Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.
Ekzositoz dinamikleri yeni bakış açıları kazanmak için, bizim grup tam vezikül ve plazma zarlarının füzyonu sırasında düzenlenmiş olması gerekir lipit katman şeklinde değişiklikler üzerinde duruluyor. Bu hızlı bölgesel değişiklikler, lipidler ve membran eğriliği kontrol özel bir protein arasındaki dinamik etkileşimleri ile elde edilir. Bu tür etkileşimlerin olmaması sadece vesikül füzyon için yıkıcı sonuçlara sahip, ancak membran şeklin kontrolü ile ilgili olduğu diğer hücresel fonksiyonların bir ev sahibi olmaz. Son yıllarda, zar-şekillendirme özellikleri olan bir dizi protein kimliği tespit edilmiştir. Ne eksik kaldığı zaman, nerede ve nasıl füzyon ve içerik serbest ilerleme olarak hareket bir yol haritasıdır.
Membran yeniden etkinleştirmek moleküler olayların anlayışımız tarihsel membran eğrilik duyarlı veya zamansal çözünürlük TRAC zorunda analitik yöntemlerin eksikliği ile sınırlı olmuşturhızlı değişikliklerin k. PTIRFM Bu kriterlerin ikisi de karşılar. Biz pTIRFM yoğun çekirdek vezikül (AEOV) füzyon sırasında kromafin hücre zarlarının yönde hızlı, submikron değişiklikleri görselleştirmek ve yorumlamak için nasıl uygulandığını tartışmak. Kullandığımız kromafin hücreler sığır adrenal bezlerinden izole edilmiştir. Zar, bir lipofilik karbosiyanin boya, 1,1 '-dioktadesil-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-klorobenzensülfonat ile boyanmış ya da olduğunu gösterdi. "Sabit" yönlendirme ile membran düzlemde intercalates yaptım ve kaybolan alanın kutuplaşma nedenle duyarlıdır. -Lekeli yaptım hücre zarı bir 561 nm lazer (p-pol, s-pol) ortogonal polarizasyonlar sıralı heyecanlı. Bir 488 nm lazer füzyon moment vezikül bileşenleri ve zamanı göstermek için kullanılır. Ekzositoz yerel olarak depolarize edici KCI çözeltisi ile perfüze hücreler tarafından tetiklenir. Analiz nasıl yaptığını anlamak için özel yazılmış yazılımını kullanarak çevrimdışı yapılıremisyon yoğunluğu değişiklikler füzyon gözenek genişlemesi ile ilgilidir.
Ekzositoz uygun yürütülmesine tam orkestra için zar bilayeri şeklinde aşırı değişiklikler gerektirir. Önceki füzyon, granül altında plazma zarının lokal bükülme ikili katmandan etkileşimi için enerji bariyerini azaltmak için kısmen oluşur. Zarlar daha sonra birleştirme gibi, yüksek bir eğrilik alanları oluşturulur ve stabil olması gerekir. Son olarak, kaynaşmış membranlar füzyon gözenek genişletmek ve içerik salınımını 1 etkinleştirmek için onların ilk eğilebilir gerekir. Tek başına zarlar dramatik ve koordine değişikliklere olası olduğu için, proteinler olaylara aracılık için gereklidir. Ama nasıl füzyon sürecinde membran topoloji değişiklikleri etkilemek için hareket çok açık bir soru kalır.
In vitro modellerde iyi membran eğrilik görselleştirmek için vardır. Negatif leke EM kullanımı, örneğin, iki büyük kaçakçılık p eylemler için geçerli moleküler modelleri şekillendirmek için önemli olmuşturroteins – synaptotagmin ve Dynamin (değerlendirmeleri için, Chapman 2 ve Henshaw 3). Ekzositoz çoğu gerçek-zamanlı tahlilleri doğrudan eğrilik tespit yok. Bunun yerine, eğrilik lümene ilişkin yük serbest 4-8 ya da zar bölgesinde 9-11 değişim kinetiği deneyleri rapor anlaşılmaktadır. PTIRFM membran mikroskobik değişikliklerin doğrudan, gerçek zamanlı ölçümler sağlayarak in vivo ve in vitro çalışmalar arasındaki köprü.
PTIRFM, bir nonimaging modunda, bir model membran 12 içerisine dahil NPD-PE yönünü ölçmek için Axelrod ve arkadaşları tarafından öncülük edilmiştir. Bu teknik, daha sonra DII ve FM1-43 13-18 etiketli canlı hücrelerde dinamik değişimleri görselleştirmek için uygulanmıştır. P-polarizasyon (insidans düzlemi içinde) ve (yansıma düzlemine dik) s-polarizasyon: pTIRFM olarak, iki alan polarizasyonlar kaybolan bir sekans, bir zar-gömülü prob uyarmak için kullanılır. Önceki görüntüleme için, prob – bu durumda, yaptı – kısa bir süre için, hücre dışı ortama ilave edilir ve incelenmesi gereken hücrelerin plazma zarlarında enterkale bırakılır. Membran (zar fırfır veya çentiğe gibi) coverglass için paralel olmayan olduğu bölgelerde, aynı zamanda paralel olmayan olacaktır yaptı. Bu nedenle, bu bölgeler, p-pol ışını ile uyarılabilir olacaktır. P-pol ışın daha az etkili çoğunlukla coverglass paralel olan membran bölgelerde yaptım heyecanlandıracak. Piksel-piksel oranı görüntüleri (P / S), bu nedenle, özellikle membran deformasyon bölgeleri vurgulamak olacaktır yaptım sıralı p-ve s-pol uyarma gelen emisyon raporlama. Teorik olarak, P / S oranı görüntüleri hassas olan bilgisayar simülasyonları 18 öngördüğü değişikliklerin genliği ile coverglass plazma zarı sapma, hatta küçük açılarla. P / S görüntüleri de coverglass yüzeyinden fluoroforun mesafe bağımsız ve Yerel Fluoroforkonsantrasyonu. Yerel florofor konsantrasyon yerine P emisyon piksel-piksel toplamı ve 2 kez S emisyon (P +2 S) rapor görüntüleri ile sağlanmaktadır. P 2 S ölçüm bazı mümkün az ya da hiç bir değişiklik ile, girinti tam geometrisi duyarlıdır. Bu bilgisayar simülasyonları ile gösterilebilir ki bir sonraki durumuna 16,18 (a dar boyunlu yani) erken bir füzyon gözenek modeli geçişler. P, bir dar boyunlu ile plazma zarına bağlanmış bir kaynaşık vesikülün 2 S (ve daha arayüze kapattı mı) (daha geniş bir gözenek ile kaynaşmış bir vezikül daha, örneğin, daha büyük olduğu tahmin edilmektedir burada yaptım) yiten alanın dimmest parçası içinde.
Bu yazıda, pTIRFM hayata ve füzyon gözenek genişlemesi sırasında meydana gelen membran şeklinde hızlı, lokalize değişiklikleri incelemek için kullanılır nasıl tartışacağız. Sadece bir uygulama açıkça di ikenscussed, yöntem doğrudan veya dolaylı olarak zar yeniden dahil diğer hücre biyolojik süreçlerin çeşitli genellenebilir bulunmaktadır.
Polarizasyon tabanlı TIRFM membran topolojisinde hızlı, mikroskopik değişiklikleri algılar. Tekniği uygulayarak TIRF optik zaten yerinde, özellikle nispeten basittir. Gerekli tüm çeyrek dalga plakası, iki polarize küpler, ve p-pol ve s-pol aydınlatma yolları ayırmak için kepenkleri olduğunu. Masaya bu bileşenlerin kesin konumu, genellikle mevcut olan yer ile belirlenir.
Membran topolojik bilgi elde etmek amacıyla, kullanılan floresan prob, bir sabit ya da bilinen bir yönlendirme ile enterkale gerekir. Bu teknik, bu makalede anlatıldığı gibi, bu tür FM1-43 14 da kullanılabilir edilebilir karbosiyanin boya ancak diğer boyaların kullanılmasını varsayar. Zar, boyama işlemi kendisi basittir. Kültürlenmiş hücreler, canlı bir zarın elde edilmesi için etiketleme mi DII / 'küçük bir miktar için sadece çok kısa bir poz (10 saniyeden az) gerektirir. Fazla boya ekleme ışık saçılım aggreg yol açargörüntü kalitesini düşürecektir camına ates. Boya ile Over-hücrelerinin kuluçkalanması görüntü kalitesi ve muhtemelen hücre canlılığı üzerinde zararlı etkileri vardır içselleştirme boya yol açar. Bir hücre de lekeli ise, P ve S emisyon görüntülerde net bir ayrım olacaktır. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, P emisyon canlı S emisyon yoğunluğu hücre ayak izi üzerinde kabaca homojen olacak ise (hücre ayak izi kenarlarında örneğin) lamel eğik olan membran alanları vurgular. P ve S arasında net bir ayrım belirgin değilse, o zaman hücre kötü alt-tabakaya yapıştırılmış ya da hücre zarı sağlıklı değildir ve hücre deneyleri için kullanılmaz, olanaklıdır.
PTIRFM açıklayan önceki çalışmalar floresan membran sensörü olarak dII kullanılmaktadır. Bu diğer flüorofor GFP / pHluorin istihdam çift renkli görüntüleme deneyleri için uygundur çünkü burada, yaptığımız kullanmaktadır. Yaptığımız wi heyecanlandırmakBir 561 nm lazer yerine (kendi uyarma zirveye yakın) 640 nm lazer inci çünkü 640 nm daha hızlı flüoroforun beyazlatıcılar. 561 nm lazer yayınlanmış uyarım spektrumu, floresan verimli yayılan muydunuz kuyruk olduğu gerçeğine rağmen. 561 nm lazer diğer avantajı hem dII heyecanlandıran ve hem de problar için aynı polarizasyon ayarlarını kullanmak için bize sağlayan olmasıdır. Zardaki fluorofor oryantasyon zar topoloji yorumlanmasını etkileyecek unutmayın. (DII ile mi ya da olduğu gibi, daha çok paralel, ya da neredeyse paralel bir yerine) bir florofor membran düzlemine dik olan geçiş dipoller ile oryante edilmiştir, örneğin, daha sonra düzlemsel olmayan zar bölgelerde daha kolay bir şekilde S ile vurgulanır yerine olacak P emisyon.
Ayrıca, sığır adrenal kromafin hücrelerinin izolasyonu ve elektroporasyon teknikleri tarif eder. Sığır kromafin hücre mükemmel secretory modeli. Bu salgılatıcı çeşitli duyarlı kültür içinde bakımı kolay olan ve hali hazırda geleneksel ışık mikroskopisi ile görselleştirildiği büyük salgı vezikülleri sahip olma avantajlarına sahiptir. Floresan proteinleri ifade etmek için, hücreler önce kollajen ile muamele edilmiş kültür çanakları üzerinde kaplama süspansiyon içinde elektroporate edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, ifade verimliliği Ca 2 +-fosfat veya Lipofektamin reaktifleri ile ya daha elektroporasyon ile daha yüksektir. Elektroporasyon dezavantajı daha fazla hücre gerektirir (birçok olarak süreci hayatta yok) ve pahalı ticari reaktifler olmasıdır. Bizim için belirsiz nedenlerden dolayı, her zar yaptım içermektedir. Buna ek olarak, tabağına hücrelerin yalnızca bir kısmını transfekte edilir. Transfekte olan yaptım ve iyi lekeli hücrelerin bulma boyama ve elektroporasyon çabaya değer için koşulları optimize neden olduğu zaman alıcı olabilir.
Özet olarak, burticle pTIRFM sığır chromaffin hücreleri yoğun çekirdek veziküllerin füzyonu sırasında meydana hızlı ve lokalize membran deformasyonları izlemek için nasıl uygulandığını açıklar. Sadece bir uygulama yer almaktadır, ancak, teknik ideal endositoz, sitokinez ve hücre hareketi gibi zar şekil değişiklikleri, içeren diğer biyolojik süreçlerin çalışma için uygundur.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma Wayne State Üniversitesi'nden Amerikan Kalp Derneği ve start-up fonlarından AA Ulusal Bilim Geliştirme Grant (13SDG14420049) tarafından desteklenmektedir. Biz pTIRFM set-up ve yazının yararlı yorumlarla yardım için büyükbaş adrenal hazırlıkları ve Dr Daniel Axelrod konusunda tavsiye sağlamak için Dr Ronald W. Holz ve Dr Mary Bittner borçluyuz. Syt-1 pHluorin kullanıldı Dr Gero Miesenböck (Oxford Üniversitesi) izni. GCAMP5G Addgene yoluyla elde edilmiştir. Biz açıklanan prosedürlerin çeşitli adımlar optimize yardımı ile James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman ve Praneeth Katrapti teşekkür ederim.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |