Summary
二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する。
Abstract
代替的なバイオエネルギー資源としてのリグノセルロース系バイオマスの使用を容易にするために、生物学的変換プロセス中、前処理工程は、細胞壁炭水化物のアクセシビリティを増大させる、植物細胞壁の構造を開くために必要とされる。リグニンは、多くの細胞壁中に存在するポリフェノールの種類の材料は、アクセス酵素ために重要な障害となることが知られている。植物の構造的完全性と防御システムと干渉しないレベルまでリグニン含量の減少は、バイオエタノール生産のコストを削減するための貴重なステップとなる可能性があります。本研究では、遺伝的に二本鎖RNA干渉法を介してリグニン生合成関連遺伝子の一つ、シンナモイル-CoAレダクターゼ（ZmCCR1）をダウンレギュレートしている。 ZmCCR1_RNAi構築物は、粒子ボンバードメント法を用いてトウモロコシゲノムに組み込まれた。トランスジェニックトウモロコシ植物ではない野生型対照植物と比較して正常に生育トランスジェニック植物の葉の中間リブに褐色着色の表示を除いて、バイオマス成長又は防御機構でterfering殻、茎。顕微鏡分析は、組織学的アッセイと組み合わせて、リーフ厚壁繊維が間引かれたが、他の主要な血管系部品の構造及びサイズは変化しなかったことを明らかにした。トランスジェニックトウモロコシにおけるリグニン含量が7から8.7パーセント減少した、結晶セルロース、リグニン含量を減少に応じて増加し、ヘミセルロースは不変のままであった。分析は、炭素の流れは、セルロース生合成にリグニン生合成からシフトされているかもしれないことを示すことができる。この記事では、RNAi技術を介してトウモロコシのリグニン含量をダウンレギュレートするために使用される手順の輪郭を描く、および細胞壁の組成は、細胞壁の構造上の修飾の効果を検証するために使用される分析。
Introduction
リグノセルロース系バイオマスからのバイオ燃料の生産は、米国の1年に現在の豊かさに、農業と林業残渣の持続可能な収穫、食品や動物飼料の生産のために使用される耕地に直接競合しない能力の場合には非常に望ましい。しかし、現在、米国で発生したバイオ燃料の主な情報源であるトウモロコシの穀物とは異なり、リグノセルロース材料が大幅に分解するより複雑で困難である。長鎖炭水化物、セルロースおよびヘミセルロース、リグノセルロース材料の発酵中の糖の主な供給源であり、植物細胞壁の多種類のリグニンを含有し、病原体の攻撃に対する強度、防御を提供するフェニルプロパノイドポリマー、および疎水性に加えて、細胞壁である。植物の成長と生存に必要な一方で、リグニンはまた、セルロースとhemicelluの成功酵素変換に大きな障害を提示可溶性糖に負け。高リグニン含量を有する材料は、一般に、以下（生物学的変換経路を介して）、バイオ燃料および加工特性および製品の品質に負の影響に起因する紙パルプ産業の両方にとって望ましい材料である。したがって、作物構造強度および防衛システムと干渉しないレベルでのリグニンの削減のための植物材料の遺伝子操作は、リグノセルロースバイオ燃料や紙パルプ産業の両方の製造コストの削減のために重要である可能性があります。
メイズ（ トウモロコシ ）において、リグニンは共有結合フェルラ酸及びdiferulateブリッジ2を介して一次細胞壁中のヘミセルロースに架橋されている。リグニン - ヘミセルロース複合体は、二次細胞壁の完全性および強度を付与する複合マトリックスを形成する、水素結合を介してセルロースミクロフィブリルに結合する。植物細胞壁の機械的強度は、主にリチウムのタイプによって決定されるgninサブユニット3-5。これまでの研究では、リグニンサブユニットの割合を変更すると、酵素消化率6月11日には明確な傾向を示さなかった。しかしながら、リグニン含量の減少は、一般的にコンバージョン12,13の改善を示し、エンドセルラーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ-グルコシダーゼ14を含む加水分解酵素により植物材料の消化率を増加させるための鍵であってもよい。
転写産物の発現レベルを調節する遺伝子操作は、広範囲の作物の形質を改善するために行われている。アンチセンス15および16共抑制技術など高度な技術が、ダウンレギュレーション標的遺伝子の効果的な可能にする。完全な遺伝子ノックアウトはまた、ヘアピン構造17を有するイントロンスプライシングRNAをコードする遺伝子構築物を用いて達成された。さらに、二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術、 すなわち 、強力で効果的な遺伝子発現メディア標的転写産物の分解または翻訳抑制のいずれかによって動作する器は、標的mRNAの18抑制効果の広範囲を誘導する強力な手段を提供する。遺伝子サイレンシング技術はいくつかの限界を示している。これらの技術は、正確に転写レベルを調節していない、それは他の相同な遺伝子上の予想外の消音効果を引き起こす可能性があります。
この方法では、dsRNAiトウモロコシゲノムに構築物を運ぶために粒子ボンバードメントを用いた。今日まで、植物種の広大な配列が正常に粒子ボンバードメント、 アグロバクテリウム媒介形質転換、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション法を用いて形質転換されている。それが最も効率的であるため、トウモロコシの遺伝的形質転換では、パーティクルボンバードメント法は、すべての他の方法よりも有利である。粒子衝突は、細菌に依存しないので、この方法は、このような遺伝子の遺伝子、種の大きさやなどの生物学的制約のないゲンテン、または植物の遺伝子型。物理的な導入遺伝子送達系は、高い形質転換効率が19で葉緑体への植物のゲノムに、ある場合に導入される高分子量のDNAおよび複数の遺伝子を可能にする。葉の中間リブの血管系におけるリグニンの減少は、サンプルの地形や組成を調べるために有益である走査電子顕微鏡（SEM）を介して可視化することができる。
トウモロコシ植物では、シンナモイル-CoA還元酵素の2（ZmCCR1：X98083とZmCCR2：Y15069）の遺伝子はトウモロコシゲノム20で発見された。シンナモイル-CoA還元酵素は、シンナミルアルデヒドにヒドロキシシン-CoAエステルへの変換を触媒する。我々は、遺伝子がすべての木質化組織で発現されるので、この酵素をダウンレギュレートするZmCCR1遺伝子を選んだ。配列があるように見えたので、ZmCCR1遺伝子の3 '末端の523ヌクレオチドはdsRNAi構築物のために選択したZmCCR2のものと比較してより多様。このように、dsRNAi構築物は、正確に21サイレンオフターゲット回避のみZmCCR1に結合する。 ZmCCR1_RNAi構築物は、緑色組織特異的プロモーター、リブロース1,5 -ビスリ ン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ルビスコ）を含む細胞質発現系ImpactVector1.1タグ（IV 1.1）中に操作した。
dsRNAiがトランスジェニック植物に構築物の効果を研究するために、リグニン含量を定量した。クラソン（酸不溶性）リグニン測定は、リグニン22の一部を可溶化酸性デタージェントリグニン定量法と比較して、より正確であることが知られている。そのため、クラソンリグニンは、トランスジェニックトウモロコシの茎で測定した。この手順では、水溶性の単糖類への23のポリマー炭水化物を変換する二段階の酸加水分解からなる。加水分解されたバイオマスは、酸可溶性および不溶性materiに分画したALSと酸不溶性リグニンはこれまでの研究23,24に従って測定した。理想的には、リグニン分析の結果に干渉する可能性可溶性物質を除去するため、およびリグニン残渣後の加水分解燃焼残留物中に存在する任意の灰分を考慮するために、従来の加水分解工程に水及びエタノールで抽出を含むべきである。これらのステップがなければ、サンプルのリグニン含量を人為的に膨張させることができた。フル方法は、しかし、我々の実験のために我々が原因でテストに利用可能な材料の少量にこれらのステップの両方を実行することができませんでした、ここで提示されている
二つの他の細胞壁成分、セルロース及びヘミセルロースはリグニンのダウンレギュレートトランスジェニックトウモロコシ系統において分析した。 CoAリガーゼ（4CL）26、又はシンナミルaは：これは、トランスジェニック植物は、それらのいずれかのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）25と 、4 -クマレートにおいてダウンレギュレートされていることが報告されているlcoholデヒドロゲナーゼ（CAD）27、他の細胞壁の構造成分の増加を示す。我々の研究における最初のステップとして、結晶セルロースをアップダグラフ法28を用いて測定した。この方法は、もともとセルロース分解細菌および真菌の多数のセルロースの決定のために考案された。ヘミセルロース、リグニン、およびxylosansを取り除くために簡単に説明すると、粉砕されたトウモロコシストックをアップダグラフ試薬（水：硝酸酢酸）で処理した。結晶セルロースを完全にH 2 SO 4を添加することによりSaeman加水分解を介してグルコースに加水分解した。結晶セルロースは、その後、比色アンスロン法29を用いてアッセイした。ヘミセルロースの内容が変更されたかどうかを確認するために、粉砕された茎から単糖抽出物は、トリフルオロ酢酸を用いて加水分解アルジトールアセテート法を用いて誘導体化した後、ガスクロマトグラフィー（GC）によって分析した30。結晶セル画のための詳細な手順luloseコンテンツやマトリックス多糖組成分析はフォスターらに記載されている。（2010）31。
ここでは、バイオ燃料の発酵性糖にトウモロコシリグノセルロース系バイオマスの加速解体のためのRNAi技術、粒子衝撃の変換、およびリグニン分析によってトウモロコシにおけるダウンレギュレーションリグニンのために使用される手順について説明します。
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Protocol
1。ZmCCR1のダウンレギュレーションに使用dsRNAi構築物の調製
- dsRNAiノックアウトするZmCCR1遺伝子を構築するために必要な制限酵素部位を含む設計遺伝子特異的プライマー。二つのプライマーセットは、ZmCCR1 cDNAの2フラグメントセグメントを増幅するために設計されました。1271ヌクレオチド748から523塩基対の断片、および1271ヌクレオチド986から285塩基対の断片ZmCCR1 cDNAはアリゾナゲノム研究所（AGI）から提供された。詳細については、 図1に記載されている。
- ZmCCR1_748F_BglIIプライマー（5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 '）およびZmCCR1_1271R_NcoI（5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'）を用いてZmCCR1 cDNA鋳型からのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって大断片を増幅する。プライマーZmCCR1_986F_BglII（5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 '）およびZmCCR1_1271R_SacI（5Rを使用してより小さな断片（285塩基対）を増幅17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 '）。
- 個別に製造者の指示に従って、pGEM-T Easyにフラグメントを連結する。
- 個々の形質転換体からミニプレッププラスミドDNAの単離を行うこと、をpGEM-Tを含む各々は、市販のミニプレッププラスミドキットを用いて構築する。
- 両方のダイジェストをBglII及びNcoIの両方とをpGEM-T :: ZmCCR1（523 BP）とImpactVector（IV）-1.1（細胞質発現ベクター）。
- 消化ゲル精製IV-1.1に大型の消化ゲル精製ZmCCR1断片 （523塩基対）を連結する。
- IV-1.1 :: ZmCCR1（523 bp）の中に小断片を挿入するためにBglII及びSacIで両方とをpGEM-T :: ZmCCR1（285 BP）およびIV-1.1 :: ZmCCR1（523塩基対）のダイジェスト。
- 消化ゲル精製IV-1.1に小さな消化されたゲル精製ZmCCR1断片 （285塩基対）を連結する:: ZmCCR1（523 BP）。
- 523 bpおよび285 bpのフラグメンテーションの両方のクローンを作成する逆方向反復断片の途中で238 bpのスペーサー（ 図1を参照）で285 bpの逆方向反復配列を有するZmCCR1 RNAi構築物にするのIV-1.1へのTS、。
- これは、 大腸菌（E.coli）中に構築し、それらを成長させ、トウモロコシ形質転換のための十分なプラスミドDNAを得るために、ミディプレッププラスミドDNAのサイズ分離を行う移す。
2。遺伝子形質転換トウモロコシ
- タングステン粒子の調製
- 1.5mlチューブにタングステンビーズ60mgの（M10）を配置し、2分間ボルテックスすることにより、70％エタノール1mlで洗浄する。 23℃で10分間インキュベートした後、2分間18894×gで遠心分離し、上澄みを捨てる。
- 100％エタノール1mlで3回洗浄、2分間遠心し、上清を捨てる。 60 mg / mlのに微粒子濃度をもたらすために、無菌の50％グリセロールの1ミリリットルを追加します。
- 砲撃のためのDNAの調製
- PL1.5mlチューブに50％グリセロールで調製したタングステンビーズを50μlの（3 mg）をエース。 IV-1.1の5μL（1μgの）:: ZmCCR1 RNAiのプラスミドDNAを、2.5 M 塩化カルシウムを50μl、および0.1Mスペルミジンの20を添加する。上で簡単に試薬を添加するたび渦。
- ボルテックス30秒18894×gで、タングステンビーズ-DNA混合簡単に遠心分離。上清を捨て、70％エタノール140μlにペレットを懸濁します。液体を除去し、廃棄します。 100％エタノールを140μLを加える。液体を除去し、廃棄します。
- 100％エタノールの48を添加する。すぐに使用したり、衝撃に先立って、最大4時間氷上で保存する。
- 衝撃
- 32（osmotiumなど）は、少なくとも4時間前に衝撃をN6OSMメディアを含む100ミリメートルペトリ皿の中央に（アイオワ州立大学のトウモロコシ形質転換のセンターから提供された）3-5センチ、直径のHi-II胚形成トウモロコシカルスを置きます。
- た準備メーカーの指示33に従ってE PSD-1000/He粒子送達デバイス。
- 70％エタノールでチャンバ壁を殺菌。無菌保持キャップに無菌650 PSIのラプチャーディスクをロードします。マクロキャリアーの表面にM10-DNA溶液5-6μLを広げ、乾燥簡潔に。ロード·マクロキャリアーおよびマイクロキャリア発射アセンブリに画面を停止する。
- 停止画面（L2 = 6 CM）と近いドアから選択された距離でチャンバ内のマイクロキャリア打ち上げアセンブリおよびトウモロコシカルスを置きます。ワイヤメッシュスクリーンに対して27 psiを真空中で加速する。
- 破裂板が破裂し、ヘリウム圧力計がゼロになるまで、発射ボタンを押してください。発射ボタンを離します。
- 27℃の暗所での16時間N6OSM（浸透培地）32を含むペトリ皿に砲撃カルスをインキュベート私は約10個にカルスを解除し、ペトリ皿にN6E（カルス誘導培地）32に転送し、5日間インキュベートN 27°Cで暗い。
- 選択
- N6E上の5日後、N6S培地（選択培地）32上にカルスを移す。サブカルチャー選択培地上のすべてのカルスカルス構造を乱すことなく、8〜12週ごとに30日間。
- 約8〜10週間後、白の急成長しているセクターは非増殖し、部分的に壊死した母カルスから成長します。白い急成長している組織を切除し、新鮮な選択培地（N6S）32にそれらを継代培養し、上記のようにインキュベートし続けています。
- 再生
- 再生培地32に白と急速に成長し、胚カルスを移し、1週間、上記のようにインキュベートする。 25〜27℃で16時間の昼光と8時間の暗黒の時代に再生胚形成カルスを切り替える
- 3〜4週間後にガラス試験管内発根培地32に再生芽を転送、上記のようにインキュベートし続けています。かなりの時ROOT開発は土壌と4 "ポットに苗木を移植して、水道の蛇口の下に慎重に根を洗い、表示されます。しっとり保つためにビニール袋に鉢をカバーしています。 2日後には小さな穴ビニール袋を作る。 5-6日後にビニール袋を取り外します。他の5〜6日間、上記のようにインキュベートし続けています。
- 温室
- 土を18 "ポットに苗を移し、完全な夏の日差しや温室光の中で維持する。最初のシードがT 1世代に属しながら、初期再生された植物は、T 0と呼ばれます。
3。組織学的アッセイ
- 10％中性緩衝ホルマリン5mlにトウモロコシの葉半ば肋骨を修正します。
- プロセスは、真空は、組織のプロセッサを使用して、組織プロセッサのパラフィンで浸潤する。
- HistoCentre III埋め込みステーションを使用してパラフィンに組織を埋め込む。
- エッジから余分なパラフィンを除去一度圏ksとが冷却される。
- ミクロトームを用いてミクロトームで4-5ミクロンの切片サンプル。
- 2月24日時間56℃のインキュベーター内で顕微鏡スライドとドライにセクションを配置。のセクションが完全にスライドに接着されていることを確認します。
- 23℃で5分間のキシレン2変化脱パラフィン切片
- 水和物は、2分間の100％エタノールを2回交換し、23℃で2分間、95％エタノールの2つの変更を介してスライドする
- 2分間水道水の流水中でのセクションを洗浄します。
- 1〜2分間、0.05％トルイジンブルーOで染色し、蒸留H 2 Oを用いて簡単にすすぐ
- 光学顕微鏡とイマージョンオイルと可視化した試料にカバーガラスを配置します。
- 電子顕微鏡（SEM）を走査
- 4％グルタルアルデヒド中で断面したトウモロコシの葉の中間リブを修正し、1〜2時間4℃で0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）。
- 簡単に説明すると、バッファ内のサンプルをすすぎ、それらが中で脱水10分間、3回ごとの階調と100％エタノールで10〜15分間、エタノール系列（25％、50％、75％、95％）。
- 過渡的な流体として液体二酸化炭素を使用して、臨界点乾燥機中で脱水断面にトウモロコシの葉の中間リブを乾燥させる。
- 高真空炭素タブを使用してアルミニウムのスタブ上で乾燥させた試料をマウントする
- コートトウモロコシの葉の中間リブはアルゴンガスでパージしたスパッターコーター中に金（約20nm厚）とアルミニウムスタブ上に取り付けられている。
- JEOL JSM-6400V（六ホウ化ランタン型電子エミッタ）、走査型電子顕微鏡でのコーティングサンプルを調べます。
- デジタル画像は、分析Proソフトウェア（バージョン3.2）を使用して描かれた。
4。クラソンリグニン測定
- 2ミリメートルスクリーンを通して粉砕機サンプル。
- 各サンプルの水分含有量を決定し、値を記録する水分計を使用する。
- 〜各サンプルの1.5グラムを秤量し、質量を記録する。 E自動化された溶剤抽出（抽出あたり3サイクル、サイクルあたり〜14分）、またはソックスレー装置（抽出あたり8時間）のいずれかを使用して第二の抽出のためにエタノールが続く最初の抽出のために水を使用したサンプルXTRACT。 （注：このステップでは、見かけのクラソンリグニン含有量を増加させる、酸加水分解中に凝縮し、正確なリグニン測定を妨害することができます抽出物を除去します。）
- 彼らはデシケーター中で冷却し、再度比較検討することができ、その後、45℃で一晩抽出した試料を乾燥させる。
- 30℃にインキュベーターを設定（サンプルあたり三連を推奨）スクリュートップ高圧チューブにそれぞれ乾燥、抽出されたサンプルの0.3グラムを測定し、最も近い0.1 mgの重量を記録します。各圧力チューブに72％のH 2の3ミリリットルのSO 4を追加します。
- ガラスやテフロン攪拌棒を使用してサンプルを混ぜる。水はインキュベーション後に追加されるまで、チューブ内の撹拌棒のままにしておきます。
- インキュベーター内でバイアルを置きSE30°Cまでtおよび60分間150 rpmで。 1時間後に4％に酸濃度を希釈し、攪拌棒で混合するの脱イオン水84ミリリットルを追加します。喫水線上のバイアルの側面にサンプルを大量に残してしないように注意してください。
- しっかりとすべてのバイアルに栓をシールし、メタルラックや大きなビーカーに入れます。 1時間の液体滅菌サイクルを用いて121℃でオートクレーブ。彼らが開く前に室温まで冷却することができます。
- 少なくとも4時間、575℃で炉内でフィルタリングるつぼをあらかじめ灰。るつぼは、少なくとも1時間デシケーター中で冷却してください。
- 真空は、るつぼを確保するためにゴム製のアダプタを使用して、別個の坩堝を介して各チューブから溶液を濾過する。チューブから残りの粒子を洗浄し、脱イオン水を使用しています。
- 4時間の最小、105℃でリグニン残基を乾燥させます。ドライるつぼと残留物の重量を記録する。
- 575°Cを使用した場合は、事前に火災ブンゼンバーナーの上のサンプルがそこには煙や灰がなく、その後24時間、炉内に配置するか、プログラム可能な炉を用いた場合、灰をPREおよび次のプログラムを使用していないまで。
- 105℃の室温から上昇し、12分間保持する。
- 10℃/分で250℃まで上昇し、30分間保持する。
- 20℃/分で575℃まで上昇し、少なくとも180分間保持する。
- 炉からるつぼを取り出して、デシケーター中で冷却する。るつぼと灰を重量を量る。
- 以下の式を用いて、酸不溶性残留物を計算
あらかじめ抽出されたバイオマスのM PRE =ミサ
ポスト抽出バイオマスのM POST =ミサ
バイアルに加え、抽出バイオマスのM VIAL =ミサ
るつぼとリグニンの残油のM 残基が =ミサUE
るつぼと灰のM ASH =ミサ
抽出される前のバイオマスのMC =含水率、総重量ベース
5。炭水化物分析
- 細胞壁炭水化物フォスターらに基づいて分析しています。（2010）プロトコル31を実行します。簡単に説明すると、凍結乾燥した植物材料からアルコール不溶性残留物を準備します。その後、トリフルオロ酢酸で材料を加水分解し、それらに対応するアルジトールアセテートに可溶化された単糖誘導体と一致する。四重極質量分析計に接続されたガスクロマトグラフィー（GC）により、これらの揮発性誘導体を分析する。
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Representative Results
我々は、RNAiを介したトウモロコシ植物におけるリグニン含量の減少を示した。粒子衝撃形質転換法は、約30％のtrnasformation効率が得られた。 ZmCCR1の遺伝子サイレンシングは、一貫してT0-T2世代で観察された。リグニン減少トランスジェニックは、リーフ半ばリブ、殻、茎に褐色の表示を除いて野生型トウモロコシ植物と同じように成長した。組織学的なアッセイは、突然変異系統は、トウモロコシの葉の中間リブ18で厚壁繊維の細胞壁の厚さの有意な減少を示すことが示されている。セル壁の厚さの減少にもかかわらず、木部容器、師部、及び鞘細胞を含む他の主要血管系の構造は野生型対照（ 図2A）18と比較して違いを示さなかった。これは私が茎に水輸送、栄養素の転送、または機械的強度のどちらかには有害な影響がないことを意味しますN ZmCCR1_RNAi変異株。
リグニン含量は、測定linginクラソンを用いて定量した。 図3は、野生型トウモロコシとZmCCR1_RNAiトランスジェニック系統（T1）中の酸不溶性クラソンリグニン（G / kgのCON茎葉）の量を示しています。三つのトランスジェニック系統から（1c-4、-5、及び-6）は、野生型トウモロコシ植物18のそれと比較した（それぞれ8.1％、7.0％、8.7％）、統計的に有意なリグニン減少を示した。炭素の流れが壁炭水化物の生合成経路をセルにリグニン生合成経路から移動したかどうかを判断するには、セルロースをアップダグラフ法により分析した。 図3（a）は、2 ZmCCR1_RNAi突然変異系統（1B-6および1C-6）は結晶性の有意な増加のレベルを含んでいたことを示すセルロース（1.5と1.8はそれぞれ倍）18。ヘミセルロース含有量も分析した。 図4Bは 4つの主なヘミセルロース成分（量を示しarabionose、キシロース、ガラクトース、およびグルコース）。 4炭水化物基はいずれも突然変異系統18の変化は認められなかった。
図1 ZmCCR1 PRbcS1 のダウンレギュレーションのためのdsRNAiのプラスミド構築のためのクローニング戦略：リブロース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター菊キクラマから。 T-RbcS1： キク科キクからのリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小単位のターミネータ。この図は、Parkら（2012）18から変更されている。
図2。表現型は野生型トウモロコシの分析（ハイII）およびZmCCR1_RNAi変異体の葉の中肋。 A）ブラウン着色はダウンレギュレートZmCCR1で見られるトウモロコシの葉、茎、およびトウモロコシの皮した。B）野生型HI-II（左）とZmCCR1_RNAi突然変異体のライン（右）の断面にトウモロコシの葉の中央脈が0.05％で染色した二次木部組織を可視化する1分間トルイジンブルーO。赤色の矢じりは、葉の中肋厚壁線維細胞壁を示す。（C） ZmCCR1の走査型電子顕微鏡（SEM）ダウンレギュ野生型非トランスジェニック対照植物（左）に比べて、トランスジェニックトウモロコシの葉の中肋（右）。赤い矢印は、厚膜組織繊維を示している。この図は、Park らから変更されている。（2012）18。
図3。クラソンリグニン測定（ACI野生型HI-IIおよびZmCCR1_RNAi変異体の D-不溶性リグニン含量）。 3突然変異系統1cは、図1c-5および1c-6は、野生型対照植物と比較して乾物のパーセントとして、8.5％、7.5％、9.2％、それぞれ、統計的に低いリグニン含量を有していた。平均±標準偏差（P <0.05、n = 3）であった。この図は、Park らから変更されている。（2012）18。
図4細胞壁の組成が、A）ZmCCR1_RNAi 線 （Tukeyの対比較の結晶セルロース分析を解析し 、* P <0.05、n = 3）であった。野生型トウモロコシのB）ヘミセルロース組成分析とZmCCR_RNAiトランスジェニックトウモロコシ系統（T1）を介してガスクロマトグラフィー（GC）。クロマトグラムのWERからの主なピークeは、一体化保持時間およびフラグメントイオンの署名に基づいて識別し、モル百分率として表す（P> 0.05、n = 3）は（Tukeyの対比較、P> 0.05、n = 3）であった。この図は、Park らから再利用されています。（2012）18。
図5パーセントの砂糖未処理のための（グルカンとキシラン）の変換（UT）とアンモニアの異なる濃度でAFEX TM前処理（90℃、5分）トウモロコシ茎葉（1.0：1.0グラムのNH 3：グラム乾燥バイオマス1.5：1.5のNH 3：g乾燥バイオマス）エラーバーは平均値の標準偏差を表しており、未処理の試料と前処理した試料についての4回の反復（2の前処理は、それぞれを複製し2加水分解して複製します）のための2回の反復に基づいています。前処理された砂糖の変換アルファベットで示さ（24時間または72時間）は、Tukeyの対比較した（P <0.05）に基づいて統計的に異なっている。この図は、Park らから再利用されています。（2012）18。
| メディア | 化学組成 |
| N6OSM | 4グラム/リットルN6塩 |
| （浸透媒体） | 1ミリリットル/ L N6ビタミン株式 |
| は2mg / Lの2,4-D | |
| 100 mg / Lのミオ - イノシトール | |
| 0.69グラム/ Lのプロリン | |
| は30g / Lスクロース | |
| 100 mg / Lのカゼイン加水分解物 | |
| 36.4グラム/ Lソルビトール | |
| 36.4グラム/ Lマンニトール | |
| 2.5グラム/ Lのゲルライト、pHは5.8 | |
| オートクレーブ後濾過滅菌し、硝酸銀（25μM）を追加 | |
| N6E | 4グラム/リットルN6塩 |
| （カルス誘導） | 1ミリリットル/ L（1,000 x）のN6ビタミン株式 |
| は2mg / Lの2,4-D | |
| 100 mg / Lのミオ - イノシトール | |
| 2.76グラム/ Lのプロリン | |
| は30g / Lスクロース | |
| 100 mg / Lのカゼイン加水分解物 | |
| 2.5グラム/ Lのゲルライト、pHは5.8 | |
| オートクレーブ後濾過滅菌し、硝酸銀（25μM）を追加 | |
| N6Sメディア | 4グラム/リットルN6塩 |
| （選択培地） | 1ミリリットル/ L N6ビタミン株式 |
| は2mg / Lの2,4-D | |
| 100 mg / Lのミオ - イノシトール | |
| <TD> 0.69グラム/ Lプロリン | |
| は30g / Lスクロース | |
| 100 mg / Lのカゼイン加水分解物 | |
| 36.4グラム/ Lソルビトール | |
| 36.4グラム/ Lマンニトール | |
| 2.5グラム/ Lのゲルライト、pHは5.8 | |
| オートクレーブ後濾過滅菌し、硝酸銀（25μM）を追加 | |
| 再生培地 | 4.3グラム/ LのMS塩 |
| 1ミリリットル/ L（1000X）のMSビタミン株式 | |
| 100 mg / Lのミオ - イノシトール | |
| 60グラム/ Lのスクロース | |
| 3グラム/ Lのゲルライト、pHが5.8（100×25ミリメートルペトリ皿） | |
| フィルター滅菌ビアラホス（3ミリグラム/ L）を追加するオートクレーブ処理後に添加 | |
| 発根培地 | 4.3グラム/ LのMS塩 |
| 100 mg / Lのミオ - イノシトール | |
| は30g / Lスクロース | |
| 3グラム/ Lのゲルライト、pHが5.8（100×25ミリメートルペトリ皿） | |
| 10％中性緩衝ホルマリン | ホルマリン100mlの |
| （1リットル） | のddH 2 Oを900ミリリットル |
| リン酸二水素ナトリウム一水和物（のNaH 2 PO 4·H 2 O）4.0gの |
特定の試薬 の表1。表。
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Discussion
細胞壁多糖類を植える微生物セルラーゼのアクセス可能性は、それらがフェノール系ポリマー23と関連している度合いに大きく依存する。糖を発酵するためのリグノセルロース系バイオマスの転化率は負secondadry植物細胞壁に堆積リグニン含量と相関している。この相関は、このような疎水性24、化学異質性と通常の加水分解性体間の連携25の欠如などのリグニンの物理的性質に起因する。
本研究では、dsRNAi技術は、遺伝的標的上の遺伝子のダウンレギュレーションの様々なレベルを誘導した。 ZmCCR1_RNAiによって仲介リグニンダウンレギュレーション、構築物は、のT1 transgneicラインのブラウンの着色をもたらした。ブラウン中肋（BM）の着色が減少したリグニン含量と変更されたリグニン組成に起因している天然に存在する現象である。当然、他とは違ってoccurrのみをリーフ中間リブで褐色の着色を示すオピニオンbmを変異体、ZmCCR1_RNAi変異株は、茎および殻を含む植物の他の部分での表現型を明らかにした。組織学的なアッセイはまた、ZmCCR1ダウンレギュ葉の厚壁細胞壁の厚さは、野生型対照植物（ 図2A）のものよりはるかに少ないことが示された。しかし、木部導管、師部、または鞘細胞をinclduing主血管系のstuructureと細胞壁の厚さは変更されませんでした。これは植物の高さや幹の直径の面で正常に成長ZmCCR1_RNAiトランスジェニック系統の正常な成長を説明できる。
リグニン含量20％以上の削減は、一般的にバイオマスの喪失を引き起こし、微生物病原体や害虫27,28に対する植物がより脆弱になりました。しかし、変異体株は、10％のリグニンreducti未満を発現する、本研究で産生さ上、植物バイオマスおよび非生物的および生物的ストレスに対する防御機構が損なわれることはありませんでした。
以前の研究は、有意に減少CCR発現を有するトランスジェニックタバコ株はまた、グルコース、キシロース、および壁に結合したフェノール系化合物（ 例えば 、シナピンおよびフェルラ酸）のような他の細胞壁成分の増加を示したことが示されている。本研究では、軽度のリグニン減少がZmCCR1ダウンレギュトウモロコシ植物の一部において、結晶性セルロースのレベルを増加させた。逆に、セルロース補償機構はまた、セルロース合成遺伝子に欠陥があった場合に異所35木化を示したシロイヌナズナ変異体において観察された。一つの細胞壁の炭水化物成分の量的又は質的な変化は、他の構成要素36を交互に誘導する。このような補償mechansimsは、植物の血管系の恒常性をmaintanために重要である。しかし、本研究では、hemicelluloSESは下方制御変異株ZmCCR1には統計学的に有意な変化を示さなかった。観察されたリグニンの減少は、追加のヘミセルロース合成を誘発するのに十分ではなかったので、この結果は、であってもよい。
リグニンおよび増加結晶セルロースレベルの減少したレベルは、バイオ燃料生産のために二重に有益であろう。低いリグニン含量は、処理中に、より少ない入力（ 例えば 、H 2 SO 4、セルラーゼなど ） を必要とし、バイオマス変換プロセスを容易にするであろう。余分なセルロースは、発酵性糖の収率を増加させることができる。本研究で詳述ZmCCR1の遺伝子操作はlignocelluosic bimoass派生バイオエタノールをより商業的に競争力を支援するために実施することができる。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
顕微鏡イメージングは、高度な顕微鏡のためのミシガン州立大学センターのサービスを介して行われました。トウモロコシカルスはアイオワ州立大学のトウモロコシ形質転換のセンターから購入した。著者らは、炭水化物分析の彼の技術的な支援のためのMSU植物研究所のジェフリー·R·ウェザーに感謝したいと思います。この研究は、寛大にミシガン州のトウモロコシマーケティングプログラム（CMPM）と植物バイオテクノロジー研究コンソーシアム（CPBR）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N6OSM (Osmotic medium) | Made in-house | ||
| N6E (Callus induction) | Made in-house | ||
| N6S media (Selection media) | Made in-house | ||
| Regeneration medium | Made in-house | ||
| Rooting medium | Made in-house | ||
| 10% Neutral buffered formalin (1 L) | Made in-house | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device | Hercules, CA, United States | ||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Jena, Germany | For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software. | |
| Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| HistoCentre III Embedding Station | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| Microtome Model Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, United States | ||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 | Ashford, Kent, England | ||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope | JEOL Ltd., Tokyo, Japan | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| MA35 Moisture Analyzer | Sartorius | ||
| Critical point dryer, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States | ||
| Screw-top high pressure tubes | Ace Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Screw-top high pressure tube plugs | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
References
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