-Polarisatie gebaseerde Total Internal Reflection Fluorescentie microscopie (pTIRFM) maakt real-time detectie van celmembraan dynamiek. Dit artikel beschrijft de uitvoering van pTIRFM voor de studie van membraan remodeling tijdens gereguleerde exocytose. De techniek is generaliseerbaar naar andere celbiologische processen die veranderingen in de membraan vorm direct of indirect te betrekken.
Om nieuwe inzichten in de dynamiek van exocytose krijgen onze richt zich op de veranderingen in de lipide bilaag vorm die bij de fusie van vesicles en plasmamembranen nauwkeurig te worden geregeld. Deze snelle, gelokaliseerde veranderingen worden bereikt door dynamische interacties tussen lipiden en gespecialiseerde eiwitten die membraan kromming controleren. Het ontbreken van dergelijke interacties zou niet alleen verwoestende gevolgen voor vesikel fusie, maar een groot aantal andere cellulaire functies die de controle over membraan vorm betrekken. De afgelopen jaren is de identiteit van een aantal eiwitten met membraan vormgeving eigenschappen bepaald. Wat overblijft ontbreekt is een roadmap van wanneer, waar en hoe ze handelen als fusie en inhoud vrijlating vooruitgang.
Ons begrip van de moleculaire gebeurtenissen die membraan remodeling in staat is historisch beperkt door een gebrek aan analytische methoden die gevoelig membraan kromming of hebben de temporele resolutie te track snelle veranderingen. PTIRFM voldoet aan beide criteria. We bespreken hoe pTIRFM wordt uitgevoerd om te visualiseren en te interpreteren snelle, submicron veranderingen in de oriëntatie van chromaffiene celmembranen tijdens dichte kern blaasje (DCV) fusie. De chromaffinecellen we gebruiken zijn geïsoleerd van runderen bijnieren. Het membraan wordt gekleurd met een lipofiele carbocyanine kleurstof, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chloorbenzeensulfonaat, of deed. DiD intercalates in het membraan vlak met een "vaste" oriëntatie en derhalve gevoelig voor de polarisatie van het verdwijnende veld. De DID gebeitst celmembraan is sequentieel enthousiast met orthogonale polarisaties van een 561 nm laser (p-pol, s-pol). Een 488 nm laser wordt gebruikt om vesicle bestanddelen en tijd zichtbaar het moment van fusie. Exocytose wordt veroorzaakt door lokaal perfuseren cellen met een KCl depolariserende oplossing. Analyse wordt uitgevoerd met behulp van offline-maat geschreven software om te begrijpen hoe heeftemissie-intensiteit wijzigingen hebben betrekking op fusie porie dilatatie.
De goede uitvoering van exocytose vereist extreme veranderingen in de membraan dubbellaag vorm precies worden georkestreerd. Voorafgaand aan fusie lokale buiging van de plasmamembraan plaatsvindt onder de korrel, deels om de energiebarrière interactie van bilagen verminderen. Later, membranen fuseren, gebieden van hoge kromming worden gegenereerd en worden gestabiliseerd. Ten slotte moet gesmolten membranen worden gebogen uit hun oorspronkelijke vorm aan de fusie porie uitbreiden en in staat inhoud vrijlating 1. Omdat membranen alleen waarschijnlijk zulke dramatische en gecoördineerde veranderingen ondergaan, eiwitten noodzakelijk gebeurtenissen bemiddelen. Maar hoe ze handelen op veranderingen in membraantopologie beïnvloeden tijdens het fusieproces blijft zeer de vraag.
Uitstekend in vitro modellen bestaan om membraan kromming visualiseren. Het gebruik van negatieve vlek EM, bijvoorbeeld, is belangrijk geweest voor het vormgeven van de huidige moleculaire modellen voor de acties van twee hoofdroutes proteins – synaptotagmin en dynamin (voor overzichten, zie Chapman 2 en Henshaw 3). De meeste real-time analyses van exocytose niet kromming direct detecteren. In plaats daarvan wordt de kromming afgeleid uit testen die rapporteren over de kinetiek van lumenale lading vrijlating 4-8 of veranderingen in membraanoppervlak 9-11. PTIRFM overbrugt de kloof tussen in vivo en in vitro studies doordat directe, real-time metingen van veranderingen in de membraan micromorfologie.
PTIRFM, in een nonimaging modus, is ontwikkeld door Axelrod en collega's om de oriëntatie van NPD-PE opgenomen in een model membraan 12 meten. De techniek werd vervolgens aangebracht op dynamische veranderingen in levende cellen gekenmerkt met Dil en FM1-43 13-18 visualiseren. In pTIRFM worden twee verdwijnende veld polarisaties gebruikt om sequentieel exciteren van een membraan ingebedde probe: p-polarisatie (in het vlak van inval) en s-polarisatie (loodrecht op het vlak van inval). Voorafgaand aan beeldvorming, de sonde – in casu heeft – kort toegevoegd aan het extracellulaire medium en mag intercaleren in het plasma membranen van de cellen te onderzoeken. In regio's waar het membraan is niet evenwijdig aan het dekglaasje (zoals in een membraan ruches of inspringen), het deed ook nonparallel zijn. Bij dergelijke gebieden prikkelbaar de p-pol balk. De p-pol beam minder effectief prikkelen deed in membraan gebieden die meestal parallel aan de dekglaasje. Pixel-to-pixel verhouding images (P / S) de rapportage over de uitstoot van een sequentiële p-en s-pol excitatie van DID zal daarom specifiek benadrukken gebieden van membraan vervorming. In theorie, de P / S-verhouding afbeeldingen zijn gevoelig voor zelfs kleine hoeken plasmamembraan afwijking van het dekglaasje met de amplitude van de veranderingen voorspeld door computersimulaties 18. P / S afbeeldingen zijn ook onafhankelijk van fluorofoor van het dekglaasje oppervlak lokale fluorofoorconcentratie. Lokale fluorofoor concentratie plaats door beelden rapportage over de pixel-voor-pixel som van de P-emissie en 2 maal de emissie S (P 2 S). De P 2 S meting is gevoelig voor de exacte geometrie van de inspringing, met enkele, weinig of geen verandering mogelijk. Dit kan worden aangetoond door computersimulaties dat model overgangen van een fusie-porie van een vroege (dwz met een smalle nek) naar een later stadium 16,18. De P 2 S uit een gefuseerd blaasje bevestigd aan het plasmamembraan via een smalle hals (en meer DID nabij de interface) wordt voorspeld groter bijvoorbeeld dan een gefuseerd blaasje met een veel grotere poriën (waarbij de DID is binnen het zwakste deel van het verdwijnende veld).
In dit artikel bespreken we hoe pTIRFM wordt geïmplementeerd en gebruikt om de snelle, gelokaliseerde veranderingen in de membraan vorm die optreden tijdens fusie porie dilatatie bestuderen. Terwijl slechts een aanvraag is expliciet discussed, de methoden generalizable een verscheidenheid van andere celbiologische processen die direct of indirect betrokken membraan remodeling.
-Polarisatie gebaseerde TIRFM detecteert snelle, submicroscopische veranderingen in de membraan topologie. De uitvoering van de techniek is relatief eenvoudig, vooral als TIRF optiek zijn al aanwezig. Alles wat nodig is is een kwartgolfplaat, twee polariserende kubussen, en luiken aan p-pol en s-pol verlichting paden scheiden. De exacte positie van deze componenten op de tafel wordt gewoonlijk bepaald door de beschikbare ruimte.
Om membraan topologische informatie te verkrijgen, moet de fluorescerende gebruikt intercaleren met vaste of bekende oriëntatie. De techniek, zoals beschreven in dit artikel wordt uitgegaan van carbocyanine kleurstoffen maar andere kleurstoffen, FM1-43 14, kunnen eveneens worden gebruikt. Het membraan kleuring procedure zelf is eenvoudig. Gekweekte cellen vereisen slechts een zeer korte blootstelling (minder dan 10 seconden) om een kleine hoeveelheid van DII / deed om uitbundige etikettering van het membraan te verkrijgen. Het toevoegen van overtollige kleurstof leidt tot lichtverstrooiing aggregates op het glas die de beeldkwaliteit verminderen. Over-incubatie cellen met kleurstof leidt tot internalisatie die nadelige gevolgen voor de beeldkwaliteit en eventueel levensvatbaarheid van de cellen heeft verven. Als een cel is goed gekleurd, zal er duidelijk onderscheid in de emissiebeelden P en S. Zoals getoond in figuur 2A, zal de P-emissie levendig lichte delen van het membraan die schuin dekglaasje (de randen van de cel footprint) terwijl de S emissie-intensiteit ongeveer uniform over de cel footprint is. Als een duidelijk onderscheid tussen P en S blijkt niet, dan is het mogelijk dat de cel slecht is gehecht aan het substraat of de celmembraan is niet gezond, en de cel wordt niet gebruikt voor experimenten.
Onze vorige studies beschrijven pTIRFM gebruikt DII als de fluorescente membraan sonde. Hier gebruiken we het deden omdat het geschikt is voor dual-color imaging experimenten die in dienst GFP / pHluorin als de andere fluorofoor. We prikkelen DiD wie een 561 nm laser dan 640 nm laser (die dichter bij de excitatie piek) omdat de fluorofoor bleekmiddelen sneller bij 640 nm. Ondanks dat de 561 nm laser is op de staart van DID gepubliceerd excitatie, fluorescentie efficiënt uitgezonden. Een ander voordeel van de 561 nm laser is dat het prikkelt zowel DII en deed waardoor we dezelfde polarisatie setup voor beide sondes gebruiken. Merk op dat de oriëntatie van de fluorofoor in het membraan de uitlegging van membraan topologie beïnvloeden. Als bijvoorbeeld een fluorofoor werden georiënteerd met transitiedipolen loodrecht op het membraan vlak (in plaats van parallel of nagenoeg parallel, zoals het geval is met Dil of hoe) en niet-vlakke membraan gebieden zullen gemakkelijker gemarkeerd door de S dan wel P emissie.
We hebben ook beschreven voor isolatie en elektroporatie van runderen adrenale chromaffine cellen. De runderen chromaffin cel is een uitstekende secretory model. Het heeft de voordelen dat het gemakkelijk in kweek, in reactie op een verscheidenheid van secretogogues te onderhouden en bezit grote secretorische blaasjes die gemakkelijk worden gevisualiseerd met conventionele lichtmicroscopie. Om fluorescerende eiwitten tot expressie worden de cellen geëlektroporeerd in suspensie voorafgaand aan plating op de collageen-behandelde cultuur gerechten. In onze ervaring, expressie rendement is veel hoger met elektroporatie dan met ofwel Ca 2 +-fosfaat of Lipofectamine reagentia. Het nadeel van elektroporatie is dat het meer cellen (zo veel overleven de werkwijze) en dure commerciële reagentia. Om redenen die niet duidelijk zijn voor ons, niet elke membraan bevat deed. Bovendien, slechts een fractie van de cellen op de schaal getransfecteerd. Het vinden van cellen die zijn getransfecteerd en zijn goed gekleurd met DID kan tijdrovend zijn en daarom het optimaliseren van de voorwaarden voor het kleuren en elektroporatie is de moeite waard.
Kortom, dit eenArtikel beschrijft hoe pTIRFM wordt geïmplementeerd om de snelle en gelokaliseerde membraan vervormingen die optreden tijdens de fusie van dichte kern blaasjes bij runderen chromaffinecellen bewaken. Hoewel slechts een toepassing wordt besproken, is de techniek zeer geschikt voor de studie van andere biologische processen die veranderingen in het membraan is, zoals endocytose, cytokinese, en celmotiliteit betrekken.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek wordt ondersteund door een Nationaal Scientist Development Grant (13SDG14420049) naar AA van de American Heart Association en start-up fondsen van Wayne State University. Wij zijn dank verschuldigd aan Dr Ronald W. Holz en dr. Mary Bittner voor het verstrekken van advies over de runder-bijnier voorbereidingen en dr. Daniel Axelrod voor hulp bij de pTIRFM set-up en behulpzaam commentaar op het manuscript. Syt-1 pHluorin werd gebruikt met toestemming van Dr Gero Miesenböck (University of Oxford). GCAMP5G werd verkregen door middel van Addgene. We danken James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman en Praneeth Katrapti met hulp op het optimaliseren van de verschillende stappen van de beschreven procedures.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |