ההשתקפות הפנימית מוחלטת המבוסס על קיטוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי (pTIRFM) מאפשר זיהוי של דינמיקת קרום תא בזמן אמת. מאמר זה מתאר את היישום של pTIRFM לחקר שיפוץ קרום במהלך exocytosis המוסדר. הטכניקה היא להכליל לתהליכים אחרים בביולוגיה של תא באופן ישיר או עקיף כרוך בשינויים בצורת קרום.
כדי לקבל תובנה חדשות על הדינמיקה של exocytosis, הקבוצה שלנו מתמקדת בשינויים בצורת bilayer שומנים שחייבים להיות מוסדר דווקא בהיתוך של קרום שלפוחית ופלזמה. שינויים מהירים ומקומיים אלה מושגים על ידי אינטראקציות דינמיות בין שומנים וחלבונים מיוחדים השולטים בעקמומיות בממברנה. היעדר אינטראקציות מסוג זה לא רק תוצאות הרסניות לאיחוי שלפוחית, אבל שורה של תפקודים תאיים אחרים המעורבות בשליטה של צורת קרום. בשנים האחרונות, את זהותו של מספר החלבונים בעלי תכונות עיצוב קרום כבר נקבעה. מה שנותר חסר הוא מפת דרכים של מתי, איפה, ואיך הם מתנהגים כמו היתוך והתקדמות שחרורו תוכן.
ההבנה של האירועים המולקולריים, המאפשרים שיפוץ קרום שלנו מבחינה היסטורית הייתה מוגבלת על ידי חוסר של שיטות אנליטיות, כי הם רגישים לעקמומיות הממברנה או שיש הפתרון הזמני לטראקk שינויים מהירים. PTIRFM מספק את שני הקריטריונים האלה. אנחנו דנים כיצד pTIRFM מיושם לדמיין ולפרש, שינויי submicron מהירים בכיוון של קרום תא chromaffin בשלפוחית ליבה צפופה היתוך (DCV). תאי chromaffin אנו משתמשים מבודדים מבלוטת יותרת הכליה שור. הקרום מוכתם בצבע carbocyanine lipophilic, 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 chlorobenzenesulfonate, או עשה. עשה intercalates במישור הקרום עם אורינטציה "קבועה", ולכן הוא רגיש לקיטוב של שדה חלוף. קרום התא עשה הצבעוני הוא ברצף נרגש עם קיטובים מאונך של לייזר 561 ננומטר (p-Pol, s-POL). לייזר 488 ננומטר משמש כדי לחזות מרכיבים וזמן שלפוחית הרגע של היתוך. Exocytosis מופעל על ידי מקומי מרוססים תאים עם פתרון KCl depolarizing. ניתוח מתבצע במצב לא מקוון באמצעות תוכנה אישית בכתב כדי להבין איךשינויי עוצמת פליטה מתייחסים להתרחבות נקבובית היתוך.
הביצוע הנכון של exocytosis דורש שינויים קיצוניים בצורת bilayer קרום להיות מתוזמרים בדיוק. לפני האיחוי, כיפוף מקומי של קרום הפלזמה תחת גרגיר מתרחש, בין שאר כדי להפחית את מחסום האנרגיה לאינטראקציה של bilayers. מאוחר יותר, כקרומים למזג, אזורים של עקמומיות גבוהה נוצרים ויש התייצבו. לבסוף, קרומים התמזגו חייבים להיות כפופים בכושר הראשוני שלהם להרחבת הנקבובית ההיתוך ולאפשר תוכן שחרורו 1. מכיוון שקרומים לבד צפויים לעבור שינויים דרמטיים ומתואם כאלה, חלבונים נחוצים כדי לתווך אירועים. אבל איך הם פועלים כדי להשפיע על שינויים בטופולוגיה הקרום במהלך תהליך ההיתוך נשאר מאוד שאלה פתוחה.
מצוין במודלים חוץ גופית קיימות כדי להמחיש עקמומיות בממברנה. השימוש בEM שלילי כתם, למשל, לא היה חשוב לעיצוב מודלים מולקולריים הנוכחיים על מעשיהם של שני p הסחר העיקריroteins – synaptotagmin וdynamin (לביקורות, ראו צ'פמן 2 וHenshaw 3). רוב מבחני של exocytosis בזמן אמת אינם מזהים עקמומיות באופן ישיר. במקום זאת, עקמומיות היא להסיק ממבחנים שידווחו על קינטיקה של שחרור lumenal מטען 4-8 או שינויים באזור קרום 9-11. PTIRFM מגשר על הפער בין in vivo ו במבחנה על ידי המאפשר מדידות של שינויים במיקרומורפולוגיה קרום ישירות, בזמן אמת.
PTIRFM, במצב nonimaging, היה חלוץ ידי אקסלרוד ועמיתיו כדי למדוד את הכיוון של NPD-PE משולב בתוך קרום מודל 12. הטכניקה הייתה לאחר מכן להחיל לדמיין שינויים דינמיים בתאים חיים שכותרתו עם DiI וFM1-43 13-18. בpTIRFM, שני קיטובי שדה חלוף משמשים כדי לעורר בדיקה מוטבעת קרום ברצף: p-קיטוב (במישור של שכיחות) ו-S-קיטוב (בניצב למישור של שכיחות). לפני ההדמיה, הבדיקה – במקרה הזה, עשה – הוא הוסיף בקצרה למדיום תאי ומותר intercalate בקרום הפלזמה של התאים כדי להיחקר. באזורים שבם הקרום הוא nonparallel לcoverglass (כמו בלפרוע קרום או כניסה), האם יהיה גם nonparallel. לכן, אזורים כגון יהיו להתרגש על ידי אלומת p-Pol. קרן p-Pol פחות יעילה תלהיב עשתה באזורי קרום הבעיקר במקביל לcoverglass. תמונות יחס פיקסל לפיקסל (P / S) דיווח על הפליטה מעירור p-ו-S-Pol הרציף של האם ולכן יהיה דווקא להדגיש אזורים של עיוות בממברנה. בתאוריה, את תמונות יחס P / S רגישות אפילו זוויות קטנות של סטיית פלזמה קרום מcoverglass, עם משרעת של השינויים הצפויים על ידי סימולציות מחשב 18. תמונות P / S הן גם בלתי תלויות במרחק fluorophore ממשטח coverglass ו fluorophore המקומיריכוז. ריכוז fluorophore מקומי מסופק במקום על ידי תמונות שדיווחו על סכום פיקסל לפיקסל של פליטת P ו2 פעמים פליטת S (P +2 S). +2 מדידת S P רגישה לגיאומטריה המדויקת של הכניסה, עם כמה, שינוי קטן, או לא אפשרי. זה יכול להיות מוצג על ידי סימולציות מחשב שמעברי מודל של נקבובית היתוך מ( כלומר עם צוואר צר) מוקדם למדינה מאוחר יותר 16,18. P +2 S של שלפוחית התמזגו מצורף קרום הפלזמה באמצעות צוואר צר (ועם יותר עשה קרוב לממשק) צפוי להיות גדול יותר, למשל, מזו של שלפוחית התמזגו עם נקבוביות רחבות הרבה יותר (שבו האם נמצא בחלק הקלוש ביותר של שדה חלוף).
במאמר זה, אנו דנים כיצד pTIRFM מיושם ומנוצלת ללימוד השינויים מהירים, מקומיים בצורת קרום המתרחשים במהלך התרחבות נקבובית היתוך. בעוד שרק יישום אחד הוא באופן מפורש discussed, השיטות הן להכליל את מגוון רחב של תהליכים בתא אחרים ביולוגיים שאופן ישיר או עקיף כרוך בשיפוץ בממברנה.
TIRFM מבוסס קיטוב מזהה שינויים מהירים, submicroscopic בטופולוגיה הממברנה. יישום הטכניקה הוא פשוט יחסית, במיוחד אם אופטיקה TIRF כבר נמצא במקום. כל מה שצריך הוא צלחת רבע גל, שתי קוביות קיטוב, ותריסים על מנת להפריד בין נתיבי p-Pol ותאורת s-Pol. המיקום המדויק של רכיבים אלה על השולחן בדרך כלל מוכתב על ידי מקום פנוי.
על מנת לקבל מידע טופולוגי קרום, הבדיקה הניאון משמשת צריכה intercalate עם נטייה קבועה או ידועה. הטכניקה, כפי שתוארה במאמר זה, מניחה את השימוש של צבעי carbocyanine אבל צבעים אחרים, כגון FM1-43 14, עשויים לשמש גם. ההליך מכתים הקרום עצמו הוא פשוט. תאים בתרבית רק דורשים חשיפה קצרה מאוד (פחות מ -10 שניות) לכמות קטנה של DiI / עשתה כדי לקבל תיוג צוהל של הממברנה. הוספת עודפי צבע מובילה לaggreg פיזור אוראטס על הזכוכית שמפחיתה את איכות תמונה. תאים דוגרים מעל עם צבע מוביל לצבוע את ההפנמה שבה יש השפעות מזיקות על איכות תמונה ואולי כדאיות תא. אם תא מוכתם היטב, יהיה הבחנה ברורה בתמונות פליטת P ו-S. כפי שניתן לראות באיור 2 א, פליטת P תהיה בבהירות להדגיש אזורים של הקרום שהם אלכסוניים coverslip (כלומר הקצוות של טביעת רגל התא) ואילו עוצמת פליטת S תהיה בערך אחידה על פני טביעת התא. אם הבחנה ברורה בין P ו-S אינה נראית לעין, אז זה אפשרי כי התא הוא דבק בצורה גרועה למצע או קרום התא הוא לא בריא, והתא אינו משמש לניסויים.
המחקרים הקודמים שלנו מתארים pTIRFM מנוצלים DiI כמו חללית קרום הניאון. כאן, אנו מנצלים עשינו כי הוא מתאים לניסויי הדמיה כפול צבע שמעסיקים GFP / pHluorin כfluorophore האחר. אנו לרגש wi עשהה לייזר 561 ננומטר ולא לייזר 640 ננומטר (שהוא קרוב יותר לשיא העירור שלה), כי מלביני fluorophore במהירות רבה יותר ב640 ננומטר. למרות שליזר ננומטר 561 הוא על הזנב של עשה ספקטרום העירור פורסם של, קרינה הנפלטת ביעילות. יתרון נוסף של לייזר ננומטר 561 הוא שזה מרגש את שניהם DiI ועשה מה שמאפשר לנו להשתמש באותה התקנת קיטוב עבור שני הבדיקות. שים לב שהנטייה של fluorophore בקרום תשפיע על הפרשנות של טופולוגיה הממברנה. לדוגמא, אם fluorophore היה בכיוון עם הדיפולים המעבר שלה בניצב למישור הקרום (ולא מקביל, או כמעט במקביל, כפי שקורה עם DiI או לא), ואז אזורי קרום nonplanar יהיו בקלות רבה יותר מודגש על ידי S ולא פליטת P.
יש לנו גם תיארו טכניקות לבידוד וelectroporation של תאי chromaffin יותרת הכליה שור. תא chromaffin השור הוא ים מצויןמודל ecretory. יש לו את היתרונות של להיות קל לשמור בתרבות, מגיבה למגוון רחב של secretogogues, ובעל שלפוחית הפרשה גדולה שהם דמיינו בקלות עם מיקרוסקופ אור הקונבנציונלית. כדי לבטא חלבוני ניאון, תאי electroporated בהשעיה לפני ציפוי במנות תרבות שטופלה קולגן. מניסיוננו, יעילות ביטוי הוא הרבה יותר גבוה מאשר עם electroporation עם או Ca 2 +-phosphate או חומרים כימיים Lipofectamine. החסרון של electroporation הוא שזה דורש יותר תאים (כפי שרבים לא שרד את התהליך) וחומרים כימיים מסחריים יקרים. מסיבות שאינן ברורים לנו, לא כל קרום משלב עשה. בנוסף, רק חלק קטן של התאים בצלחת הם transfected. מציאת תאים שהם transfected והם מוכתמים גם עם לא יכולים להיות זמן רב ולכן אופטימיזציה של תנאים להכתמה וelectroporation הוא גם שווה את המאמץ.
לסיכום, זהסעיף המלחמה מתארת כיצד pTIRFM מיושם כדי לפקח על העיוותים קרום המהירה ומקומיות המתרחשות במהלך שילוב של שלפוחית ליבה צפופה בתאי chromaffin שור. אמנם רק אחד יישום נדון, הטכניקה היא אידיאלית עבור חקר תהליכים ביולוגיים אחרים הכרוכות בשינויים בצורת קרום, כולל אנדוציטוזה, cytokinesis, ותנועתיות תא.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מדען פיתוח גרנט הלאומי (13SDG14420049) ל AA מאיגוד הלב האמריקאי וקרנות הזנק מאוניברסיטת ויין סטייט. אנו חייבים תודה לד"ר רונלד W. הולץ וד"ר מרי Bittner למתן ייעוץ לגבי הכנות שור יותרת הכליה וד"ר דניאל אקסלרוד לקבלת סיוע בpTIRFM ההגדרה והערות מועילות על כתב היד. Syt-1 pHluorin היה בשימוש עם אישור של ד"ר גרו Miesenbock (אוניברסיטת אוקספורד). GCAMP5G הושג באמצעות Addgene. אנו מודים ג'יימס ט 'טיילור, Tejeshwar Rao, רחל L. Aikman, וPraneeth Katrapti עם עזרה באופטימיזציה של שלבים שונים של ההליכים שתוארו.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |