Summary
Детали протокола предоставляются для лабораторного маркировки человеческих эмбриональных стволовых клеток с второй гармоники наночастиц генерирующих. Методологии чЭСК расследования многофотонной микроскопии и их дифференциации в сердечных кластеров также представлены.
Abstract
В этом визуализируется эксперимента, подробно протокола предназначены для маркировки в пробирке человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) со вторыми наночастиц гармоники поколения (HNPs). Последние являются новое семейство датчиков недавно введенных для маркировки биологических образцов для визуализации многофотонной. HNPs способны удвоения частоты возбуждающего света в нелинейной оптической процессе генерации второй гармоники без ограничений по длине волны возбуждения.
Многофотонная основе методологии чЭСК дифференцировки в сердечных кластеров (поддерживается как долгосрочных воздух-жидкость культур) представлены в деталях. В частности, данные о том, как максимально интенсивный второй гармоники (SH) эмиссию изолированных HNPs в режиме 3D мониторинга избиении сердечную ткань в 3D показана. Анализ полученных изображений для получения 3D моделей смещения также подробно.
Introduction
Нелинейные системы микроскопии, благодаря присущей им трехмерных возможностей секционирующих, все чаще срабатывает спрос на фото-стабильным флуорофорами с полос поглощения двух фотонов в ближней инфракрасной. Только в последние пару лет, в дополнение к развитию флуоресценции основе меток (красителей, квантовых точек, до-превращающего наночастицы), другая методология изображений эксплуатирует использование нового семейства по своей сути нелинейных наночастиц в качестве меток, т.е. гармонические наночастицы (HNPs), которые были специально разработаны для многофотонной микроскопии. Эти метки, основанные на неорганических нецентросимметричных кристаллов, оказывать оптический контраст, генерирующий SH частоты возбуждения: например, преобразования долю ближайшем инфракрасном свете импульсного возбуждения (λ = 800 нм) в видимый синий свет (λ / 2 = 400 нм) . Некоторые авторы в недавнем прошлом испытывали различные материалы, в том числе железа иодата Fe (IO
В этом визуализируется эксперимента, подробно протокола предназначены для маркировки в пробирке человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) с нефункционализованного HNPs. Синтез и подготовка коллоидных суспензий, подробно изложены в предыдущей публикации и в ссылках в нем 16 и выходит за рамки данной работы. Методологии чЭСК расследования многофотонной микроскопии и их дифференциации в сердечных кластеров (поддерживается как долгосрочных воздух-жидкость культур) представлены. Человеком ESC можно позволить дифференцировать в пределах так называемых эмбриональных телец (EBS) двумя различными способами либо путем формирования EB колониеобразующих фрагментов в суспензии или, альтернативно, вынужденных агрегацию отдельных клеток в ЭТ с помощью Aggrewell пластины, как показано на фиг.1А . Культивирование избиении кластеры клеток сердца политетрафторэтилена (ПТФЭ) пористые фильтры факторilitates их долгосрочной эксплуатации для дальнейших исследований (например электрофизиологические измерения потенциалов действия).
Источником возбуждения сканирующего микроскопа должны быть способны доставить ультракоротких импульсов (с длительностью импульса, меньшей 300 фс на образце), чтобы достичь пиковую мощность, необходимую для выполнения второй гармоники визуализации HNPs. Например, наиболее распространенным фс-источник используется для работы с изображениями можно настраивать Ti: Sapphire лазеры. С другой стороны, другие сверхбыстрые лазеры могут быть использованы, например иона эрбия 17, хром форстеритом 18 или титан-сапфирового закачивается инфракрасных оптических параметрических генераторов. Микроскоп может быть оснащен объективом с предпочтительно достаточно высокой числовой апертурой. Очень важно, до измерений, и каждый раз цель заменяется, он является обязательным, чтобы минимизировать дисперсии, присутствующий в настройки (линзы) за счет оптимизации настроек лазерного импульса предварительной компрессора на работыдлина волны выбора. Эта процедура, подробно описаны в протоколе, гарантирует, что лазерный импульс является как можно ближе к преобразованию ограниченный срок (то есть самый короткий, насколько это возможно) в фокальной плоскости и максимизирует образец нелинейный отклик.
Цель анализа изображения, описанного в конце протокола является для выявления и отслеживания в движениях 3D HNPs связанных с ритмическими сокращениями избиении сердечные кластеров. Отслеживание наночастицы в плоскости изображения просто реализуется путем выявления их позиции в последовательных кадров фильма. Чтобы извлечь информацию о осевого перемещения, до калибровка ответ нелинейной интенсивности в зависимости от осевого смещения является обязательным. Заметим, что для долгосрочных измерений, для активного интерферометрического контроля образца осевом положении обязан поддерживать справедливость калибровочной кривой в присутствии тепловых и / или механических заносов.
В HNPs используемые здесь, чтобы ПРОФэ избиение клетки внутри агрегатов на основе оксида ниобата калия (KNbO 3), но и другие доступные нелинейные наноматериалы подробно рассмотрены в работе Staedler др. 16.
Нелинейные оптические эффективность большинства из наноматериалов исследованных до сих пор очень сопоставимы. Выбор для KNbO 3 по существу мотивировано хорошей стабильности коллоидного раствора и хорошей биосовместимости, протестированных на нескольких клеточных линий человека даже при довольно высокой концентрации и длительным временем экспозиции 16.
Учитывая новизну наноматериала, применяемого для этой работы, основные характеристики HNPs по сравнению с люминесцентными / люминесцентных биомаркеров показаны на короткий оригинальной компьютерной анимации видео реализованного авторами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура и расширения человеческих ЭСК
- Подготовка среда распространения клеток (так называемый PM), содержащий Нокаут DMEM с добавлением 20% нокаут сыворотки, 1% MEM незаменимых аминокислот, 1% L-глутамина 200 мм, 1% пенициллина-стрептомицина и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола.
- Оттепель человека ESC (чЭСК) в 8 мл PM среды и отцентрифугированы 5 мин при 115 х г отбросить ДМСО-дополняется замораживания среды.
- Добавьте 1 мл PM среде, содержащей 10 мМ Рок ингибитор для предотвращения апоптоза и улучшить выживаемость клеток при оттаивании (только с 24 часами инкубации).
- Добавить основной фактор роста фибробластов (оФРФ) в ПМ в нужной концентрации (4-10 нг / мл) для поддержания плюрипотентности.
- Тарелка с чЭСК на облученного крайней плоти человека фидерных клеток (γHFF) (рис. 1А), ранее покрытая в концентрации 2 х 10 4 клеток / см 2.
- Изменение средней ежедневно и, при необходимости, удалять части сolonies начинают дифференцироваться стремлением использовании удлиненную резко сократить пипетки Пастера.
- Раз в неделю, прохождение колонии ферментативно:
- Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
- Удаление PBS и инкубировали их с 0,5 мл на лунку теплой коллагеназы IV в 1 мг / мл в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Сбор колонии фрагменты в 2 мл новая PM и центрифуги при 115 мкг в течение 3 мин.
- С другой стороны, колонии можно пассировать механически путем соскабливания:
- Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
- Вручную очистить колонии, используя StemPro EZPassage ролик скребка инструмент (рис. 1В).
- Сбор колонии фрагменты и затем центрифугируют в течение 3 мин при 115 х г для удаления супернатанта.
- Пластинчатые фрагменты на γHFF или обрабатывать их для дифференцировки в эмбриональных телец (ЭТ).
2. Человека ESC ДифференциацияПротокол
- Подготовка дифференциация среднего (ДМ) с помощью Нокаут DMEM с добавлением 2% Hyclone сыворотки, 1,0% MEM незаменимых аминокислот, 1,0% L-глутамина 200 мм, 1% пенициллина-стрептомицина, 3,5 мкл β-меркаптоэтанола.
- Удалите среду и мыть колонии с 2 мл PBS.
- Формирование EB колониеобразующих фрагментов в виде суспензии:
- Удаление PBS и инкубировали их с 0,5 мл на лунку теплой коллагеназы IV в 1 мг / мл в течение 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
- Сбор колонии фрагменты в 2 мл новая DM и центрифуги при 115 мкг в течение 3 мин.
- Культура их в виде суспензии в сверхнизким прикрепления 6-луночные планшеты (2 мл на лунку) в течение 4 дней (фиг. 1С).
- Сбор и пластины вновь образованных ЭТ на 0,1% покрытые желатином 24-луночных планшетах (около 3 ЭТ / лунку) (рис. 1D).
- С другой стороны, вынужден агрегацию отдельных клеток в ЭТ помощью Aggrewell тарелку:
- Удалить PBS идиссоциировать колонии на отдельные клетки с помощью Accutase (0,5 мл / лунку).
- Центрифуга и ресуспендирования клеток в DM на 1,2 х 10 6 / мл.
- Добавить 2 мл на Aggrewell камере в течение 1 дня (рис. 1В ').
- Сбор вновь образованных ЭТ (Рис. 1C ') и пластины их на 0,1% покрытые желатином 24-луночных планшетах (около 3 ЭТ / лунку).
- Измените DM каждые 2-3 дня до появления бить кластеры кардиомиоцитов (15-30 дней).
3. Воздушно-жидкостной 3D Культуры Избиение Кластеры и маркировка с HNPs
- Выявление и вручную анализировать кластеры избиения кардиомиоцитов (рис. 1D), как правило, появляются через 2-4 недели культуры, используя удлиненный резко сократить пипетки Пастера.
- Депозитные 4 PTFE фильтров на вставки, которые будут размещены на 6-луночный планшет (рис. 1F) в.
- Добавьте 1 мл DM среды на вершине EACч хорошо.
- Добавьте одну расчлененный избиение кластер на каждой ПТФЭ фильтра (Рисунок 1E), максимальное 4/well, т.е. 24 агрегатов на чашку (рис. 1F ").
- Изменение DM среды каждые 2-3 дня.
- Чтобы пометить кластеры, удалить ПТФЭ фильтр, содержащий бьющееся кластер и положил его на 3,5 см со стеклянным дном блюдо (толщиной 170 мкм).
- Добавить 1 мл НПГ в концентрации 50 мкг / мл в течение 30 мин.
4. Нелинейные оптические изображений
- Подготовка образца. После ГНП маркировка (см. шаг 3.6), передать либо целые дифференцирующие ранние HeBS или сердечная избиение кластеров (расчлененные на сокращения появления) на фильтрах PTFE над толстым стеклянным дном блюдо 170 мкм, совместимым с рабочим расстоянием высоких целей числовой апертурой. В качестве альтернативы, применять прямое покрытие бить кластеров к стеклянным дном тарелки, предварительно покрытых 0,1% желатином.
- Образцы Переезд ввсе-в-одном микроскопа, снабженного инкубации камеру обеспечения стабильной температуры, влажности и CO 2 контроль над длительных периодов времени.
- После первоначального осмотра, изображение образца с помощью визуализации широкого поля под освещении белым светом для выявления структуры интересов в рамках дифференцированных ЭТ или активных кластеров избиение, которые будут отобраны для дальнейших исследований.
- Если клетка аутофлюоресценция от NADH и SH от HNPs должны быть одновременно приобрел, установить более короткую длину волны лазерного возбуждения (т.е. 720 нм) в соответствии с молекулярной абсорбции. Использование одного узкий полосовой фильтр спектрального центром в половину длины волны возбуждения (т.е. λ = 360 ± 10 нм) для обнаружения SH, а другой для обнаружения аутофлюоресценция.
- Во-первых выполнить быстро, низкое разрешение, трехмерное сканирование, чтобы восстановить общую морфологию сердца кластера и выберите плоскость изображения в объеме кластера с несколькими видимого ГНПс.
- При необходимости изменить длины волны возбуждения свободно для наилучшего соответствия оптические свойства образца, или чтобы избежать фотообесцвечивания, фото ущерб и имиджу глубже в тканях с ИК длины волны (то есть, 790 нм) и заменить второй фильтр гармоник соответственно (то есть, 395 нм ). Оптимизация настройки лазерного импульса предварительной компрессора при рабочей длине волны выбора, максимизируя второй гармоники сигнала HNPs нанесенных на образце.
- Для мониторинга в реальном времени сердечные кластера сокращений, установите микроскоп оптический сканер в быстрый режим, такой как резонансном режиме, что позволяет высокая скорость приобретение двумерных изображений.
- Выберите режим как наилучший компромисс между контраста изображения и скорости приобретения, такие как:
- Сканирование усреднения: 4
- Pixel время выдержки: 0.1 мкс
- Скорость изображения: 3.75 кадров в секунду (FPS)
- Мощность лазера корректируется в зависимости от фокусного пятна сИзе и скорость сканирования. 50 мВт (измеряется на входе в цель) является типичным значением для 0,1 мкс пикселей времени пребывания и Плана APO 20X NA 0.75 цели, сохраняя жизнеспособность клеток.
5. Анализ изображений
- Осевая процедура калибровки. Выберите одну ГНП, нанесенный на голой подложки. Настройте фокус (т.е. осевого положения наночастицы) для максимизации интенсивности SH. Vary контролируемым образом осевое положение столик микроскопа для получения калибровочной кривой, относящуюся интенсивность SH в зависимости от ГНП, смещенной от фокальной плоскости. Выход этого процедуры калибровки для План APO 20X NA 0.75 целью Сообщается на фиг.4С.
- Выберите HNPs присутствует во всех видеокадров и определить их периодических движений. Эта процедура может быть легко автоматизирована, например, с помощью пользовательского кода ищет для пятен интенсивности максимального сигнала в определенной области, представляющей интерес, исоединяя их между различными кадрами (пример кода, написанного на Matlab R2009 б с помощью функции "область реквизит" обработки изображения Toolbox представлена).
- Оценка количественного определения из собственного плоскости перемещений, связанных с не-постоянно отслеживаемые HNPs перемещения вдоль оптической оси, путем преобразования их модуляции интенсивности на протяжении разных в осевом смещении с помощью калибровочной кривой, установленный на шаге 5.1. Следует отметить, что эта процедура дает доступ к осевых перемещений, но не могут быть использованы для определения абсолютного направление (вверх или вниз).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
До оценки биений активности по конфокальной микроскопии, тщательный характеристика нелинейного оптического отклика ПТФЭ фильтра была выполнена, либо отдельно, либо в присутствии HNPs при высокой концентрации (1 мг / мл). Было обеспечено: я) обнаженного субстрата двухфотонного рады флуоресценции очень слаб и не может предотвратить измерения соответствующие биологические образцы, и б) SH выбросов от отдельных HNPs может быть легко приобретены изображений через подложку в режиме эпи-обнаружения (рис. 2). Цель состояла в том, чтобы иметь опорные элементы управления для количественного определения 3D смещением.
На рисунке 3, ГНП меченные сердечные структуры и ЭТ отображаются. Красный (фиг.3А), желтый (фиг. 3В и 3С) и зеленый (рис. 3D) цвета соответствуют NADH флуоресценции, тогда как интенсивные синие пятна SH вытекают из изолированного НПГ. Интересно роInt вне очень хороший оптический контраст, достигаемый этой техники и относительно редким маркировки по сравнению с другими наночастицы на основе методов, таких как квантовые точки или до преобразования наночастицы. В настоящем исследовании, имея очень интенсивные изолированных этикетки было выгодно для отслеживания нескольких независимых отдельные движения частиц и реконструкции коллективное движение клеток, полученных структур стволовых.
3В показан вид кусочек ГНП-меченого сердца бьющегося кластера. Такие 3D структуры затем могут быть записаны на высокой скорости для контроля сжатия шаблон в совокупности клеток ГНП о чем сообщается в видео 1. В этом случае, чтобы сохранить высокий уровень скорости сбора за разрешение на движение NP, общая чувствительность приобретение не было достаточно для записи клеток аутофлюоресценция наряду с SH излучения HNPs.
Применение анализа изображений описаны в разделе 5 протоцв применяется к ансамблю видеорамок позволяет экстракт информацию об отдельных движения ГНП (направление, перемещение в плоскости и вне плоскости, частоты). Результат этого анализа (рис. 4) показывает, что, в то же сердечной кластера, частота является постоянной для ин-и аут-оф-плоскости движения (см. преобразование Фурье на фиг.4В) и смещения порядка нескольких микрометров (длины стрелками, указывающими примерные смещения пять наночастиц на фиг.4А соответствуют максимальному удлинению колебаний).
Рисунок 1. Дифференциация чЭСК в сердечной избиение кластеров и маркировка с HNPs наночастиц для второй гармоники изображений микроскопии. Undifferentiateд чЭСК колонии (а), либо 1) вырублены на более мелкие куски с помощью инструмента StemPro EZPassage (B) и пусть в виде суспензии, чтобы сформировать нерегулярные ЭТ (С), или 2) диссоциирует на отдельные клетки и reclustered с использованием системы Aggrewell (B ') с образованием регулярных ЭТ (с'). Оба типа EBS (С или С ') культивировали в течение 2 дней в суспензии и затем придерживались покрытые желатином блюд. Избиение кардиомиоцитов кластеров (D) затем иссекали вручную скальпелем и культивируют на фильтрах из ПТФЭ (E), осажденный на вставками, чтобы воздух-жидкость 3D культур (F и F ') (масштабные линейки для панелей A, B, B ". , С и С ': 100 мкм; для панелей D и E:. 250 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. ПТФЭ субстрат оптический характеристика. (А) Яркий поле изображения ПТФЭ фильтра в одиночку. (B) Двухфотонная изображение ПТФЭ фильтра, который отображает слабую флуоресценцию сравнению с интенсивностью лазерного достаточно высокой прикладной для этого измерения управления (13 мВт). (C и D) после добавления в голой подложки капли воды, содержащей HNPs в концентрации 1 мг / мл, их SH излучение может быть легко приобретены через фильтр при сравнительно низкой интенсивности лазерного (2 мВт). В D, 3D-изображение наночастиц распространяются на фильтре показано. (масштабные линейки: 50 мкм).
_upload/51333/51333fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51333/51333fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Многофотонная визуализации ГНП помечены сердечные структуры и ЭТ. (А) Двухфотонный флуоресценции сигнал бьющимся кластера отображается красным цветом и сигнал ВГ от HNPs показаны синим цветом. Цвета соответствуют интенсивности, измеренной с помощью четырех nondescanned фотоумножителей, оснащенных различных спектральных фильтров. (Синий 395 ± 11 нм, зеленый 485 ± 20 нм, желтый 531 ± 40 нм, а красный 607 ± 70 нм). Этот кластер был сфотографирован непосредственно через PTFE пористый фильтр с целью 10X с длине волны возбуждения 720 нм и средней мощностью 8,8 мВт. (B) Вид кусочек ГНП с надписью сердечной структуры, извлеченной из Z-Stack. (С) EB изображается через ПТФЭ (масштабные линейки для A, B и C: 100 мкм). (D) 3D образ EB помечены HNPs, восстанавливается по Z-сканирования с использованием apochромантические 40X NA 1.25 погружением в воду цель (масштаб бар: 50 мкм). В HNPs хорошо распространяются вокруг всего EB и сердечной кластера, что позволяет анализ движения.
Рисунок 4. (А) Индивидуальный кадр фильма об избиении кластера и векторной анализа в плоскости HNPs перемещений (SH сигнала показано на черный). Длины стрелками соответствуют максимальному удлинению колебаний. (Б) преобразование Фурье NPS колебаний, показывающие, что в том же сердечной кластера, частота является постоянной для в-(черная линия) и вне плоскости движения (оранжевый пунктирная линия) и соответствует 0,4 Гц. (С) Калибровочная кривая используется для преобразования интенсивности ГНП в осевом смещении (См. раздел 5 протocol). Круги: экспериментальные точки данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Применение нанотехнологий для исследования стволовых клеток является относительно новым, но быстро расширяется поле. Как отметил различных обзорных статей по этой теме, использование наночастиц может применяться для выполнения различных исследовательских задач, начиная от клетки отслеживания (как в пробирке и в естественных), чтобы внутриклеточной доставки белков и генов, не в последнюю очередь создание биомиметические сотовые условия для льготного стимуляции / ингибирования видовой дифференциации дорожками 19,20. Подход, описанный в этом протоколе ограничивается оптических мышей и, хотя возможность с помощью инфракрасного возбуждение приводит к увеличению глубины проникновения по отношению к флуоресценции методов, основанных; оптических изображений не может быть распространено на все тело и, следовательно, должны быть дополнены магнитного обнаружения 21. Предыдущий опубликована работа показала несколько подходов для оценки структуры и движения кластеров клеток сердца, ввключая маркировку на флуоресцентных красителей 22, квантовых точек 23,24, супер-парамагнитного оксида железа наночастиц 25, и до преобразования флуоресцентные частицы 26-28. Преимущества HNPs в отношении этих нанозонды связаны с отсутствием отбеливания в течение длительного периода времени, увеличению проникновения изображений, длин волн управляемость для повышения контрастности по отношению к флуоресценции. Своеобразный редкие мечения клеток (то есть на фиг.3D мы рассчитываем примерно 160 NPs в мкм стороне куба 100), что получается при таком подходе оказывается очень хорошо подходит для отслеживания сотовых сокращения в 3D человека ESC-производных сердечных кластеров с высоким пространственным разрешение.
Выбор наноматериала не ограничивается PEG-покрытием KNbO 3, но может включать в себя богатую семью наночастиц отображения нецентросимметричной кристаллические структуры, которые могут, возможно, включать другие functionalitiэс (магнитные, радиоактивных) позволяет мультимодального обнаружения. Кроме того, такие HNPs PEG-покрытием может быть дополнительно функционализированный быть специально направлены против эпитопов или связывающих белков с тем, чтобы выборочно предназначаться для определенных клеточных субпопуляций. С другой стороны, подход, предложенный здесь визуализации требует сканирующего микроскопа, снабженного сверхбыстрого лазерного источника. Естественным продолжением вверх, которые могут быть предусмотрены в результате этой работы контролирует включение меченых клеток в 3D биоматериалов и подмостей структур в пробирке и далее в нативных тканей, следовать включение и функциональность трансплантированных клеток в течение длительных периодов.
Преимущество использования фильтров PTFE подшипников 3D агрегаты, как в нашем случае, является возможность выполнять несколько измерений в течение нескольких дней и недель, как фильтры могут быть восстановлены на их вставки поддерживает без риска загрязнения. Что еще более важно, фильтры PTFE также позволит повторяющиеся оценку действий горшокentials помощью многоэлектродной массивы.
Пороги повреждения клеток для возбуждения нескольких фотонов в ближней инфракрасной ранее решимости менее 1 TW / см 2 по Кениг и др. 29. В нашем исследовании, с использованием объектива 0.75 NA 20X, приложенное интенсивность остается под TW / см 2 (0,26 TW / см 2) и короткий пикселей времени пребывания (0,1 мкс), по сравнению с работой Кенига (80 мкс) обеспечивает возможность чтобы сохранить образец живой и дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за частичное финансирование от Европейского FP7-исследовательского проекта NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) и проекта INTERREG IV Франция-Швейцария NAOMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
References
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007).
- Aufray, M., et al. New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis. J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).
- Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging. Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).
- Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).
- Baumner, R., et al. Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles. Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).
- Le Xuan, L., et al. Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy. Small. 4, 1332-1336 (2008).
- Sandeau, N., et al. Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal. Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).
- Johnson, J. C., et al. Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires. Nano Lett. 2, 279-283 (2002).
- Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine. J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).
- Bonacina, L. Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy. Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology. Bioessays. 34, 351-360 (2012).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. 2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Magouroux, T., et al. High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers. Small. 8, 2752-2756 (2012).
- Staedler, D., et al. Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility. Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).
- Extermann, J., et al. Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy. Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).
- Chen, I. H., et al. Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources. Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).
- Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells. Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).
- Kaur, S., Singhal, B. When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology. J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).
- Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303, 359-363 (2004).
- Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots. Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).
- Zimmer, J. P., et al. Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging. J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).
- Vallee, J. P., et al. Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats. Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).
- Idris, N. M., et al. Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles. Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).
- Haase, M., Schafer, H. Upconverting nanoparticles. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).
- Cheng, L., et al. Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control. Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).
- Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes. Optics Letters. 22, 135-136 (1997).
