Summary
פרטי פרוטוקול ניתנים לתאים במבחנה תיוג גזע עובריים אנושיים עם חלקיקים ליצירת הרמוניים שני. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב גם מוצגות.
Abstract
בניסוי דמיינו את זה, פרטים בפרוטוקול ניתנים לתיוג במבחנה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) עם חלקיקי דור שני הרמוני (HNPs). האחרונים הם משפחה חדשה של בדיקות שהוכנסו לאחרונה לתיוג דגימות ביולוגיות להדמיה רב פוטון. HNPs מסוגל להכפיל את התדירות של אור העירור על ידי התהליך האופטי קוי של דור השני הרמוני עם אין הגבלה על אורך גל העירור.
רב פוטון מתודולוגיות לבידול hESC לאשכולות לב (נשמרו כתרבויות אוויר נוזלי לטווח ארוך) המבוסס מוצגים בפירוט. בפרט, ראיות על איך למקסם את הפליטה האינטנסיבית השנייה ההרמונית (SH) של HNPs המבודד במהלך ניטור 3D של רקמת לב פועם ב3D מוצגת. הניתוח של תמונות וכתוצאה מכך לאחזר דפוסי תזוזת 3D הוא גם מפורט.
Introduction
מערכות מיקרוסקופיה קוי, הודות לשלוש יכולות חתכם הטבועות ממדיות, יש יותר ויותר שהפעילו את הביקוש לfluorophores צילום יציב עם להקות קליטת שני פוטונים באינפרא אדום הקרוב. רק בשנים האחרונות, כדי להשלים את הפיתוח של תוויות המבוססת על הקרינה (צבעים, נקודות קוונטיות, חלקיקי המרה-up), המתודולוגיה הדמיה שונה כבר מנצלת את השימוש במשפחה חדשה של חלקיקי מיסוד קוי כתוויות, כלומר חלקיקים הרמוניים (HNPs) אשר פותחו במיוחד עבור מיקרוסקופ רב פוטון. תוויות אלה, המבוססים על גבישי noncentrosymmetric אורגניים, להפעיל ניגוד אופטי שהניבו SH של תדר העירור: למשל על ידי המרת חלק קטן של אור עירור פעם הקרוב אינפרא אדום (λ = 800 ננומטר) לאור כחול גלוי (λ / 2 = 400 ננומטר) . כמה מחברים בתקופה האחרונה בחנו חומרים שונים, ובכלל זה iodate ברזל Fe (IO
בניסוי דמיינו את זה, פרטים בפרוטוקול ניתנים לתיוג במבחנה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) עם HNPs unfunctionalized. הסינתזה והכנת תרחיפים colloidal היא מפורטת בפרסום קודם ובהפניות בי 16 והוא מעבר להיקף של עבודה זו. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב (נשמרו כתרבויות אוויר נוזלי לטווח ארוך) מוצגות. ניתן לתת ESC האנושי להבחין בתוך גוף שנקרא embryoid (EBS) בשתי דרכים שונות, או על ידי היווצרות EB של שברי מושבה בהשעיה או, לחלופין, נאלצו צבירה של תאים בודדים לEBS באמצעות צלחת Aggrewell, כפי שמודגם באיור 1 א fac מסננים נקבוביים. Culturing להכות אשכולות של תאי לב על polytetrafluoroethylene (PTFE)ilitates התחזוקה ארוך הטווח שלהם למחקרים נוספים (למשל מדידות אלקטרו של פוטנציאל פעולה).
מקור העירור של הסריקה מיקרוסקופ צריך להיות מסוגל לספק פולסים ultrashort (עם משך פעימה קטן יותר מאשר 300 fsec במדגם) על מנת להגיע לשיא הכוח דרוש כדי לבצע הדמיה הרמונית שנייה של HNPs. לדוגמא, fsec-המקור הנפוץ ביותר המשמש להדמיה הוא Ti מתכונן: לייזרי ספיר. לחלופין, יכולים להיות מועסקים לייזרים מהירים אחרים, ליון ארביום למשל 17, forsterite כרום 18 או טי: מתנדים פרמטרים אופטיים אינפרא אדום ספיר שאוב. מיקרוסקופ יכול להיות מצויד במטרה עם עדיפות צמצם מספרי גבוה למדי. מאוד חשוב, לפני מדידות, ובכל פעם המטרה מוחלפת, הוא חובה כדי למזער את הווה הפיזור בהגדרה (עדשות) על ידי אופטימיזציה של ההגדרות של דופק לייזר מראש המדחס בעבודהאורך גל של בחירה. הליך זה, שפורט בפרוטוקול, מבטיח כי דופק הלייזר הוא קרוב ככל האפשר ללהפוך לתקופה מוגבלת (כלומר כקצר ביותר אפשרי) במישור המוקד ומגדיל את התגובה קוי מדגם.
המטרה של ניתוח התמונה שתואר בסוף הפרוטוקול היא לזהות ולעקוב אחר תנועות 3D HNPs קשורים ההתכווצויות קצביות של מכות אשכולות לב. חלקיקי מעקב במטוס התמונה הוא פשוט הבין שעל ידי זיהוי עמדותיהם במסגרות סרט רצופים. כדי לחלץ מידע על תנועה צירית, כיול מוקדם של תגובה בעוצמה לא קוי כפונקציה של תזוזה צירית הוא חובה. שים לב שעבור מדידות לטווח ארוך, שליטת interferometric פעילה של מדגם עמדה צירית נדרש כדי לשמור על תוקפו של עקום הכיול בנוכחות מרחף תרמית ו / או מכאני.
HNPs משמש כאן לטראקתאי דואר פועמים בתוך אגרגטים מבוססים על תחמוצת אשלגן niobate (KNbO 3), אבל ננו קוי זמין אחר נסקרים בפירוט בעבודה של טאדלר אח' 16.
היעילות האופטית קוי של רוב ננו נחקר עד כה הן מאוד דומה. הבחירה לKNbO 3 הונעה בעיקרו על ידי היציבות טובה של פתרון colloidal וההתאמה הביולוגית הטוב שלה, בדקה בכמה שורות תאים אנושיות אפילו בריכוז גבוה למדי ופעמים אקספוזיציה ארוכות 16.
לאור החידוש של nanomaterial מועסק לעבודה זו, המאפיינים העיקריים של HNPs בהשוואה לביו סמני ניאון / ניאון מוצגים באנימצית מחשב וידאו קצרה מקורית הבינה המחברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות והרחבת ESC האדם
- הכן את מדיום התפשטות תאים (הנקרא בערב) המכיל נוק DMEM בתוספת 20% נוק סרום, 1% חומצות אמינו שאינו חיוניות MEM, 1% L-גלוטמין 200 מ"מ, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו3.5 μl β-mercaptoethanol.
- להפשיר ESC האנושי (hESC) ב8 בינוני PM מיליליטר ו צנטריפוגות 5 דקות ב115 XG להשליך בינוני הקפאת תוספת DMSO.
- הוסף 1 מיליליטר של מדיום PM מכיל 10 מעכב מ"מ רוק כדי למנוע אפופטוזיס ולשפר את הישרדות תא על ההפשרה (דגירה שעה 24 בלבד).
- הוספת גורם בסיסי גדילה פיברובלסטים (bFGF) לראש הממשלה בריכוז הרצוי (4-10 ng / ml) לתחזוקה של pluripotency.
- פלייט hESC על אדם מוקרן עורלת תאים מזינים (γHFF) (איור 1 א), מצופה בעבר בריכוז של 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר.
- שנה בינונית מדי יום ובמידת צורך, להסיר חלקים של גolonies מתחיל להבחין על ידי שאיפה באמצעות פיפטה פסטר חד לחתוך מוארכת.
- פעם בשבוע, מושבות מעבר אנזימים:
- הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS.
- הסר PBS ו דגירה אותם עם 0.5 מיליליטר לכל טוב של IV collagenase החם ב1 מ"ג / מיליליטר ל10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאסוף שברי מושבה ב2 מיליליטר בערב וצנטריפוגות חדשים ב115 XG במשך 3 דקות.
- לחלופין, ניתן passaged מושבות מכאנית על ידי גירוד:
- הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS.
- ידני לגרד מושבות באמצעות כלי מגרד רולר StemPro EZPassage (איור 1).
- לאסוף שברי מושבה ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 3 דקות ב115 XG כדי להסיר את supernatant.
- שברי צלחת על γHFF או לעבד אותם לבידול לגופי embryoid (EBS).
2. בידול ESC אדםפרוטוקול
- הכן את מדיום ההתמיינות (DM) באמצעות נוק DMEM בתוספת 2% בסרום Hyclone, 1.0% חומצות אמינו שאינו חיוניות MEM, 1.0% L-גלוטמין 200 מ"מ, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 3.5 β-mercaptoethanol μl.
- הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS.
- היווצרות EB של שברי מושבה בהשעיה:
- הסר PBS ו דגירה אותם עם 0.5 מיליליטר לכל טוב של IV collagenase החם ב1 מ"ג / מיליליטר ל10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאסוף שברי מושבה ב2 מיליליטר DM וצנטריפוגות החדשים ב115 XG במשך 3 דקות.
- תרבותם בהשעיה בקובץ המצורף נמוך במיוחד 6 צלחות היטב (2 מ"ל לכל טוב) במשך 4 ימים (איור 1 ג).
- לאסוף וצלחת EBS שהוקם על צלחות 24 גם ג'לטין מצופה 0.1% (גם EBS כ -3 /) (1D איור).
- לחלופין, נאלץ צבירה של תאים בודדים לEBS באמצעות צלחת Aggrewell:
- הסר PBS ולנתק מושבות לתוך תאים בודדים באמצעות Accutase (0.5 מיליליטר / טוב).
- תאי צנטריפוגה ו resuspend ב DM ב1.2 x 10 6 / מיליליטר.
- הוסף 2 מיליליטר לכל תא Aggrewell ליום 1 (איור 1 ב ').
- לאסוף EBS שהוקם זה עתה (איור 1 ג ') וצלחת אותם על צלחות מצופים ג'לטין 0.1% 24 גם (EBS על 3 / טוב).
- שינוי DM כל 2-3 ימים עד להופעה של מכות אשכולות של שריר לב (15-30 יום).
3. תרבויות 3D האוויר נוזליים של מכות אשכולות וסימון עם HNPs
- לזהות ולנתח באופן ידני אשכולות של שריר לב פועם (1D איור), בדרך כלל מופיע אחרי 2-4 שבועות של תרבות, באמצעות פיפטה פסטר חד לחתוך מוארכת.
- הפקדת 4 מסנני PTFE לכל הכנס שיוצבו על צלחת 6 היטב (איור 1F).
- הוסף 1 מיליליטר של מדיום DM על גבי EACגם שעות.
- להוסיף אחד אשכול גזור מכה על כל מסנן PTFE (איור 1E), 4/well המרבי, כלומר 24 מצרפים לכל צלחת (איור 1F).
- שנה בינונית DM כל 2-3 ימים.
- כדי לתייג את האשכולות, להסיר את מסנן PTFE מכיל מקבץ המכות ולשים אותו על 3.5 צלחת תחתית זכוכית סנטימטר (170 מיקרומטר עבה).
- הוסף 1 מיליליטר של HNP בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר למשך 30 דקות.
4. דימות אופטי שאינו ליניארי
- הכנת מדגם. לאחר תיוג HNP (ראה שלב 3.6), להעביר או hEBs כל ההבחנה המוקדמת או אשכולות מכות לב (גזורים על מראה התכווצות) במסנני PTFE על צלחת זכוכית תחתונה עבה 170 מיקרומטר תואמת את מרחק העבודה של מטרות צמצם מספריות גבוהות. לחלופין, להחיל ציפוי ישיר של מכות אשכולות לצלחת הזכוכית תחתונה מראש מצופה עם ג'לטין .0.1%.
- העברת דגימות לכל אחד ב-מיקרוסקופ מצויד בדוגרים קאמריים להבטיח טמפרטורה יציבה, לחות ו-CO 2 שליטה על פני תקופות זמן ארוכות.
- לאחר בדיקה ראשונית, תמונת המדגם באמצעות הדמיה רחב בתחום תחת תאורת אור הלבנה כדי לזהות מבנים של עניין בתוך EBS הבדיל או אשכולות מכות פעילים שייבחרו לחקירות נוספות.
- אם autofluorescence התא מNADH וSH מHNPs צריכים להיות שנרכשו בו זמנית, שנקבע באורך גל קצר יותר עירור לייזר (כלומר 720 ננומטר) כדי להתאים את הספיגה המולקולרית. השתמש במסנן אחד צר להקה עוברת רפאים מרוכזים במחצית אורך גל העירור (כלומר, λ = 360 ± 10 ננומטר) כדי לזהות SH, ועוד אחד כדי לזהות autofluorescence.
- ראשית לבצע החלטה מהירה, נמוכה, סריקה תלת ממדית כדי לבנות מחדש את המורפולוגיה הכוללת של אשכול הלב ובחר מטוס תמונה בתוך צביר הנפח עם כמה HNP הגלויs.
- במידת צורך, לשנות את אורך גל העירור באופן חופשי כדי להתאים הטוב ביותר תכונות אופטיות של המדגם או כדי למנוע photobleaching, נזק תמונה ותמונה עמוק יותר לתוך רקמות עם אורך גל IR (כלומר, ננומטר 790) ולהחליף את המסנן ההרמוני השני בהתאם (כלומר, ננומטר 395 ). לייעל את ההגדרות של דופק לייזר מראש המדחס באורך גל העבודה של בחירה על ידי למקסם את האות ההרמונית השנייה של HNPs הופקד על המדגם.
- כדי לפקח בזמן אמת התכווצויות אשכול לב, להגדיר את הסורק האופטי המיקרוסקופ במצב המהיר ביותר כגון מצב תהודה, המאפשר רכישה במהירות גבוהה של תמונות דו ממדיות.
- בחר את ההגדרות כפשרה הטובה ביותר בין ניגוד תמונה ומהירות רכישה, כגון:
- מיצוע סריקה: 4
- זמן להתעכב פיקסל: 0.1 μsec
- דרג תמונה: 3.75 מסגרות לשנייה (fps)
- כוח הלייזר מותאם לים במקום מוקדize ומהירות סריקה. 50 mW (נמדד בכניסה לאובייקטיבית) הוא ערך אופייני ל0.1 μsec זמן להתעכב פיקסל ומטרת התכנית APO 20X NA 0.75 שימור כדאיות תא.
5. ניתוח תמונה
- הליך כיול צירי. בחר HNP יחיד שהופקד על מצע חשוף. התאם את המיקוד (כלומר העמדה צירית של nanoparticle) למקסם את עוצמת SH. להשתנות באופן מבוקר את העמדה צירית של הבמה מיקרוסקופ כדי לקבל עקומת הכיול הנוגעת בעוצמה SH כפונקציה של HNP לקזז ממישור המוקד. הפלט של הליך כיול זה למטרת התכנית APO 20X NA 0.75 מדווח באיור 4C.
- בחר HNPs נוכח בכל מסגרות הווידאו ולקבוע תנועות תקופתיות שלהם. יכול להיות אוטומטי הליך זה בקלות, למשל על ידי קוד מותאם אישית מחפש נקודות מרבי אות בעוצמה באזור מוגדר של עניין והקושר אותם בין מסגרות שונות (קוד דוגמא הכתוב ב-Matlab R2009 b באמצעות הפונקציה 'אבזרי אזור "של ארגז הכלים עיבוד תמונה מוצג).
- להעריך את הכימות של התקות, out-of-מטוס הקשורים HNPs שאינה ברציפות למעקב נע לאורך הציר האופטי, על ידי המרת מודולציות עוצמתם לאורך מסגרות שונות לעקירה צירית באמצעות עקומת הכיול שהוקמה בשלב 5.1. שים לב שהליך זה נותן גישה לתנועות צירית, אך לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הכיוון המוחלט (כלפי מעלה או מטה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני הערכת פעילות המכות על ידי ההדמיה confocal, אפיון מדוקדק של התגובה האופטית לא לינארית של מסנני PTFE בוצע, לבד או בנוכחות HNPs בריכוז גבוה (1 מ"ג / מיליליטר). הוא הבטיח כי: א) הקרינה נרגשת שני הפוטונים המצע החשוף היא חלשה מאוד ולא יכולה למנוע מדידת הדגימות ביולוגיות הרלוונטיות, וii) פליטת SH מHNPs הבודד ניתן לרכוש בקלות על ידי הדמיה באמצעות המצע במצב עלית זיהוי (איור 2). המטרה הייתה שתהיה לי פקדי התייחסות לכימות של עקירת 3D.
באיור 3, מבני לב שכותרת HNP וEBS מוצגים. האדום (איור 3 א), (ב 3 דמויות ו3C) צהובים ו, הצבעים ירוקים (איור 3D) מתאימות לautofluorescence NADH, ואילו כתמי SH הכחולים העזים נובעים מHNP המבודד. זה מעניין פוint מתוך הניגוד האופטי טוב מאוד להשגה על ידי טכניקה זו והתיוג הדליל יחסית בהשוואה לשיטות אחרות המבוססות על חלקיקים, כמו נקודות קוונטיות או עד המרה חלקיקים. במחקר הנוכחי, שיש תוויות מבודדות מאוד אינטנסיביים היה יתרון למעקב אחר מספר תנועות חלקיקים בודדות עצמאיות ושחזור תנועה קולקטיבית של מבני מקורן בתאי הגזע.
איור 3 ממחיש נוף פרוס אשכול מכות לב שכותרת HNP. אז יכולים להיות שנרשמו מבני 3D כזה במהירות גבוהה כדי לעקוב אחר דפוס ההתכווצות במצטבר התא HNP כפי שדווח בסרט 1. במקרה זה, כדי לשמור על קצב מהיר רכישה גבוהה לפתרון תנועת NP, רגישות הרכישה הכוללת לא הייתה מספיק להקלטת autofluorescence תא יחד עם פליטת SH מHNPs.
היישום של ניתוח תמונה שתואר בסעיף 5 לפרוטוcol מוחל על אנסמבל של מסגרות סרט מאפשר לתמצית של מידע על תנועה בודדת HNP (כיוון, תזוזה במטוס ולצאת למטוס, תדירות). התוצאה של ניתוח זה (איור 4) מצביעה על כך, בתוך אותו אשכול הלב, בתדירות קבועה ובתנועה מחוץ למטוס (ראו התמרת באיור 4) והתקות הן בסדר גודל של כמה מיקרומטרים (האורכים של החיצים המציינים את התקות למופת של חמישה צירופים שמנים מיודעת באיור 4 א מתאימות להתארכות המקסימלי של התנודות).
איור 1. דיפרנציאציה של hESC לאשכולות מכות לב וסימון עם חלקיקי HNPs למיקרוסקופיה הדמיה ההרמונית השנייה. Undifferentiateמושבות hESC ד (א) היו או 1) לחתוך לחתיכות קטנות יותר שימוש באפשרות StemPro EZPassage (ב ') ולתת בהשעיה כדי ליצור EBS לא סדיר (ג), או 2) ניתק לתוך תאים בודדים וreclustered באמצעות מערכת Aggrewell (B ') כדי ליצור EBS הרגיל (C'). שני הסוגים של EBS (C או C ") היו בתרבית למשך 2 ימים בהשעיה ולאחר מכן פעלו בהתאם לכלים מצופים ג'לטין. מכות אשכולות של שריר לב (ד ') היו אז גזור באופן ידני באמצעות אזמל ותרבית על מסנני PTFE (E) שהופקד על מוסיף לאפשר תרבויות אוויר נוזלי 3D (F ו F'). (ברים בקנה מידה עבור לוחות A, B, B ' , C ו C ': 100 מיקרומטר; עבור D פנלים ו-E:. 250 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תמונת אפיון אופטי איור 2. מצע PTFE. () מוארת תחום סינון PTFE לבד. תמונה (ב ') שני פוטונים של מסנן PTFE, אשר מציג הקרינה חלשה בהשוואה לעוצמת לייזר הגבוהה למדי מיושמת למדידה זו שליטה (13 mW). (C ו-D) לאחר הוספה למצע החשוף טיפת מים המכילה HNPs בריכוז מ"ג / מיליליטר 1, ניתן לרכוש פליטת SH שלהם בקלות דרך המסנן בעצימות נמוכות יחסית לייזר (2 mW). בD, תמונת 3D של חלקיקים התפשטו במסנן מוצגת. (ברים בקנה מידה: 50 מיקרומטר).
"Src =" _upload/51333/51333fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
איור 3. ההדמיה multiphoton של HNP כותרתו מבני לב וEBS. () אות הקרינה שני הפוטונים של אשכול מכות מוצגת באדום ואות SH מHNPs מוצגת בכחול. הצבעים מתאימות לעצמה שנמדדה על ידי ארבע photomultipliers nondescanned מצויד במסננים שונים של ספקטרום. (ננומטר הכחול 395 ± 11, 485 ± 20 ננומטר הירוק, ננומטר 531 ± 40 צהוב, וננומטר 607 ± 70 האדום). אשכול זה היה צילם ישירות דרך המסנן הנקבובי PTFE עם מטרת 10X עם גל עירור של 720 ננומטר והספק ממוצע של 8.8 mW. (ב) להציג פרוסת מבנה HNP שכותרתו לב מופק Z-מחסנית. (C) EB הדמיה באמצעות PTFE (הברים בקנה מידה עבור A, B ו-C: 100 מיקרומטר). (ד) תמונת 3D של EB שכותרתו עם HNPs, שיחזרה מZ-סריקות באמצעות apochromatic 40X NA 1.25 מטרת טבילה במים (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). HNPs מפוזר היטב סביב כל EB ואשכול הלב, המאפשר ניתוח התנועה.
איור 4. () מסגרת פרט של הסרט של צביר המכות וניתוח וקטורים של התקות במטוס HNPs (אות SH מוצגת בשחור). האורכים של החיצים מתאימות להתארכות המקסימלי של התנודות. (ב) התמרה של תנודות של צירופים שמנים מיודע מראים כי בתוך אותו אשכול הלב, בתדירות קבועה למחוץ למטוס תנועה (קו מקווקו כתום) ומתאים ל0.4 הרץ. ב- (קו שחור) ו (C) כיול עקומה משמשת להמרת עוצמת HNP לתזוזה צירית (ראה סעיף 5 לprotocol). חוגים: datapoints הניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היישום של הננוטכנולוגיה למחקר בתאי גזע הוא תחום חדש יחסית, אך המתרחב במהירות. כפי שציין במאמרי ביקורת שונים על הנושא, השימוש של חלקיקים ניתן ליישם כדי לבצע משימות מחקר שונות, החל מתא מעקב (הן במבחנה in vivo), למשלוח תאיים של חלבונים והגנים, לפחות לא ביצירת סביבות סלולריות biomimetic לגירוי / עיכוב מועדף של בידול ספציפי מסלולי 19,20. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא מוגבלת למעקב ואופטי, אם כי האפשרות של שימוש בעירור אינפרא אדום מובילה לעומק חדירה מוגבר ביחס פלואורסצנטי טכניקות מבוססות; הדמיה אופטית לא יכולה להיות מורחבת לכל גוף, ולכן צריך להיות כהשלמה זיהוי מגנטי 21. עבודה שפורסמה קודמת הראתה כמה גישות להערכת מבנה ותנועה של צבירי תאי לב, בתיוג cluding ידי צבעי ניאון 22, נקודות קוונטיות 23,24, תחמוצת ברזל סופר פאראמגנטיים חלקיקי 25, וחלקיקי ניאון עד המרה 26-28. היתרונות של HNPs ביחס לnanoprobes אלו קשורים להיעדרות של הלבנת פני תקופות זמן ארוכות, חדירת הדמיה מוגברת, tunability אורך הגל לניגוד מוגבר ביחס לautofluorescence. התיוג המוזר דליל התא (כלומר, אנחנו באיור 3D לספור כ 160 צירופים שמנים מיודעים ב100 קוביית מיקרומטר צד) שמתקבל על ידי גישה זו מתברר להיות מתאים גם מאוד לאתר את התכווצויות תא באשכולות לב 3D נגזר-ESC אנושיים במרחבית גבוהה רזולוציה.
הבחירה של nanomaterial אינה מוגבלת לKNbO מצופה PEG 3, אבל יכולה להכיל משפחה עשירה של חלקיקים בו מוצגות מבנים גבישיים noncentrosymmetric, אשר יכול לשלב functionaliti האחרes (מגנטי, רדיואקטיבי) המאפשר זיהוי רב מודלים. יתר על כן, יכול עוד להיות פונקציונליות HNPs מצופה PEG כזה להיות מכוון באופן ספציפי נגד אפיטופים או חלבונים מחייבים על מנת למקד באופן סלקטיבי אוכלוסיות תאים ספציפיות. מצד השני, גישת ההדמיה המוצעת כאן מחייבת סריקת מיקרוסקופ מצויד במקור לייזר מהירים. מעקב טבעי שניתן בחזון מעבודה זו הוא ניטור השילוב של תאים שכותרתו לחומרים ביולוגיים 3D ומבני פיגומים במבחנה ויותר לתוך רקמות מקומיות, לבצע את השילוב ואת הפונקציונליות של תאים מושתלים לאורך תקופות ממושכות.
יתרון של שימוש במסנני PTFE נושאות אגרגטים 3D, כמו במקרה שלנו, הוא האפשרות לבצע מדידות מרובות על פני ימים ושבועות, כפי שניתן לשחזר מסננים בחזרה על ההוספה שלהם תומכים בלי סיכונים של זיהומים. יתרה מכך, מסנני PTFE גם לאפשר הערכה החוזרת ונשנית של סיר פעולהentials באמצעות מערכים רב האלקטרודה.
ספי תא נזק לעירור רב פוטון באינפרא אדום הקרוב כבר נקבעו בעבר על פחות מ 1 TW / 2 סנטימטר על ידי König אח' 29. במחקר שלנו, באמצעות מטרת 0.75 NA 20X, עוצמת מיושמת נשארת תחת TW / 2 סנטימטר (0.26 TW / 2 סנטימטר) וזמן הקצר פיקסל להתעכב (0.1 μsec) בהשוואה לעבודתו של König (80 μsec) מבטיחה את האפשרות כדי לשמר את המדגם בחיים ומבדל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר במימון החלקי של האירופי FP7 פרויקט המחקר NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246,479, http://www.namdiatream.eu) ופרויקט INTERREG IV צרפת שוויץ נעמי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
