalb sog. Embryoid Bodies (EBs) auf zwei verschiedenen Wegen, entweder durch EB Bildung von Kolonie-Fragmente in Suspension oder alternativ Zwangs Aggregation von einzelnen Zellen in EBs mit der Aggrewell Platte, wie in 1A dargestellt zu unterscheiden . Kultivierung schlagen Cluster von Herzzellen von Polytetrafluorethylen (PTFE), poröse Filter facilitates ihre langfristige Wartung für weitere Untersuchungen (z. B. elektrophysiologischen Messungen von Aktionspotentialen).
Die Anregungsquelle des Rastermikroskops ist in der Lage, ultrakurze Pulse (mit einer Pulsdauer kleiner als 300 fs bei der Probe), um die Spitzenleistung benötigt, um zweite harmonische Bildgebung HNPs zuführen erreichen liefern. Zum Beispiel, die häufigste Quelle für fs-Bildgebung verwendet werden abstimmbaren Ti: Saphir-Laser. Alternativ können andere Ultrakurzpulslaser eingesetzt werden, beispielsweise mit Erbium-Ionen-17 Chrom Forsterit 18 oder Ti: Saphir-gepumpten optischen parametrischen Oszillatoren Infrarot. Das Mikroskop mit einem Objektiv mit vorzugsweise einem relativ hohen numerischen Apertur ausgestattet werden. Sehr wichtig ist, vor der Messung, und jedes Mal, wenn die Ziel ersetzt wird, ist es zwingend notwendig, in den Aufbau (Linsen), die die vorliegende Dispersion durch Optimieren der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter an der Arbeits minimierenWellenlänge der Wahl. Dieses Verfahren, das in dem Protokoll beschrieben, stellt sicher, dass der Laserimpuls ist so nah wie möglich an der zu transformieren begrenzter Dauer (dh kürzesten wie möglich) in der Brennebene und maximiert die Probe nichtlinearen Antwort.
Das Ziel des am Ende des Protokolls beschriebenen Bildanalyse ist die Identifizierung und Verfolgung in 3D HNPs Bewegungen mit den rhythmischen Kontraktionen des Herz schlagen Cluster verbunden. Tracking-Nanopartikel in der Bildebene wird einfach durch Ermittlung ihrer Positionen in aufeinanderfolgenden Filmrahmen realisiert. Informationen über eine axiale Bewegung zu extrahieren, ist eine vorherige Kalibrierung der Intensität nichtlinearen Antwort als eine Funktion der axialen Verschiebung zwingend. Beachten Sie, dass für Langzeitmessungen, eine aktive Steuerung der interferometrischen Probe axialen Position ist erforderlich, um die Gültigkeit der Kalibrierungskurve in Gegenwart von thermischen und / oder mechanischen Drifts zu halten.
Die auf trac welche hier HNPse gegen Zellen innerhalb Aggregate werden auf Kaliumniobat Oxid (KNbO 3) auf, aber auch andere zur Verfügung nichtlineare Nanomaterialien sind im Detail in der Arbeit von Staedler et al 16 prüft.
Die nichtlineare optische Effizienz der meisten der bisher untersuchten Nanomaterialien sind sehr vergleichbar. Die Wahl für KNbO 3 wurde im Wesentlichen durch die gute Stabilität der kolloidalen Lösung und ihre gute Biokompatibilität auf mehreren menschlichen Zelllinien auch bei ziemlich hohe Konzentration und lange Expositionszeiten 16 getestet motiviert.
Angesichts der Neuartigkeit der für diese Arbeit eingesetzten Nanomaterialien werden die wichtigsten Merkmale der HNPs im Vergleich zu fluoreszierenden / lumineszierende Biomarker in einer kurzen ursprünglichen Computer-Videoanimation von den Autoren klar gezeigt.
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Protocol
1., Kultur und Erweiterung des menschlichen ESC
- Vorbereitung der Zellausbreitungsmedium (PM genannt), die Knockout DMEM, ergänzt mit 20% Knockout Serum, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin und 3,5 ul β-Mercaptoethanol.
- Auftauen menschlichen ESC (hES) in 8 ml PM-Medium und zentrifugieren 5 min bei 115 x g DMSO-Gefriermedium ergänzt verwerfen.
- 1 ml der PM-Medium mit 10 mM Rock-Hemmstoff, um Apoptose zu verhindern und das Überleben der Zellen zu verbessern, auf dem Auftauen (nur 24 Stunden Inkubation).
- Hinzufügen basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) mit dem PM in der gewünschten Konzentration (4-10 ng / ml) für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz.
- Plate Die HES an bestrahlten menschlichen Vorhaut-Feeder-Zellen (γHFF) (Fig. 1A), die zuvor in einer Konzentration von 2 x 10 4 Zellen / cm 2 ausplattiert.
- Medium täglich ändern und, falls erforderlich, Teile von c zu entfernenolonies beginnen zu differenzieren durch Aspiration mit einer länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette.
- Einmal in der Woche, Passage Kolonien enzymatisch:
- Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
- Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neue PM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min.
- Alternativ können Kolonien mechanisch durch Abkratzen agiert werden:
- Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
- Manuelles kratzen Kolonien mit der StemPro EZPassage Rollenschälgerät (Abbildung 1B).
- Kolonie-Fragmente zu sammeln und zu zentrifugieren dann 3 min bei 115 · g, um den Überstand zu entfernen.
- Plattenfragmente auf γHFF oder verarbeiten sie zur Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG).
2. Menschen ESC DifferenzierungProtokoll
- Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) mit Knockout DMEM mit 2% Hyclone Serum, 1,0% MEM Non-Essential Amino Acids, 1,0% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin, 3,5 ul β-Mercaptoethanol.
- Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS.
- EB Bildung der Kolonie Fragmente in Suspension:
- Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neuen DM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min.
- Kultur sie in Suspension in Ultra-Low-Befestigung 6-Well-Platten (2 ml pro Well) für 4 Tage (Abbildung 1C).
- Sammeln und Platte die neu gebildeten EBs auf 0,1% Gelatine beschichtete 24-Well-Platten (ca. 3 EVG / well) (Abbildung 1D).
- Alternativ gezwungen Aggregation von Einzelzellen in EVG mit der Aggrewell Platte:
- PBS und entfernendistanzieren Kolonien in einzelne Zellen mit Accutase (0,5 ml / Vertiefung).
- Zentrifuge und resuspendieren Zellen in DM auf 1,2 x 10 6 / ml.
- 2 ml pro Aggrewell Kammer für 1 Tag (Abbildung 1B).
- Sammeln neugebildeten EBs (Fig. 1C) und der Platte sie auf 0,1% Gelatine beschichteten 24-well-Platten (etwa 3 EBs / Vertiefung).
- Ändern DM alle 2-3 Tage bis zum Erscheinen des Schlagens Cluster von Kardiomyozyten (15-30 Tage).
3. Klima flüssigen 3D-Kulturen von Beating Cluster und Markierung mit HNPs
- Identifizieren und manuell sezieren Cluster schlagen Kardiomyozyten (1D), in der Regel nach 2-4 Wochen der Kultur erscheinen, mit einem länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette.
- Kaution 4 PTFE-Filter pro Einsatz, der auf einem 6-Well-Platte (Abb. 1F) gestellt werden.
- 1 ml der DM Medium auf der Oberseite des each gut.
- In einem seziert schlagen Cluster auf jedem PTFE-Filter (1E), maximale 4/well, dh 24 Aggregaten pro Platte (1F).
- Ändern DM Medium alle 2-3 Tage.
- Um die Cluster zu markieren, entfernen Sie die PTFE-Filter, der die Prügel-Cluster und legte es auf 3,5 cm Glasbodenschale (170 um dick).
- 1 ml HNP in einer Konzentration von 50 ug / ml für 30 min.
4. Nichtlinearen optischen Imaging
- Probenvorbereitung. Nach HNP-Kennzeichnung (siehe Schritt 3.6), Transfer entweder ganz früh differenzier HeBS oder Herz-Schlagen-Cluster (bei Kontraktion Aussehen seziert) auf PTFE-Filter über einen 170 um dicke Glasbodenschale mit der Arbeitsabstand von hoher numerischer Apertur Zielen vereinbar. Alternativ tragen Sie eine Direktbeschichtung gegen Cluster auf die Glasbodenschale mit 0,1% Gelatine vor, beschichtet.
- Über Proben einall-in-one-Mikroskop mit Inkubationskammer eine stabile Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Regelung über längere Zeit ausgestattet.
- Nach der ersten Inspektion, Bild der Probe über Weitfeld-Bildgebung unter Beleuchtung mit weißem Licht, um Strukturen von Interesse innerhalb differenzierten EBs oder aktive Schlagen Cluster, die für weitere Untersuchungen ausgewählt werden identifizieren.
- Wenn die Zelle Autofluoreszenz von NADH und SH aus HNPs gleichzeitig erworben werden müssen, eine kürzere Laser-Anregungswellenlänge (zB 720 nm), um die molekulare Absorption entsprechen. Verwenden einen schmalen Bandpassfilter bei spektralen halben Anregungswellenlänge zentriert ist (dh λ = 360 ± 10 nm) bis SH erfassen, und eine weitere, um Autofluoreszenz zu detektieren.
- Erstens eine schnelle, niedrige Auflösung, dreidimensionale Scan, um die Gesamt Morphologie des Herzcluster erneut, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb der Cluster-Volume mit mehreren sichtbaren HNP durchführens.
- Wenn nötig, ändern Sie die Anregungswellenlänge frei optischen Eigenschaften der Probe am besten entsprechen oder Photobleaching, Foto-Schäden und Bild tiefer in Gewebe mit einem IR-Wellenlänge (dh 790 nm) zu vermeiden und die zweite Harmonische Filter ersetzen entsprechend (dh 395 nm ). Optimierung der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter bei der Arbeitswellenlänge der Wahl durch die Maximierung der zweiten harmonischen Signal der HNPs auf die Probe aufgebracht.
- Um in Echtzeit überwachen die Herzkontraktionen Cluster, stellen Sie das Mikroskop optischen Scanner im schnellsten Modus wie Resonanzmodus, so dass mit hoher Geschwindigkeit Erwerb von zweidimensionalen Bildern.
- Wählen Sie die Einstellungen als beste Kompromiss zwischen Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit, wie etwa:
- Scan Mittelung: 4
- Pixelverweilzeit: 0,1 Mikrosekunden
- Bildrate: 3,75 Bilder pro Sekunde (fps)
- Laserleistung wird nach Brennfleck s eingestelltize-und Scan-Geschwindigkeit. 50 mW (gemessen am Eingang des Objektivs) ist ein typischer Wert für 0,1 us Pixelverweilzeit und Plan APO 20x NA 0,75 Ziel die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen.
5. Bildanalyse
- Axial-Kalibrierung. Wählen Sie ein einzelnes HNP auf einer blanken Substrat abgeschieden. Die Scharfeinstellung (dh der axialen Position des Nanopartikels) zur Maximierung der Intensität SH. Variieren, in einer kontrollierten Art und Weise die axiale Position des Mikroskoptisches, um die Kalibrierungskurve, die SH-Intensität als Funktion der HNP erhalten von der Fokalebene versetzt sind. Der Ausgang dieses Kalibrierungsverfahren für den Plan APO 20X 0,75 NA Objektiv in 4C angegeben.
- Wählen Sie in allen Video-Frames vorhanden HNPs und bestimmen deren periodische Bewegungen. Dieses Verfahren kann leicht automatisiert werden, zum Beispiel durch einen eigenen Code auf der Suche nach maximaler Intensität Signal-Spots in einem definierten Bereich von Interesse undunter verschiedenen Rahmen verbindet sie (ein Beispiel-Code in Matlab R2009 b mit Hilfe der Funktion "Region Requisiten" der Image Processing Toolbox geschrieben wird vorgelegt).
- Bewerten Sie die Quantifizierung der Out-of-Plane-Verschiebungen, mit nicht-kontinuierlich nachvollziehbar HNPs sich entlang der optischen Achse, durch die Umwandlung ihrer Intensität Modulationen in ganz verschiedenen Rahmen in axiale Verschiebung anhand der Eichkurve in Schritt 5.1 fest verbunden. Beachten Sie, dass diese Prozedur ermöglicht den Zugriff auf axiale Bewegungen, aber nicht verwendet werden, um die absolute Richtung (nach oben oder unten) zu bestimmen.
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Representative Results
Vor der Bewertung der Schlagaktivität durch konfokale Bildgebung wurde eine sorgfältige Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter durchgeführt wird, entweder allein oder in Gegenwart von HNPs bei hoher Konzentration (1 mg / ml). Es wurde sichergestellt, dass: i) die blanke Substrat Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz ist sehr schwach und kann nicht die Messung der relevanten biologischen Proben zu verhindern, und ii) das SH-Emission aus isolierten HNPs kann leicht durch Abbilden durch das Substrat in epi-Erfassungsmodus erfasst werden (Abbildung 2). Das Ziel war, Referenzkontrollen zur Quantifizierung von 3D-Verschiebung haben.
In Fig. 3 sind HNP-markierten Herzstrukturen und EBs angezeigt. Die rote (3A), gelb (3B und 3C) und grün (3D) Farben entsprechen NADH Autofluoreszenz, während die intensiv blau SH-Spots stammen aus isolierten HNP. Es ist interessant zu point die sehr guten optischen Kontrast mit dieser Technik und der relativ spärlichen Kennzeichnung im Vergleich zu anderen Nanopartikel-basierten Methoden, wie Quantenpunkte oder Up-Conversion-Nanopartikel erreichbar. In der vorliegenden Studie, mit sehr intensiven Etiketten isoliert war für die Verfolgung von mehreren unabhängigen Einzelpartikelbewegungen und Rekonstruktion kollektive Bewegung der Stammzellen abgeleiteten Strukturen vorteilhaft.
3B zeigt eine Scheibe Ansicht eines HNP-markierten Herz Schlagen Cluster. Solche 3D-Strukturen können dann mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet, um die Kontraktionsmuster in der Zelle HNP-Aggregat zu überwachen, wie in Movie 1 angegeben. In diesem Fall hohe Erfassungsgeschwindigkeit Rate für die Lösung des NP-Bewegung zu halten, war die Gesamtübernahme Empfindlichkeit nicht ausreichend für die Aufzeichnung von Autofluoreszenz-Zelle zusammen mit SH-Emission aus HNPs.
Die Anwendung der Bildanalyse in Abschnitt 5 des Proto beschriebencol, um das Ensemble der Film-Frames angewendet ermöglicht den Extrakt von Informationen über einzelne HNP Bewegung (Richtung, in-plane-und Out-of-Plane-Verschiebung, Frequenz). Das Ergebnis dieser Analyse (Fig. 4) zeigt an, dass innerhalb des gleichen Herz Cluster ist die Frequenzkonstante für In-und Out-of-Plane-Bewegung (siehe Fourier-Transformation in Fig. 4B) und Verschiebungen in der Größenordnung von wenigen Mikrometern (die Länge der Pfeile die Ausführungs Verschiebungen fünf NPs in 4A entsprechen der maximalen Dehnung der Schwingungen).
Abbildung 1. Differenzierung von hES in Herz Schlagen Cluster und Kennzeichnung mit HNPs Nanopartikel für die zweite Harmonic Imaging Mikroskopie. Undifferentiated hESC Kolonien (A) waren entweder 1) schneiden in kleinere Stücke mit der StemPro EZPassage Werkzeug (B) und lassen in Suspension zu unregelmäßigen EVG (C) zu bilden, oder 2) in Einzelzellen dissoziiert und reclustered mit der Aggrewell System (B ') regelmäßig EVG (C bilden'). Beide Arten von EBs (C oder C ') wurden für 2 Tage in Suspension kultiviert und dann in Gelatine-beschichteten Schalen haftet. Beating Cluster von Kardiomyozyten (D) wurden dann manuell mit einem Skalpell und kultiviert auf PTFE-Filter (E) auf Einsätze aufgebracht, um Luft-Flüssigkeit-3D-Kulturen (F und F ') erlauben seziert. (Maßstabsbalken für Platten A, B, B' , C und C ': 100 um, für Platten D und E:. 250 um) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. PTFE Substrat optische Charakterisierung. (A) Hellfeld-Bild des PTFE-Filter allein. (B) Zwei-Photonen-Bild des PTFE-Filter, die eine schwache Fluoreszenz zeigt im Vergleich zu den recht hohen Laserintensität für diese Kontrollmessung (13 mW) aufgebracht. (C und D) Nach dem Hinzufügen auf den blanken Untergrund einen Wassertropfen enthält HNPs bei 1 mg / ml-Konzentration, die SH-Emission kann leicht durch den Filter bei vergleichsweise niedrigen Laserintensität (2 mW) erworben werden. In D wird ein 3D-Bild der Nanopartikel auf dem Filter verteilt gezeigt. (Maßstabsbalken: 50 um).
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Abbildung 3. Multiphotonen-Imaging von HNP beschriftet Herzstrukturen und EBS. (A) Die Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignal eines schlagenden Cluster wird in rot angezeigt und die SH-Signal von den HNPs ist blau dargestellt. Die Farben entsprechen der Intensität der vier nichtdescannten Photomultiplier mit unterschiedlichen spektralen Filter ausgestattet war, gemessen. (Blau 395 ± 11 nm, grün 485 ± 20 nm, gelb 531 ± 40 nm und rot 607 ± 70 nm). Dieser Cluster wurde direkt durch die poröse PTFE-Filter mit einem 10X-Objektiv mit einer Anregungswellenlänge von 720 nm und einer mittleren Leistung von 8,8 mW abgebildet. (B) eine Schnittansicht eines HNP markierte Herzstruktur aus einer z-Stapel extrahiert. (C) Ein EB abgebildet durch die PTFE (Maßstabsbalken für A, B und C: 100 um). (D) ein 3D-Bild mit einem EB HNPs markierten, aus Z-Scans rekonstruiert unter Verwendung eines apochromantischen 40X NA 1.25 Wasserimmersionsobjektiv (Maßstab: 50 um). Die HNPs sind gut um die ganze EB und Herz Cluster verteilt, so dass die Bewegungsanalyse.
Abbildung 4. (A) Einzelbild des Films des schlagenden Cluster und Vektor Analyse der in-plane HNPs Verschiebungen (schwarz dargestellt SH-Signal). Die Längen der Pfeile entspricht der maximalen Dehnung der Schwingungen. (B) Fourier-Transformation der NPs Schwingungen zeigt, dass innerhalb des gleichen Herz Cluster ist die Frequenzkonstante für in-(schwarze Linie) und out-of-plane Bewegung (orange gepunktete Linie) und 0,4 Hz entspricht. (C) Kalibrierungskurve verwendet, um HNP Intensität in axiale Verschiebung zu konvertieren (siehe § 5 der protOcol). Kreise: experimentelle Datenpunkte.
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Discussion
Die Anwendung der Nanotechnologie zur Stammzellforschung ist ein relativ neues, aber rasch wachsenden Bereich. Wie durch verschiedene Übersichtsartikel zu diesem Thema erwähnt, kann die Verwendung von Nanopartikeln verwendet werden, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen Forschung, die von Zellverfolgung (sowohl in vitro als auch in vivo), um die intrazelluläre Abgabe von Proteinen und Genen, nicht zuletzt die Schaffung biomimetische zellulären Umgebungen für Vorzugs Stimulation / Hemmung der spezifischen Differenzierungswege 19,20. Die in diesem Protokoll beschriebenen Ansatz beschränkt sich auf optische Tracking, und obwohl die Möglichkeit der Verwendung von Infrarot-Anregung führt zu einer erhöhten Eindringtiefe in Bezug auf Fluoreszenz basierende Techniken; Optisches Abbildungs nicht auf den ganzen Körper ausgedehnt werden und sollte daher durch magnetische Erfassungs 21 ergänzt werden. Vorherige veröffentlichte Arbeit zeigte mehrere Ansätze, um Struktur und Bewegung der Herzzellhaufen zu bewerten,EINSCHLIESSLICH Markierung durch Fluoreszenzfarbstoffe 22, Quantenpunkte 23,24, super-paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel 25 und Up-Conversion-fluoreszierende Partikel 26-28. Die Vorteile HNPs bezüglich dieser Nanosonden werden mit der Abwesenheit von Bleich über längere Zeiträume erhöht Abbildungs Penetration, Abstimmbarkeit der Wellenlänge für einen erhöhten Kontrast bezüglich der Autofluoreszenz verbunden. Die eigentümliche spärlich Zellmarkierung (dh in 3D zählen wir rund 160 NPs in einen 100 um Seiten Würfel), die von diesem Ansatz erhalten wird, entpuppt sich als sehr gut geeignet, um Zellkontraktionen in 3D menschlichen ESC-abgeleiteten Herz Cluster mit hoher räumlicher Spuren Auflösung.
Die Wahl des Nanomaterials ist nicht auf PEG-beschichteten KNbO 3 beschränkt, sondern kann eine reiche Familie von Nanopartikeln Anzeige nichtzentrosymmetrische Kristallstrukturen, die möglicherweise integrieren können andere functionaliti umfassenES (magnetisch, radioaktiv) ermöglicht multimodale Erkennung. Darüber hinaus können solche PEG-beschichteten HNPs weiter funktionalisiert werden, um die spezifisch gegen Epitope oder Bindungsproteine, um gerichtet selektiv auf bestimmte Zellpopulationen werden. Auf der anderen Seite, die hier vorgeschlagene Bildgebung Ansatz erfordert eine Scanning-Mikroskop mit einer ultraschnellen Laserquelle ausgestattet. Ein natürliches Follow-up, die aus dieser Arbeit in Betracht gezogen werden kann, ist die Überwachung der Integration der markierten Zellen in 3D-Biomaterialien-und Gerüststrukturen in vitro und weiter in nativen Geweben, um den Einbau und die Funktionalität der transplantierten Zellen über längere Zeiträume verfolgen.
Ein Vorteil der Verwendung von PTFE-Filter tragenden 3D-Aggregate, wie in unserem Fall, ist die Möglichkeit, mehrere Messungen über Tage und Wochen durchzuführen, wie Filter können wieder auf ihre Einlage wieder hergestellt werden unterstützt ohne Risiko von Kontaminationen. Noch wichtiger ist, PTFE-Filter ermöglichen auch die sich wiederholenden Bewertung der Maßnahmen Topfentials mit Multielektrodenarrays.
Zellschäden Schwellenwerte für Multi-Photonen-Anregung im nahen Infrarot zuvor auf weniger als 1 TW / cm 2 durch König et al 29 bestimmt. In unserer Studie unter Verwendung einer 0,75 NA 20X Ziel bleibt die angelegte Intensität unter dem TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2) und das kurze Pixelverweilzeit (0,1 &mgr; s) im Vergleich zu König Werk (80 &mgr; s) gewährleistet die Möglichkeit, um die Probe am Leben zu erhalten und Differenzierung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die teilweise Finanzierung aus dem Europäischen FP7 Forschungsprojekt NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) und dem INTERREG IV-France Schweiz NAOMI Projekt bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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