편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.
세포 외 유출의 역학에 새로운 통찰력을 얻기 위해, 우리 그룹은 정확하게 소포 및 플라즈마 세포막의 융합 동안 규제해야 지질 이중층 형태의 변화에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 신속하고 국부적 변화는 지질과 막 곡률을 제어하는 전문화 된 단백질 사이의 동적 상호 작용에 의해 달성된다. 이러한 상호 작용의 부재는 소포 융합 치명적인 결과를 가지고 있지만, 막 형상의 제어를 포함하는 다른 세포 기능의 호스트 않을 것이다. 최근, 막 – 형성 특성을 갖는 단백질의 개수의 아이덴티티가 결정되었다. 무엇 실종 유지하는 것은 언제, 어디서, 어떻게 그들이 융합 콘텐츠 릴리스 진행 역할의 로드맵이다.
막 리모델링을 활성화하는 분자 사건에 대한 우리의 이해는 역사적으로 막 곡률에 민감하거나 시간적 해상도가 TRAC 할 분석 방법의 부족에 의해 제한되었다급격한 변화를 K. PTIRFM는 이러한 기준을 모두 만족시킨다. 우리는 pTIRFM가 조밀 한 핵심 소포 (DCV) 융합 동안 크롬 친화 세포 세포막의 방향으로 신속, 서브 미크론의 변화를 시각화하고 해석하는 구현 방법에 대해 설명합니다. 우리가 사용하는 크롬 친화 세포는 소 부신에서 격리됩니다. 막은 친 지성 carbocyanine 염료, 1,1 '- 디 옥타 데실 -3,3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4 – 클로로 벤젠으로 염색하거나, DID된다. "고정"방향으로 막 비행기에서하게 인터를하고 사라져가는 필드의 편광에 따라서 구분합니다. 염색 않았다 세포막은 561 nm의 레이저 (P-POL, S-POL)의 직교 편파로 순차적으로 기쁘게 생각합니다. 488 nm의 레이저 융합의 순간 소포 성분과 시간을 시각화하는 데 사용됩니다. 세포 외 유출은 로컬 탈분극의 KCl 용액으로 세포를 관류에 의해 트리거됩니다. 분석은 어떻게했는지 이해하기 위해 사용자가 작성한 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 수행된다발광 강도의 변화는 융합 기공의 팽창과 관련이있다.
세포 외 유출의 적절한 실행을 정밀하게 조율 할 수 막 이중층 형태의 극단적 인 변화가 필요합니다. 종래 융합, 과립 하에서 세포막의 로컬 굽힘은 이중층의 상호 작용을위한 에너지 장벽을 줄이기 위해 부분적으로 발생한다. 막 병합으로 나중에 높은 곡률의 영역이 생성되고 안정화되어야한다. 마지막으로, 융합 세포막 융합 모공을 확장 및 콘텐츠 릴리스 1을 사용하려면 초기 모양에서 구부릴 수 있어야합니다. 혼자 막 같은 극적인 협조 변화를 겪을 가능성이 있기 때문에, 단백질은 이벤트를 중재 할 필요합니다. 그러나 그들이 어떻게 융합 과정에서 막 토폴로지의 변화에 영향을 미치는 역할을하는 것은 매우 의문 남아있다.
체외 모델에서 우수한 멤브레인 곡률을 시각화하기 위해 존재한다. 부정적인 얼룩 EM의 사용은, 예를 들어, 두 가지 주요 인신 매매 (P)의 행동에 대한 현재의 분자 모델을 형성에 중요했다roteins – synaptotagmin과에 dynamin은 (리뷰를 채프먼 2 Henshaw 3 참조). 세포 외 유출의 대부분의 실시간 분석이 직접 곡률을 감지하지 않습니다. 대신, 곡률 내강화물 릴리스 4-8 또는 막 면적 9-11 변화의 역학에 대한 보고서 분석에서 유추됩니다. PTIRFM 멤브레인 micromorphology의 변동에 직접, 실시간 측정을 가능하게함으로써 생체 내와 생체 외 연구에 간의 격차를.
PTIRFM는 nonimaging 모드에서, 모델 막 (12) 내에 내장 NPD-PE의 방향을 측정하는 악셀로드 및 동료에 의해 개척되었다. 이 기술은 다음 DII 및 FM1 – 43 13-18으로 표시 살아있는 세포의 역동적 인 변화를 시각화하기 위해 적용되었다. P-편광 (입사 평면)과 (입사면에 수직 인) S-편광 : pTIRFM에서,이 에바 네 센트 필드 편광 순차 막 내장 프로브를 여기 시키는데 사용. 종래 이미징 프로브 -이 경우, DID – 간단히 세포 외 배지에 첨가하고 공부 될 세포의 원형질막에 층간 삽입시킨다. 막 (멤브레인 주름 또는 들여 쓰기 등) 커버 글라스에 대한 비평이다 지역에서, 또한 평행하지 않은 것입니다 않았다. 따라서, 이러한 영역은 P-POL 빔에 의해 흥분 될 것입니다. P-POL 빔은 덜 효율적으로 대부분 커버 글라스에 평행 막 지역에서 한 흥분됩니다. 픽셀 대 픽셀 비율 이미지 (P / S), 따라서 구체적으로 막 변형의 영역을 강조 할 것입니다 DID의 연속 P-및 S-POL 여기에서 배출에 대한보고. 이론적으로, P / S 비율 이미지 민감한 컴퓨터 시뮬레이션 (18)에 의해 예측 된 변화의 진폭 커브 글라스로부터 세포막 편차, 심지어 작은 각도이다. P / S 이미지는 또한 커버 글라스의 표면으로부터 형광 거리 독립적이며 지역 형광농도. 로컬 형광 농도 대신 P 방출의 픽셀 대 픽셀 화는 2 회 S 방출 (P +2 S)에보고하는 이미지에 의해 제공된다. P +2 S 측정은 몇 가지 가능한 거의, 또는 전혀 변화, 들여 쓰기의 정확한 구조에 민감합니다. 이 컴퓨터 시뮬레이션으로 표시 할 수 나중에 상태 (16, 18)에 (좁은 목 예) 초기의 융합 기공의 모델로 전환됩니다. P 좁은 목을 통해 세포막에 부착 융합 소포의 +2 S (및 더 인터페이스 부근 DID) (훨씬 넓은 공극을 가진 융합 된 소포보다도, 예를 들어 큰 것으로 예상되는 위치 DID)는 사라져가는 필드의 가장 어두운 부분에 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 pTIRFM 구현 및 융합 기공 팽창 중에 발생하는 막 모양의 급속한 현지화 변화를 연구하기 위해 사용되는 방법에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램은 명시 적으로 디 동안scussed, 방법은 직접 또는 간접적으로 막 리모델링을 포함하는 다른 세포 생물 학적 과정의 다양한 일반화되어 있습니다.
편광 기반 TIRFM는 막 토폴로지의 급속한, 현미경적인 변화를 감지합니다. 기술을 구현 TIRF 광학이 이미 특히 경우, 상대적으로 간단합니다. 필요한 모든 것은 4 파장 판, 두 개의 편광 큐브 및 P-폴과의 폴 조명 경로를 분리하는 셔터이다. 테이블에 이러한 구성 요소의 정확한 위치는 일반적으로 사용 가능한 공간에 의해 결정됩니다.
막의 위상 정보를 획득하기 위해 사용될 형광 프로브는 고정되거나 알려진 방향으로 층간 삽입한다. 기술은,이 문서에서 설명하는 바와 같이, 이러한 FM1-43 (14)도 사용될 수있다 같은 carbocyanine 염료 그러나 다른 염료의 사용을 가정한다. 막 염색 절차 자체는 간단합니다. 배양 된 세포는 세포막의 풍부한 라벨을 얻기 위해 DID DII / 소량 만 아주 짧은 노출 (이하 10 초)이 필요합니다. 여분의 염료를 추가 광산란 aggreg로 연결이미지 품질을 감소 유리 ATES. 염료로 오버 배양 세포는 이미지 품질과 가능성이 세포 생존에 해로운 영향이 내면화를 염색하는 리드. 셀이 잘 더러워지면, P와 S 방출 이미지에 명확한 구별이있을 것이다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, P 방출 선명 S의 발광 강도는 셀 풋 프린트 위에 대략 균일 할 것 인 동안 (셀 풋 프린트의 가장자리, 즉) 커버 슬립 비스듬한 아르 멤브레인의 영역을 강조한다. P와 S 사이에 명확한 구별이 명확하지 않은 경우, 그것은 셀이 저조한 기판에 접착 또는 세포막은 건강하지 않고, 셀이 실험에 사용 가능하지 않다 것이 가능하다.
pTIRFM를 설명하는 우리의 이전 연구는 형광 막 프로브로 DII를 이용했다. 그것은 다른 형광으로 GFP / pHluorin을 사용 듀얼 컬러 이미징 실험에 적합하기 때문에 여기에서, 우리는 DID 활용합니다. 우리는 DID 위스콘신 흥분561 nm의 레이저가 아니라 (그것의 여기 피크에 가까운) 640 nm의 레이저를 토륨 때문에 640 nm에서 더 빠르게 형광 표백제. 561 nm의 레이저의 발행 여기 스펙트럼이 형광을 효율적으로 방출되는 DID의 꼬리에 있다는 사실에도 불구하고. 561 nm의 레이저의 또 다른 장점은 모두 DII을 자극하고 두 프로브 같은 편광 설정을 사용하는 밑거름 않은 것입니다. 막에서 형광의 방향이 막 토폴로지의 해석에 영향을 미칠 수 있음을주지하십시오. DII (또는 DID 경우처럼, 오히려 평행 또는 거의 평행보다) 형광 물질은 막 평면에 수직 인 그 전이 쌍극자 배향 된 경우 예를 들어, 비평면 멤브레인 영역은보다 용이 S 의해 강조 아닌 것 P 방출.
우리는 또한 소 부신 크롬 친화 세포의 분리 및 일렉트로 기술에 대해 설명했다. 소 크롬 친화 세포는 우수한 s의ecretory 모델. 그것은 분비 촉진의 다양한 반응 문화에 유지 관리가 용이되고, 그리고 쉽게 기존의 광학 현미경으로 시각화 큰 분비 소포를 소유의 이점이있다. 형광 단백질을 표현하는 세포는 이전에 콜라겐 처리 된 배양 접시에 도금에 정지에 일렉트로됩니다. 우리의 경험에서, 표현의 효율은 칼슘 + 인산 또는 리포 펙 타민 시약 어느 때보 일렉트로 훨씬 높다. 일렉트로 포 레이션의 단점은 더 많은 세포를 요구 (다양한 프로세스로 생존하지 않고) 비싼 상업적인 시약이다. 우리에게 불분명 한 이유로, 아니 모든 막은 않았다 통합. 또한, 접시에 세포의 일부만이 형질. 형질 전환하고 DID 잘 염색되는 세포를 발견하는 것은 염색과 일렉트로는 노력이 가치가있다 조건을 최적화하는 이유입니다 시간이 소요될 수 있습니다.
요약하면, 본인 rticle는 pTIRFM이 소 크롬 친화 세포의 밀도가 핵심 소포의 융합 과정에서 발생하는 신속하고 지역화 막 변형을 모니터링 할 구현 방법에 대해 설명합니다. 하나의 응용 프로그램 만이 논의되었지만, 그 기술은 이상적으로 엔도 시토 시스, 세포질 및 세포 운동성 포함한 막 형상의 변화를 포함하는 다른 생물학적 과정의 연구를 위해 적합하다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 웨인 주립 대학에서 미국 심장 협회 (American Heart Association) 및 창업 자금에서 AA로 국가 과학자 개발 그랜트 (13SDG14420049)에 의해 지원된다. 우리는 pTIRFM가 설정 및 원고에 도움이 의견에 대한 지원 소 부신 준비 및 박사 다니엘 악셀에 관한 조언을 제공 박사 로널드 W. HOLZ 박사 메리 BITTNER에게 빚을 졌네. SYT를 1 pHluorin가 함께 사용되었다 닥터 게로 Miesenbock (옥스포드 대학)의 허가. GCAMP5G는 Addgene을 얻었다. 우리는 설명 된 절차의 여러 단계를 최적화에 도움 제임스 T. 테일러, Tejeshwar 라오, 레이첼 L. Aikman 및 Praneeth Katrapti 감사합니다.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |