Polarisering baserat total intern reflektion fluorescens mikroskopi (pTIRFM) möjliggör realtidsdetektion av cellmembrandynamik. Denna artikel beskriver genomförandet av pTIRFM för studier av membran ombyggnad under reglerad exocytos. Tekniken är generaliserbart till andra processer i cellbiologi som direkt eller indirekt involverar förändringar i membranform.
För att få nya insikter om dynamiken i exocytos, fokuserar vår grupp på förändringarna i membranet form som måste noggrant angivna villkor vid fusion av vesikler och plasmamembran. Dessa snabba och lokala förändringar uppnås genom dynamiska interaktioner mellan lipider och specialiserade proteiner som styr membran krökning. Avsaknaden av sådana interaktioner skulle inte bara få förödande konsekvenser för vesikelfusion, men en mängd andra cellulära funktioner som innebär kontroll av membranform. Under senare år har identiteten av ett antal proteiner med membranformningsegenskaper bestämts. Det som återstår saknas är en färdplan för när, var och hur de agerar som fusion och innehåll frigör framsteg.
Vår förståelse av de molekylära händelser som gör att membran ombyggnad har historiskt varit begränsad av brist på analysmetoder som är känsliga för membran krökning eller har den temporala upplösningen till Track snabba förändringar. PTIRFM uppfyller båda dessa kriterier. Vi diskuterar hur pTIRFM implementeras för att visualisera och tolka snabba, förändringar submikrona i orientering kromaffina cellmembran under tät kärna vesikler (DCV) fusion. De kromaffinceller vi använder isoleras från nötkreatur binjurarna. Membranet är färgade med en lipofil karbocyaninfärgämnet, 1,1 '-dioktadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorbensensulfonat, eller gjorde. DiD interkalerar i membranplanet med en "fast"-orientering och är därför känslig för polariseringen av det evanescenta fältet. DID-färgade cellmembranet är sekventiellt glada med ortogonala polariseringar i en 561 nm laser (p-pol, s-pol). En 488 nm laser används för att visualisera vesikler beståndsdelar och tid tidpunkten för fusionen. Exocytos utlöses av lokalt perfusion celler med en depolariserande KCl-lösning. Analys utförs offline använder anpassade skrivna program för att förstå hur gjordeintensitetsförändringar utsläpps avser fusion por utvidgning.
Ett korrekt genomförande av exocytos kräver extrema förändringar i membranbiskiktet form för att vara exakt iscensatt. Före fusion, lokal böjning av plasmamembranet under granul inträffar, delvis för att minska den energibarriär för interaktion av dubbelskikt. Senare, som membran samman, områden med hög krökning genereras och måste stabiliseras. Slutligen måste sammansmälta membran böjas ut ur sin ursprungliga form för att bygga fusions por och göra det möjligt för innehållsfrigör 1. Eftersom enbart membran är osannolikt att genomgå sådana dramatiska och samordnade förändringar, proteiner är nödvändiga för att förmedla händelser. Men hur de agerar för att påverka förändringar i membrantopologin under fusionsprocessen är fortfarande väldigt mycket en öppen fråga.
Excellent in vitro-modeller finns för att visualisera membran krökning. Användning av negativa-bets EM, till exempel, har varit viktigt för att forma nuvarande molekylära modeller för åtgärder av två stora handel proteins – synaptotagmin och dynamin (för recensioner, se Chapman 2 och Henshaw 3). De flesta realtidsanalyser av exocytos inte upptäcka krökning direkt. Istället krökning utläsas analyser som rapporterar på kinetiken för lumenal last frigör 4-8 eller förändringar i membranområdet 9-11. PTIRFM överbryggar gapet mellan in vivo och in vitro-studier genom att möjliggöra direkta, realtidsmätningar av förändringar i membran Mikromorfologi.
PTIRFM, i en icke-avbildande läge, var uppfunnen av Axelrod och kollegor för att mäta riktningen på NPD-PE ingå i en modellmembran 12. Tekniken applicerades sedan för att visualisera dynamiska förändringar i levande celler märkta med Dil och FM1-43 13-18. I pTIRFM är två evanescent fält polarisationerna används för att sekventiellt excitera ett membraninbäddade prob: p-polarisering (i infallsplanet) och s-polarisation (vinkelrätt mot infallsplanet). Före bildbehandling, sonden – i det här fallet gjorde – är kortvarigt till den extracellulära mediet och får inskjuta i plasmamembran hos celler som skall studeras. I regioner där membranet är icke-parallell med täckglas (som i en membran ruffle eller indrag), det gjorde också vara icke-parallella. Därför kommer sådana regioner vara exciterbara av p-pol stråle. Den p-pol stråle kommer mindre effektivt hetsas gjorde i membranregioner som oftast parallella med coverglass. Pixel-till-pixel ratio bilder (P / S) rapportering om utsläpp från sekventiell p-och s-pol excitation av DID kommer därför att särskilt belysa områden av membran deformation. I teorin, P / S-tal bilder är känsliga för även små vinklar av plasmamembran avvikelse från coverglass, med amplituden av de förändringar förutspåtts av datorsimuleringar 18. P / S-bilder är också oberoende av fluoroforen avstånd från coverglass ytan och lokal fluoroforkoncentration. Lokal fluoroforen koncentration istället tillhandahålls av bilder som rapporterar på pixel-till-pixel summan av P-utsläpp och 2 gånger S-utsläpp (P 2 S). P 2 S mätningen är känslig för den exakta geometrin i inbuktningen, med viss, liten, eller ingen förändring möjlig. Detta kan visas genom datorsimuleringar som modell övergångar av en fusion por från en tidig (dvs. med en smal hals) till ett senare tillstånd 16,18. P 2 S av en kondenserad vesikel fäst till plasmamembranet via en smal hals (och med mer gjorde nära gränsytan) förutspås att vara större, till exempel, än den hos en kondenserad vesikel med ett mycket större porer (där gjorde är inom dimmest del av den evanescenta fältet).
I denna artikel diskuterar vi hur pTIRFM implementeras och utnyttjas för att studera snabba, lokaliserade förändringar i membranform som uppstår under fusion por utvidgning. Även om endast en ansökan är uttryckligen discussed är metoderna generaliserbar till en variation av andra cell biologiska processer som direkt eller indirekt involverar membranet remodeling.
Polarisationsoberoende based TIRFM identifierar hastiga, submikroskopiska changes i membran topologi. Genomförandet av tekniken är relativt enkelt, särskilt om TIRF optik är redan på plats. Allt som behövs är en kvartsvågsplatta, två polariserande kuber, och fönsterluckor för att åtskilja p-pol och s-pol belysningsbanor. Den exakta positionen av dessa komponenter på bordet vanligen dikteras av utrymme.
För att erhålla membran topologisk information bör den fluorescerande sond som används inskjuta med en fast eller känd orientering. Tekniken, som beskrivs i denna artikel förutsätter användning av karbocyaninfärgämnen men andra färger, t.ex. FM1-43 14, kan också användas. Färgningsförfarandet membranet självt är okomplicerad. Odlade celler kräver endast en mycket kort exponering (mindre än 10 sek) för att en liten kvantitet av Dil / gjorde ingen sprudlande märkning av membranet. Lägga överskottsfärg leder till ljusspridning aggregates på glaset som försämra bildkvaliteten. Över inkubera celler med färgämne leder till färga interna som har negativa effekter på bildkvalitet och möjligen cellernas livskraft. Om en cell är färgade väl, kommer det att finnas klar skillnad i P och S emissionsbilder. Såsom visas i fig. 2A, kommer P emissions livligt belysa områden av membranet som är täck sned (dvs kanterna på cell fotavtryck) medan intensiteten S utsläpp blir ungefär likformig över cellen fotavtryck. Om en klar skillnad mellan P och S inte är uppenbart, så är det möjligt att cellen är dåligt vidhäftade till substratet eller cellmembranet är inte hälsosamt och cellen inte används för experiment.
Våra tidigare studier som beskriver pTIRFM utnyttjas DII som den fluorescerande membran-prob. Här använder vi gjorde eftersom den är lämplig för dubbla färg imaging experiment som använder GFP / pHluorin som den andra fluoroforen. Vi excitera gjorde with ett 561 nm laser istället för 640 nm laser (som ligger närmare dess excitation topp) eftersom fluoroforen blekmedel snabbare vid 640 nm. Trots det faktum att den 561 nm laser är på svansen på DID publicerade excitationsspektrum fluorescensen effektivt avges. En annan fördel med 561 nm laser är att den väcker både Dil och gjorde det möjligt för oss att använda samma polarisering setup för båda sonderna. Observera att orienteringen av fluoroforen i membranet kommer att påverka tolkningen av membrantopologin. Till exempel, om en fluorofor var orienterade med sina övergångs dipoler vinkelrätt mot membranplanet (i stället för parallella, eller nästan parallella, vilket är fallet med Dil eller gjorde), då icke-plana membranregionerna kommer att lättare markeras av S i stället för P-utsläpp.
Vi har också beskrivit metoder för isolering och elektroporation av nötkreatur adrenal kromaffinceller. Nötkreaturs kromaffin cellen är en utmärkt secretory modell. Det har fördelarna med den är lätt att upprätthålla på kultur, som svarar på en mängd olika sekretogoger, och att besitta stora utsöndrings vesiklar som lätt visualiseras med konventionell Ijusmikroskopi. För att uttrycka fluorescerande proteiner, celler elektroporerades i suspensionen före utstrykning på kollagenbehandlade odlingsskålar. Enligt vår erfarenhet är uttryck effektivitet mycket högre med elektroporation än med antingen Ca2 +-fosfat eller Lipofectamine reagenser. Nackdelen med elektroporation är att det krävs flera celler (så många inte överlever processen) och dyra kommersiella reagens. Av skäl som är oklara för oss, innehåller inte varje membran gjorde. Dessutom används endast en bråkdel av cellerna på skålen transfekteras. Att hitta celler som är transfekterade och är färgade väl med DID kan vara tidskrävande och det är därför att optimera förutsättningarna för färgning och elektroporation är väl värt ansträngningen.
I sammanfattning, detta är enArtikel beskriver hur pTIRFM är implementerad för att övervaka de snabba och lokaliserade membran deformationer som inträffar under fusion av tät kärna vesiklar i bovina kromaffinceller. Även om endast en tillämpning diskuteras är tekniken idealiskt lämpade för studier av andra biologiska processer som involverar förändringar i membranform, däribland endocytos, cytokines, och cellernas motilitet.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av en nationell Scientist utveckling Grant (13SDG14420049) till AA från American Heart Association och nystartade fonder från Wayne State University. Vi står i tacksamhetsskuld till Dr Ronald W. Holz och Dr Mary Bittner för att ge råd om de nötkreatur adrenal förberedelser och Dr Daniel Axelrod om hjälp med pTIRFM uppsättning och hjälp kommentarer på manuskriptet. Var Syt-1 pHluorin används med tillåtelse av Dr Gero Miesenbock (universitetet i Oxford). GCAMP5G erhölls genom Addgene. Vi tackar James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman, och Praneeth Katrapti med hjälp för att optimera olika steg av de förfaranden som beskrivs.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |