Summary
Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.
Abstract
En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con nanopartículas de generación de armónicos segundo (HNPs). Estos últimos son una nueva familia de sondas introducidas recientemente para el etiquetado de las muestras biológicas para imágenes multi-fotón. HNPs son capaces de duplicar la frecuencia de la luz de excitación por el proceso óptico no lineal de generación de segundo armónico sin restricciones en la longitud de onda de excitación.
Multi-fotón metodologías para la diferenciación de células madre en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo) en base se presentan en detalle. En particular, se muestra evidencia sobre cómo aprovechar al máximo el segundo armónico (SH) de emisión intensa de HNPs aisladas durante el control 3D de golpear el tejido cardíaco en 3D. El análisis de las imágenes resultantes para recuperar los patrones de desplazamiento en 3D también se detalla.
Introduction
Sistemas de microscopía no lineal, gracias a sus tres capacidades de seccionamiento dimensionales inherentes, han provocado cada vez más la demanda de fluoróforos foto-estable con bandas de absorción de dos fotones del infrarrojo cercano. Sólo en el último par de años, para complementar el desarrollo de etiquetas basadas en la fluorescencia (colorantes, puntos cuánticos, up-conversión de nanopartículas), una metodología diferente de imágenes ha estado explotando el uso de una nueva familia de nanopartículas inherentemente no lineales como etiquetas, es decir, nanopartículas de armónicos (HNPs) que se han desarrollado específicamente para la microscopía de múltiples fotones. Estas etiquetas, basadas en cristales noncentrosymmetric inorgánicos, ejercen contraste óptico que genera el SH de la frecuencia de excitación, por ejemplo mediante la conversión de una fracción de la luz cercana al infrarrojo excitación pulsada (λ = 800 nm) en luz azul visible (λ / 2 = 400 nm) . Varios autores en los últimos años han probado diferentes materiales, incluyendo yodato de hierro Fe (IO
En este experimento se visualizó, detalles del protocolo se proporcionan para marcaje in vitro de las células madre embrionarias humanas (CMEH) con HNPs no funcionalizados. La síntesis y preparación de suspensiones coloidales se detalla en una publicación anterior, y en las referencias allí 16 y está más allá del alcance de este trabajo. Se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacos (mantenidas como cultivos al aire líquido a largo plazo). ESC humana se puede dejar para diferenciar dentro de los llamados cuerpos embrioides (EBS) en dos formas diferentes, ya sea por la formación de EB de fragmentos de colonias en suspensión o, alternativamente, la agregación de células individuales en EBS utilizando la placa de Aggrewell forzados, como se ilustra en la Figura 1A . El cultivo de vencer a grupos de células cardiacas en politetrafluoroetileno (PTFE) filtros porosos FACilitates su mantenimiento a largo plazo para estudios posteriores (por ejemplo, las mediciones electrofisiológicas de los potenciales de acción).
La fuente de excitación de la microscopio de barrido debe ser capaz de entregar pulsos ultracortos (con una duración de pulso menor que 300 fs a la muestra) a fin de alcanzar la potencia de pico necesaria para realizar la imagen con segundo armónico de HNPs. Por ejemplo, el fs-fuente más común utilizado para la formación de imágenes son sintonizables Ti: láseres de zafiro. Alternativamente, otros láseres ultrarrápidos pueden emplearse, por ejemplo iones de erbio 17, forsterita cromo 18 o Ti: zafiro bombeado infrarrojos osciladores paramétricos ópticos. El microscopio puede estar equipado con un objetivo con una apertura numérica preferentemente bastante alto. Muy importante, antes de las medidas, y cada vez que el objetivo se sustituye, es obligatorio para reducir al mínimo la dispersión presente en el set-up (lentes) mediante la optimización de la configuración de la pulso de láser pre-compresor en el trabajolongitud de onda de la elección. Este procedimiento, se detalla en el protocolo, se asegura de que el pulso de láser es tan cerca como sea posible a la transformación duración limitada (es decir, más corta como sea posible) en el plano focal y maximiza la respuesta de muestra no lineal.
El objetivo del análisis de la imagen se describe al final del protocolo es identificar y realizar un seguimiento de los movimientos en 3D HNPs asociados con las contracciones rítmicas de vencer grupos cardíacas. Nanopartículas de seguimiento en el plano de la imagen es simplemente dieron cuenta mediante la identificación de sus posiciones en los sucesivos fotogramas de película. Para extraer información sobre el movimiento axial, una calibración previa de la respuesta no lineal de intensidad como una función del desplazamiento axial es obligatorio. Tenga en cuenta que para las mediciones a largo plazo, un control interferométrico activa de la posición axial de la muestra se requiere para mantener la validez de la curva de calibración, en presencia de derivas térmicas y / o mecánicos.
Los HNPs utilizados aquí para traccélulas e latiendo dentro de los agregados están basados en óxido de niobato de potasio (KNbO 3), pero otros nanomateriales no lineales disponibles son revisados en detalle en la obra de Staedler et al 16.
Las eficiencias ópticas no lineales de la mayoría de los nanomateriales investigadas hasta ahora son muy comparables. La elección de KNbO 3 fue motivado esencialmente por la buena estabilidad de la solución coloidal y su buena biocompatibilidad, probado en varias líneas celulares humanas incluso en concentración bastante alta y tiempos de exposición largos 16.
Dada la novedad del nanomaterial empleado para este trabajo, las principales características de HNPs en comparación con / luminiscentes bio-marcadores fluorescentes se muestran en un vídeo de animación de ordenador original corto realizado por los autores.
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Protocol
1. Cultura y Ampliación de ESC Humano
- Preparar el medio de propagación de células (llamado PM) que contiene Knockout DMEM suplementado con 20% suero Knockout, 1% MEM ácidos no esencial amino, 1% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, y 3,5 l β-mercaptoetanol.
- Descongelar ESC humana (células madre) en 8 ml de medio PM y los centrifugar 5 min a 115 xg para descartar medio de congelación DMSO-complementado.
- Añadir 1 ml de PM medio que contiene 10 mM de inhibidor de la roca para evitar la apoptosis y mejorar la supervivencia celular tras la descongelación (sólo 24 h de incubación).
- Añadir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) a la PM en la concentración deseada (4-10 ng / ml) para el mantenimiento de la pluripotencia.
- Placa del hESC en humano irradiado prepucio células alimentadoras (γHFF) (Figura 1A), previamente se sembraron a una concentración de 2 x 10 4 células / cm 2.
- Cambie medio diario y, cuando sea necesario, eliminar partes de colonies empezando a diferenciarse por aspiración mediante un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada.
- Una vez a la semana, las colonias de paso por vía enzimática:
- Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
- Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nuevo PM y centrifugar a 115 xg durante 3 min.
- Alternativamente, las colonias pueden ser pasados mecánicamente por raspado:
- Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
- Raspar manualmente colonias utilizando la herramienta rascador rodillo StemPro EZPassage (Figura 1B).
- Recoger fragmentos de colonias y centrifugar a continuación durante 3 minutos a 115 xg para eliminar el sobrenadante.
- Fragmentos de placas de γHFF o a procesar para la diferenciación en cuerpos embrionarios (EBS).
2. Diferenciación ESC HumanoProtocolo
- Preparar el medio de diferenciación (DM) utilizando Knockout DMEM suplementado con 2% de suero Hyclone, 1,0% MEM ácidos no esencial amino, 1,0% de L-glutamina 200 mM, 1% de penicilina-estreptomicina, 3,5 l β-mercaptoetanol.
- Retire medio y lavar las colonias con 2 ml de PBS.
- EB formación de fragmentos de colonias en suspensión:
- Retirar PBS y se incuban con 0,5 ml por pocillo de la colagenasa IV caliente a 1 mg / ml durante 10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Recoge fragmentos de colonias en 2 ml nueva DM y centrifugar a 115 xg durante 3 min.
- Cultura en suspensión en ultra bajo apego placas de 6 pocillos (2 ml por pocillo) durante 4 días (Figura 1C).
- Recoger y placa EBS recién formadas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo) (Figura 1D).
- Alternativamente, la agregación de células individuales forzado a EBS utilizando la placa de Aggrewell:
- Retirar PBS ydisociar colonias en células individuales utilizando Accutase (0,5 ml / pocillo).
- Centrífuga y volver a suspender las células en DM a 1,2 x 10 6 / ml.
- Añadir 2 ml por cámara Aggrewell por 1 días (Figura 1B ').
- Recoger EBS recién formados (Figura 1C ') y la placa de ellas en 0,1% gelatina revestido placas de 24 pocillos (aproximadamente 3 EB / pocillo).
- Cambie DM cada 2-3 días hasta la aparición de vencer a los grupos de los cardiomiocitos (15-30 días).
3. Aire-líquido Culturas 3D de Vencer Clusters y etiquetado con HNPs
- Identificar y analizar manualmente los racimos de batiendo cardiomiocitos (Figura 1D), normalmente aparece después de 2-4 semanas de cultivo, utilizando un reducido drásticamente pipeta Pasteur alargada.
- Depósito 4 filtros de PTFE por plaquita que se pondrán en una placa de 6 pocillos (Figura 1F).
- Añadir 1 ml de medio de DM en la parte superior de each también.
- Añadir un racimo diseccionado batiendo en cada filtro PTFE (Figura 1 E), máximo 4/well, es decir, 24 agregados por placa (Figura 1 F ').
- Cambie medio DM cada 2-3 días.
- Para etiquetar los clusters, retire el filtro de PTFE que contiene el cluster paliza y lo puso en 3,5 cm plato de vidrio inferior (170 m de espesor).
- Añadir 1 ml de PNH a una concentración de 50 mg / ml para 30 min.
4. Optico y no lineal
- Preparación de la muestra. Después del marcaje HNP (ver Paso 3.6), traslado, ya sea enteros diferenciadores HEBS primeros o clusters paliza cardiaca (disecados en apariencia contracción) en los filtros de PTFE sobre una gruesa placa de 170 m con fondo de cristal compatible con la distancia de trabajo de altos objetivos numéricos de apertura. Por otra parte, aplicar un recubrimiento directo de vencer grupos para el plato de fondo de vidrio recubierto previamente con 0,1% de gelatina.
- Transferir las muestras a untodo-en-uno microscopio equipado con incubando cámara de garantizar una temperatura estable, humedad y CO de control 2 durante períodos de tiempo prolongados.
- Después de la inspección inicial, la imagen de la muestra a través de imágenes de campo amplio con iluminación de luz blanca para identificar estructuras de interés dentro de EBS diferenciados o clusters paliza activos que serán seleccionados para futuras investigaciones.
- Si la autofluorescencia celular desde el NADH y SH de HNPs tienen que ser adquirida de forma simultánea, establecer una longitud de onda de excitación de láser más corto (es decir, 720 nm) para que coincida con la absorción molecular. Utilice un filtro de paso de banda espectral estrecha centrada en la mitad de la longitud de onda de excitación (es decir, λ = 360 ± 10 nm) para detectar SH, y otro para la detección de la autofluorescencia.
- En primer lugar realizar una baja resolución rápida, escaneo tridimensional para reconstruir la morfología general de la agrupación cardiaca y seleccione un plano de imagen dentro del volumen de cluster con varios HNP visibles.
- Si es necesario, cambie la longitud de onda de excitación libremente para adaptarse mejor a las propiedades ópticas de la muestra o para evitar photobleaching, el daño por luz y la imagen más profunda en los tejidos con una longitud de onda de infrarrojos (es decir, 790 nm) y vuelva a colocar el segundo filtro de armónicos en consecuencia (es decir, 395 nm ). Optimizar los ajustes del pulso de láser de pre-compresor a la longitud de onda de trabajo de elección mediante la maximización de la segunda señal armónica de HNPs depositados en la muestra.
- Para controlar en tiempo real las contracciones cardíacas de racimo, establecer el escáner óptico microscopio en el modo más rápido, tales como modo de resonancia, lo que permite la adquisición de alta velocidad de imágenes de dos dimensiones.
- Elija los ajustes que mejor compromiso entre el contraste de la imagen y la velocidad de adquisición, tales como:
- Promediado Scan: 4
- Píxel tiempo de espera: 0,1 microsegundos
- Tasa de imagen: 3,75 fotogramas por segundo (fps)
- Potencia del láser se ajusta de acuerdo a la mancha focal sIze y velocidad de exploración. 50 mW (medido en la entrada del objetivo) es un valor típico para 0,1 microsegundos píxel tiempo de permanencia y el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo preservar la viabilidad celular.
5. Análisis de Imágenes
- Procedimiento de calibración Axial. Seleccione un solo HNP depositado sobre un sustrato desnudo. Ajuste el enfoque (es decir, la posición axial de la nanopartícula) para maximizar la intensidad SH. Varían de forma controlada la posición axial de la platina del microscopio para obtener la curva de calibración correspondiente a la intensidad de SH como una función de la PNH desplazamiento desde el plano focal. La salida de este procedimiento de calibración para el Plan de APO 20X NA 0,75 objetivo se informó en la Figura 4C.
- Seleccione HNPs presentes en todos los fotogramas de vídeo y determinar sus movimientos periódicos. Este procedimiento puede automatizarse fácilmente, por ejemplo mediante un código personalizado en busca de manchas máxima de la señal de intensidad en una región de interés definida yconectándolos entre diferentes marcos (un código de ejemplo escrito en Matlab R2009 b utilizando la función 'props' región de la caja de herramientas de procesamiento de imágenes se presenta).
- Evaluar la cuantificación de los desplazamientos fuera del plano, asociados con HNPs no trazables continuamente en movimiento a lo largo del eje óptico, mediante la conversión de sus modulaciones de intensidad a lo largo de diferentes marcos en desplazamiento axial usando la curva de calibración establecida en el paso 5.1. Tenga en cuenta que este procedimiento da acceso a movimientos axiales, pero no se puede utilizar para determinar la dirección absoluta (hacia arriba o hacia abajo).
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Representative Results
Antes de la evaluación de la actividad latidos por imagen confocal, se realizó una caracterización cuidadosa de la respuesta óptica no lineal de los filtros de PTFE, ya sea solo o en presencia de HNPs a alta concentración (1 mg / ml). Se aseguró de que: i) el sustrato desnudo de dos fotones de fluorescencia excitada es muy débil y no puede evitar que la medición de las muestras biológicas pertinentes, y ii) la emisión SH a partir de HNPs aislados puede ser fácilmente adquirido por formación de imágenes a través del sustrato en el modo de detección de epi (Figura 2). El objetivo era tener controles de referencia para la cuantificación de desplazamiento 3D.
En la Figura 3, se muestran estructuras y EBS cardíacos marcadas con PNH. El rojo (Figura 3A), amarillo (Figuras 3B y 3C) y, verdes colores (Figura 3D) corresponden a NADH autofluorescencia, mientras que las intensas manchas azules SH se derivan de aislados de SNP. Es interesante POint el muy buen contraste óptica alcanzable por esta técnica y el etiquetado relativamente escaso en comparación con otros métodos basados en nanopartículas-, como puntos cuánticos o de conversión ascendente nanopartículas. En el presente estudio, que tiene muy intensos etiquetas aisladas era ventajosa para el seguimiento de varios movimientos de partículas individuales independientes y reconstruir el movimiento colectivo de las estructuras de las células derivadas de células madre.
Figura 3B ilustra una vista rebanada de un cluster paliza cardíaca marcada con HNP. Tales estructuras 3D pueden entonces ser grabadas a alta velocidad para controlar el patrón de contracción en el agregado celular-PNH como se informa en la película 1. En este caso, para mantener una alta tasa de velocidad de adquisición para resolver el movimiento NP, la sensibilidad global de adquisición no era suficiente para la grabación de la autofluorescencia celular, junto con la emisión SH a partir de HNPs.
La aplicación de análisis de imágenes se describe en la Sección 5 de la protoCol aplicado al conjunto de cuadros de película permite que el extracto de la información sobre el movimiento individuo PNH (dirección, el desplazamiento en el plano y fuera del plano, la frecuencia). El resultado de este análisis (Figura 4) indica que, dentro de la misma agrupación cardiaca, la frecuencia es constante para en-y el movimiento fuera de plano (ver transformada de Fourier en la Figura 4B) y desplazamientos son del orden de unos pocos micrómetros (las longitudes de las flechas que indican los desplazamientos ejemplares de cinco PN en la Figura 4A corresponden a la elongación máxima de las oscilaciones).
Figura 1. La diferenciación de las células madre en grupos de batido cardíaco y marcaje con nanopartículas HNPs de segunda microscopía imagen armónica. Undifferentiated colonias hESC (A) eran o bien 1) cortado en trozos más pequeños con la función StemPro EZPassage (B) y dejar en suspensión para formar EBS irregulares (C), o 2) se disocia en células individuales y reclustered utilizando el sistema Aggrewell (B ') para formar EBS regulares (C'). Ambos tipos de EBS (C o C ') se cultivaron durante 2 días en suspensión y luego se adhirieron a los platos recubiertos con gelatina. Beating grupos de cardiomiocitos (D) fueron disecados manualmente utilizando un bisturí y se cultivan en filtros de PTFE (E) depositado sobre insertos para permitir que las culturas 3D aire-líquido (F y F '). (Barras de escala para los paneles A, B, B' , C y C ': 100 m; para paneles D y E:. 250 m) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Caracterización óptica Figura 2. Sustrato PTFE. (A) Imagen de campo claro del filtro de PTFE solo. (B) Imagen de dos fotones del filtro de PTFE, que muestra una fluorescencia débil en comparación con la intensidad más alta de láser aplicado para esta medición de control (13 mW). (C y D) Después de la adición al sustrato desnudo una gota de agua que contiene 1 a HNPs concentración mg / ml, su emisión SH se puede adquirir fácilmente a través del filtro en la intensidad del láser comparativamente baja (2 mW). En D, se muestra una imagen en 3D de las nanopartículas repartidos en el filtro. (barras de escala: 50 micras).
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Figura 3. Multifotónica imágenes de HNP etiquetado estructuras cardiacas y EBS. (A) La señal de fluorescencia de dos fotones de un racimo golpiza se muestra en rojo y la señal SH de las HNPs se muestra en azul. Los colores corresponden a la intensidad medida por los cuatro fotomultiplicadores nondescanned equipados con filtros espectrales diferentes. (Azul 395 ± 11 nm, verde 485 ± 20 nm, amarillo 531 ± 40 nm, y el rojo 607 ± 70 nm). Este grupo fue fotografiada directamente a través del filtro poroso de PTFE con un objetivo de 10X con una longitud de onda de excitación de 720 nm y una potencia media de 8,8 mW. (B) Una vista rebanada de un etiquetado estructura cardíaca HNP extraído de un z-stack. (C) Un EB fotografiada a través de las de PTFE (barras de escala para A, B y C: 100 micras). (D) Una imagen 3D de una EB etiquetado con HNPs, reconstruido a partir de z-scan utilizando un apochromántico 40X NA 1,25 objetivo de inmersión en agua (barra de escala: 50 micras). Los HNPs están bien repartidos por todo el EB y el cluster cardiaco, lo que permite el análisis de movimiento.
Figura 4. (A) Individual marco de la película de la agrupación paliza y análisis vectorial de en el plano HNPs desplazamientos (señal SH se muestra en negro). Las longitudes de las flechas corresponden a la elongación máxima de las oscilaciones. (B) la transformada de Fourier de las oscilaciones NPs que muestran que dentro de la misma agrupación cardíaco, la frecuencia es constante para in-(línea de color negro) y fuera del plano de movimiento (línea punteada de color naranja) y corresponde a 0,4 Hz. (C) La curva de calibración se utiliza para convertir la intensidad de la Policía Nacional Haitiana en el desplazamiento axial (Vea la Sección 5 de la protOcol). Círculos: puntos de datos experimentales.
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Discussion
La aplicación de la nanotecnología a la investigación con células madre es una disciplina relativamente nueva, pero en rápida expansión campo. Como se ha señalado por varios artículos de revisión sobre el tema, el uso de nanopartículas se puede aplicar para llevar a cabo diferentes tareas de investigación, que van desde celular de seguimiento (tanto in vitro como in vivo), para el suministro intracelular de proteínas y genes, no menos importante la creación de entornos celulares biomiméticos para preferencial estimulación / inhibición de la diferenciación específica de las vías de 19,20. El enfoque descrito en este protocolo se limita a seguimiento óptico y, a pesar de la posibilidad de utilizar excitación infrarroja conduce a una mayor profundidad de penetración con respecto a la fluorescencia técnicas basadas; proyección de imagen óptica no se puede extender a todo el cuerpo y por lo tanto debe ser complementado con la detección magnética 21. El trabajo previo publicado mostró varios enfoques para evaluar la estructura y el movimiento de los grupos de células cardiacas, enetiquetado INCLUYENDO por los tintes fluorescentes 22, puntos cuánticos 23,24, óxido de hierro super paramagnético nanopartículas 25, y las partículas fluorescentes de conversión ascendente 26-28. Las ventajas de HNPs con respecto a estos nanosondas están asociados con la ausencia de la decoloración durante períodos prolongados de tiempo, el aumento de la penetración de formación de imágenes, la capacidad de ajuste de longitud de onda para el aumento de contraste con respecto a la autofluorescencia. El marcaje celular escasa peculiar (es decir, en la figura 3D contamos aproximadamente 160 PN en un cubo micras lateral 100) que se obtiene por este método resulta ser muy bien adaptado para rastrear contracciones de las células cardíacas en grupos derivados de ESC humanos 3D en alta resolución espacial resolución.
La elección del nanomaterial no se limita a recubiertos de PEG-KNbO 3, pero puede abarcar una rica familia de nanopartículas que muestran estructuras cristalinas noncentrosymmetric, que posiblemente pueden incorporar otros functionalities (magnético, radiactivo) que permite la detección multimodal. Además, tales HNPs recubiertos de PEG más se pueden funcionalizar estar dirigida específicamente contra epítopos o proteínas de unión con el fin de atacar selectivamente a las subpoblaciones de células específicas. Por otro lado, el enfoque de formación de imágenes que aquí se propone requiere un microscopio de barrido equipado con una fuente de láser ultrarrápido. Una prolongación natural que puede ser previsto de este trabajo está supervisando la integración de células marcadas en biomateriales 3D y estructuras de andamios en vitro y más en tejidos naturales, para seguir la incorporación y la funcionalidad de las células trasplantadas durante períodos prolongados.
Una ventaja de utilizar filtros de PTFE teniendo agregados en 3D, como en nuestro caso, es la posibilidad de realizar múltiples mediciones durante días y semanas, como filtros se pueden restaurar de nuevo en su inserción apoya sin riesgos de contaminaciones. Más importante aún, los filtros de PTFE también permiten la evaluación de la acción repetitiva ollaentials utilizando matrices de electrodos múltiples.
Umbrales de daño celular para la excitación multi-fotón en el infrarrojo cercano se ha determinado previamente a menos de 1 TW / cm 2 por König et al 29. En nuestro estudio, utilizando un objetivo de 0,75 NA 20X, la intensidad aplicada permanece bajo el TW / cm 2 (0,26 TW / cm 2) y el tiempo de permanencia de píxeles corto (0,1 microsegundos) en comparación con el trabajo de König (80 microsegundos) asegura la posibilidad para conservar la muestra vivo y la diferenciación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer la financiación parcial del Proyecto de Investigación FP7 NAMDIATREAM Europea (NMP4-LA-2.010-246479, http://www.namdiatream.eu) y el proyecto INTERREG IV Francia-Suiza NAOMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37 °C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four nonphotomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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