Summary
Un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica viene impiegata per down-regolare il coenzima mais cinnamoil A reduttasi (ZmCCR1) gene a basso contenuto di lignina pianta. La lignina down-regulation dalla parete cellulare viene visualizzato mediante analisi al microscopio e quantificato con il metodo Klason. Cambiamenti di composizione in emicellulosa e cellulosa cristallina vengono analizzati.
Abstract
Per facilitare l'uso di biomassa lignocellulosica come risorsa bioenergia alternativa, durante i processi di conversione biologici, è necessaria una fase di pretrattamento per aprire la struttura della parete cellulare, aumentando l'accessibilità dei carboidrati della parete cellulare. Lignina, un materiale polifenolico presente in molti tipi di parete cellulare, è noto per essere un ostacolo significativo enzimatica accesso. Riduzione del contenuto di lignina ad un livello tale da non interferire con l'integrità e difesa sistema strutturale dell'impianto potrebbe essere un passo importante per ridurre i costi di produzione di etanolo. In questo studio, abbiamo geneticamente down-regolato uno dei geni della biosintesi legati lignina, cinnamoil-CoA reduttasi (ZmCCR1) tramite un doppio filamento di RNA tecnica interferenze. Il costrutto ZmCCR1_RNAi è stato integrato nel genoma del mais con il metodo del bombardamento di particelle. Piante di mais transgeniche crescevano normalmente rispetto alle piante di controllo wild-type senza aterfering con una crescita di biomassa o meccanismi di difesa, con l'eccezione della visualizzazione di colore marrone-colorazione in transgeniche piante a foglia metà costole, bucce e gambi. Le analisi microscopiche, in combinazione con il dosaggio istologica, hanno rivelato che le fibre sclerenchima foglia furono diradate ma la struttura e le dimensioni di altri componenti principali del sistema vascolare non è stato modificato. Il contenuto di lignina nel mais transgenico è stato ridotto del 7-8,7%, il contenuto di cellulosa cristallina è stata aumentata in risposta alla riduzione della lignina, emicellulose e rimasto invariato. Le analisi possono indicare che il flusso di carbonio potrebbe essere stato spostato dalla biosintesi di lignina alla biosintesi di cellulosa. Questo articolo delinea le procedure utilizzate per down-regolare il contenuto di lignina nel mais tramite tecnologia RNAi, e l'analisi composizionale parete cellulare utilizzato per verificare l'effetto delle modifiche sulla struttura della parete cellulare.
Introduction
La produzione di biocarburanti da biomassa lignocellulosica è altamente auspicabile per la sua abbondanza presente negli Stati Uniti 1, e nel caso della raccolta sostenibile dei residui agricoli e forestali, la capacità di non competere direttamente per il terreno agricolo utilizzato per l'alimentazione animale e produzione di mangimi. Tuttavia, a differenza di granturco, che è la principale fonte di biocarburante attualmente generata negli Stati Uniti, materiali lignocellulosici sono significativamente più complesso e difficile da abbattere. Oltre al carboidrati a catena lunga, cellulosa ed emicellulosa, che sono le principali fonti di zuccheri durante la fermentazione di materiali lignocellulosici, molti tipi di pareti cellulari delle piante contengono anche lignina, un polimero stirene che fornisce la resistenza, difesa contro attacco patogeno, e idrofobicità alla cella pareti. Mentre necessario per la crescita delle piante e la sopravvivenza, lignina presenta anche un ostacolo significativo per la conversione enzimatica successo della cellulosa e hemicelluperdere di zuccheri solubili. I materiali ad alto contenuto di lignina sono in genere materiali meno desiderabili sia per il biocarburante (attraverso percorsi di conversione biologica) e la polpa e della carta a causa di impatti negativi sulle caratteristiche di lavorazione e la qualità del prodotto. Quindi, la manipolazione genetica di materiali vegetali per la riduzione lignina ad un livello che non interferisce con la coltura resistenza strutturale e sistemi di difesa potrebbe essere importante per la riduzione dei costi di produzione sia per il biocarburante lignocellulosica e le industrie cartiere.
Nel mais (Zea mays), lignina è covalentemente reticolato di emicellulosa nella parete cellulare primaria attraverso Ferulate e ponti diferulate 2. Il complesso lignina-emicellulosa lega a microfibrille di cellulosa attraverso legami idrogeno, formando una matrice complessa che conferisce integrità e resistenza alla parete cellulare secondaria. La resistenza meccanica delle pareti cellulari delle piante è in gran parte determinato dal tipo di lignin subunità 3-5. In studi precedenti, alterando le proporzioni di subunità lignina ha mostrato alcuna tendenza chiara sulla digeribilità enzimatica 6-11. Tuttavia, la riduzione del contenuto di lignina generalmente mostrano un miglioramento conversioni 12,13 e può essere una chiave per aumentare la digeribilità del materiale vegetale da enzimi idrolitici compresi endocellulases, cellobiohydrolases, e β-glucosidasi 14.
L'ingegneria genetica per regolare il livello di espressione dei trascritti è stato ampiamente praticato per migliorare le caratteristiche delle colture. Tecniche avanzate, tra cui anti-senso 15 e co-soppressione di 16 tecnologie, consentono efficaci down-regolazione dei geni bersaglio. Completa gene knock-out è stato raggiunto anche utilizzando costrutti genici codificanti RNA introne-impiombato con una struttura tornante 17. Inoltre, un doppio filamento di RNA interference (dsRNAi) tecnica, vale a dire un mezzo di espressione genica potente ed efficacetor che funziona da una mira degradazione trascrizione o di traduzione repressione, fornisce un potente mezzo per indurre una vasta gamma di effetti di soppressione sul bersaglio mRNA 18. Tecniche di silenziamento genico mostrano diversi limiti. Queste tecniche non regolano con precisione il livello di trascrizione e potrebbe causare effetti silenziamento impreviste su altri geni omologhi.
In questo metodo, abbiamo impiegato bombardamento di particelle per trasportare il dsRNAi costruisce nel genoma del mais. Fino ad oggi, una vasta gamma di specie vegetali sono state trasformate con successo utilizzando bombardamento di particelle, Agrobacterium trasformazione mediata, elettroporazione, e metodi di microiniezione. Nel mais trasformazione genetica, il metodo bombardamento di particelle è vantaggioso su tutti gli altri metodi in quanto è il più efficiente. Bombardamento di particelle non dipende batteri, per cui il metodo è privo di vincoli biologici quali le dimensioni del gene, specie di gene oOr igi neCu, o il genotipo pianta. Il sistema fisico consegna transgene consente DNA ad alto peso molecolare e più geni da introdurre nel genoma vegetale e in taluni casi nei cloroplasti ad alta efficienza di trasformazione 19. La riduzione lignina nel sistema vascolare della foglia venatura può essere visualizzato mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) che è vantaggioso per l'esame della topografia e composizione dei campioni.
In piante di mais, due dei reduttasi cinnamoil-CoA (ZmCCR1: X98083 e ZmCCR2: Y15069) geni sono stati trovati nel genoma del mais 20. Cinnamoil-CoA reduttasi catalizza la conversione degli esteri hydroxycinnamoyl-CoA in aldeidi cinnamil. Abbiamo scelto il gene ZmCCR1 di down-regolare questo enzima perché il gene è espresso in tutti i tessuti lignifying. I 523 nucleotidi a terminus 3 'del gene ZmCCR1 sono stati scelti per un dsRNAi costruire perché le sequenze apparivanopiù diversificata rispetto a quelli di ZmCCR2. Così, il costrutto dsRNAi sarebbe proprio legarsi solo a ZmCCR1, evitando off-target tacere 21. Un costrutto ZmCCR1_RNAi è stato progettato nel sistema di espressione ImpactVector1.1-tag citoplasmatica (IV 1.1) contenente il verde tessuto promotore specifico, ribulosio-1, 5-bifosfato carbossilasi ossigenasi (Rubisco).
Per studiare gli effetti della dsRNAi costrutto di piante transgeniche, il contenuto di lignina è stato quantificato. La misurazione lignina Klason (acido insolubile) è noto per essere più precisi rispetto ai metodi acido detergente lignina quantificazione che solubilizzano alcuni dei lignina 22. Pertanto, la lignina Klason stata misurata in stocchi di mais transgenici. Questa procedura consiste di una idrolisi acida in due fasi che converte i carboidrati polimerici in monosaccaridi solubili 23. La biomassa idrolizzato è stato poi frazionato in materi solubili e insolubili in acidoSLA e la lignina insolubile acido è stata misurata secondo studi precedenti 23,24. Idealmente, analisi lignina dovrebbe comprendere estrazioni con acqua ed etanolo prima della fase di idrolisi, per la rimozione delle sostanze solubili che possono interferire con i risultati, e un post-combustione idrolisi del residuo lignina per tenere conto di eventuali ceneri presenti nel residuo. Senza questi passaggi, il contenuto di lignina del campione potrebbe essere artificiosamente gonfiato. Il metodo completo è qui presentata, ma per i nostri esperimenti siamo stati in grado di eseguire entrambe queste operazioni a causa del piccolo volume di materiale disponibile per il test
Altri due componenti della parete cellulare, cellulosa ed emicellulosa sono stati analizzati anche in lignina linee down-regolato mais transgenico. E 'stato riportato che le piante transgeniche che sono state down-regolati in entrambi i loro fenilalanina ammoniaca-liasi (PAL) 25, 4-coumarate: CoA ligasi (4CL) 26, o un cinnamillcohol deidrogenasi (CAD) 27 mostrano un aumento delle altre componenti strutturali della parete cellulare. Come primo passo nei nostri studi, cellulosa cristallina è stata misurata con il metodo Updegraff 28. Questo metodo è stato originariamente ideato per la determinazione di cellulosa in un gran numero di batteri e funghi cellulolitici. In breve, le scorte di mais macinati sono stati trattati con Updegraff reagente (acido acetico: acido nitrico: acqua) per rimuovere emicellulosa, lignina e xylosans. La cellulosa cristallina è stato completamente idrolizzato in glucosio tramite Saeman idrolisi con l'aggiunta di H 2 SO 4. La cellulosa cristallina è stato poi analizzato con il metodo colorimetrico anthrone 29. Per verificare se sono stati modificati i contenuti emicellulosa, gli estratti monosaccaride da steli lavorato sono idrolizzati con acido trifluoroacetico, derivatizzati con il metodo acetato alditolo e poi analizzati mediante gascromatografia (GC) 30. Le procedure dettagliate per cel cristallinaanalisi del contenuto lulose e matrice polisaccaridi composizione sono descritti in Foster et al. (2010) 31.
Qui, descriviamo le procedure utilizzate per la lignina down-regulation nel mais mediante una tecnologia di RNAi, particella bombardamento trasformazione, e l'analisi lignina per la decostruzione accelerata di granturco biomassa lignocellulosica in zuccheri fermentabili per i biocarburanti.
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Protocol
1. Preparazione di dsRNAi costrutti utilizzati per la down-regolazione di ZmCCR1
- Gene disegno primer specifici, tra cui i siti necessari enzimi di restrizione per fare un dsRNAi costruire knock-out del gene ZmCCR1. Due set di primer sono stati progettati per amplificare due segmenti frammento di ZmCCR1 cDNA:. Un frammento di 523 bp dal nucleotide 748-1271, e un frammento di 285 bp dal nucleotide 986-1271 La ZmCCR1 cDNA è stato fornito dal Genome Institute dell'Arizona (AGI). Ulteriori dettagli sono descritti in Figura 1.
- Amplificare il grande frammento da polymerase chain reaction (PCR) dal modello ZmCCR1 cDNA utilizzando i primer ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') e ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Amplificare il frammento più piccolo (285 bp) utilizzando i primers ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') e un ZmCCR1_1271R_SacI (5R17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
- Legare autonomamente i frammenti in pGEM-T facile seguendo le istruzioni del produttore.
- Eseguire mini-prep plasmide isolamento del DNA dai singoli trasformanti, ciascuna contenente il pGEM-T costruisce utilizzando un kit mini-prep commerciali plasmide.
- Digerire sia la pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) e ImpactVector (IV) -1.1 (espressione citoplasma vector) sia con BglII e NcoI.
- Legare il grande digerito purificato su gel ZmCCR1 frammento (523 bp) nel gel digerito purificato IV-1.1.
- Digerire il pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) e IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) sia con BglII e SacI per inserire il frammento piccolo nel IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Legare la piccola gel digerito purificato frammento ZmCCR1 (285 bp) nel gel digerito purificato IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Clonare sia 523 bp e 285 bp frammentazionets nel IV-1.1 per rendere il ZmCCR1 RNAi costruire, che ha una sequenza ripetuta invertita 285 bp con un distanziale 238 bp nel mezzo dei frammenti di ripetizione invertiti (vedi Figura 1).
- Trasferire questo costrutto in Escherichia coli (E. coli), farle crescere ed eseguire una taglia plasmide isolamento del DNA midi-prep per ottenere abbastanza DNA plasmidico per il mais trasformazione genetica.
2. Granturco trasformazione genetica
- Preparazione di particelle di tungsteno
- Porre 60 mg di perle di tungsteno (M10) in una provetta da 1,5 ml e lavare con 1 ml di etanolo al 70% vortexando per 2 min. Incubare per 10 min a 23 ° C e poi centrifugare a 18.894 xg per 2 minuti e scartare il surnatante.
- Lavare 3x con 1 ml di etanolo al 100%, centrifugazione per 2 min e scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile 50% per portare la concentrazione di microparticelle a 60 mg / ml.
- Preparazione di DNA per Bombardamento
- Place 50 microlitri (3 mg) di perline di tungsteno preparati nel 50% glicerolo in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 5 ml (1 mg), del IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi DNA plasmidico, 50 ml di 2,5 M CaCl 2, e 20 ml di 0,1 M spermidina. Vortex brevemente tra ogni aggiunta dei reagenti di cui sopra.
- Vortex il tungsteno tallone-DNA miscela brevemente e centrifugare a 18.894 xg per 30 sec. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 140 ml di etanolo al 70%. Rimuovere il liquido e scartare. Aggiungere 140 ml di etanolo al 100%. Rimuovere il liquido e scartare.
- Aggiungere 48 ml di etanolo al 100%. Utilizzare immediatamente o conservare in ghiaccio fino a 4 ore prima del bombardamento.
- Bombardamento
- Posizionare un calli di mais embriogenica di 3-5 cm di diametro Hi-II (fornito da granturco trasformazione Center of Iowa State University) nel bel mezzo di 100 millimetri piastre Petri contenenti supporti N6OSM 32 (osmotium) almeno 4 ore prima del bombardamento.
- Prepae il PSD-1000/He dispositivo Particle consegna secondo le istruzioni del produttore 33.
- Sterilizzare parete della camera con il 70% di etanolo. Caricare sterile disco di rottura 650 psi nel tappo di contenimento sterile. Diffondere 5-6 microlitri della soluzione M10-DNA sulla superficie di un macrocarrier, brevemente asciutto. Load macrocarrier e l'arresto schermo in microcarrier assemblaggio di lancio.
- Posizionare microcarrier assemblaggio di lancio e il granturco calli in camera ad una distanza selezionata dallo schermo di arresto (L2 = 6 cm) e chiudere la porta. Accelerare in un vuoto di 27 psi contro uno schermo rete metallica.
- Premere il pulsante di fuoco fino a quando scoppia disco di rottura e la pressione dell'elio manometro scende a zero. Rilasciare il pulsante di fuoco.
- Incubare le calli bombardati in una capsula di Petri contenente N6OSM (medio osmotica) 32 per 16 ore al buio a 27 ° C. Rompere le calli in una decina di pezzi e trasferimento N6E (medio induzione callo) 32 in piastre di Petri e incubare per 5 giorni in al buio a 27 ° C.
- Selezione
- Dopo 5 giorni di N6E, trasferire il calli sulla N6S medio (selezione media) 32. Subculture tutti i calli sul mezzo di selezione ogni 30 giorni per 8-12 settimane senza disturbare la struttura calli.
- Dopo circa 8-10 settimane bianche settori in rapida crescita crescerà fuori della non-proliferazione e parzialmente necrotico madre calli. Accise bianco tessuti in rapida crescita e la loro sottocultura e medie selezione fresco (N6S) 32 e continuare a incubare come sopra.
- Rigenerazione
- Trasferire la calli embrionale bianco e rapida crescita sul rigenerazione medio 32 e incubare come sopra per 1 settimana. Accendere il rigenerante calli embriogenica per un periodo di 16 ore di luce e 8 ore al buio a 25-27 ° C
- Trasferire la rigenerante tira sulla radicazione media 32 in una provetta di vetro dopo 3-4 settimane, continuano ad incubare come sopra. Dopo il sostanziale rAppare sviluppo oot, lavare accuratamente le radici sotto l'acqua del rubinetto, poi trapiantare le piantine a 4 "vasi di terra. Coprire i vasi con sacchetti di plastica per mantenere umido. Dopo 2 giorni fanno piccoli fori i sacchetti di plastica. Dopo 5-6 giorni rimuovere i sacchetti di plastica. Continuare a incubare come sopra per altri 5-6 giorni.
- Serra
- Trasferire le piantine in vasi da 18 "con il suolo e mantenere in pieno sole d'estate o la luce a effetto serra. Le piante rigenerate iniziali sono chiamati T 0, mentre i primi semi appartengono alla T 1 generazione.
3. Assay istologico
- Fissare i mais centro-foglia nervature in 5 ml di 10% formalina tamponata neutra.
- Processo e vuoto infiltrano con paraffina su un processore tessuto utilizzando un processore tessuto.
- Incorporare i tessuti in paraffina utilizzando una stazione di incorporamento HistoCentre III.
- Rimuovere la paraffina in eccesso dai bordi una bloccoks sono raffreddati.
- Campione Sezione a 4-5 micron con un microtomo utilizzando un microtomo.
- Posizionare sezioni su vetrini da microscopio e asciugare in un incubatore a 56 ° C per 2-24 ore. Accertarsi che le sezioni sono pienamente rispettate alla diapositiva.
- Deparaffinare sezioni in due cambi di xilene per 5 min a 23 ° C.
- Idrato scorre attraverso due cambi di etanolo 100% per 2 min e due cambi di etanolo al 95% per 2 min a 23 ° C.
- Lavare le sezioni in acqua corrente per 2 minuti.
- Colorare con il 0,05% di toluidina O blu per 1-2 minuti e sciacquare brevemente con DDH 2 O.
- Posizionare un vetrino sui campioni di olio per immersione e visualizzazione con microscopio ottico.
- Microscopia elettronica a scansione (SEM)
- Fissare i mais centro-foglia costole sezionata in 4% e glutaraldeide 0,1 M tampone fosfato di sodio (pH 7,4) a 4 ° C per 1-2 ore.
- Risciacquare brevemente i campioni nel buffer, li disidratato in unserie di etanolo (25%, 50%, 75% e 95%) per 10-15 min a ciascuna gradazione e 100% etanolo per 10 min, 3x.
- Essiccare le disidratati mais centro-foglia nervature a sezione trasversale in un essiccatore punto critico usando biossido di carbonio liquido come fluido transitorio.
- Montare i campioni essiccati su mozzi in alluminio con alette in carbonio ad alto vuoto
- Rivestire le foglie di granturco metà costole montati su mozzi in alluminio con l'oro (circa 20 nm di spessore) in un gruppo di verniciatura polverizzazione lavata con gas argon.
- Esaminare i campioni rivestiti in un JEOL JSM-6400V (lantanio hexaboride emette elettroni) microscopio elettronico a scansione.
- Le immagini digitali sono stati raffigurati con un software Pro di analisi (versione 3.2).
4. Klason lignina misura
- Mill i campioni attraverso uno schermo da 2 mm.
- Utilizzare un analizzatore di umidità per determinare il contenuto di umidità di ciascun campione e registrare il valore.
- Pesare circa 1,5 g di ciascun campione e registrare la massa. EXtract i campioni utilizzando acqua nella prima estrazione, seguito da etanolo per la seconda estrazione utilizzando un estrattore automatico solvente (3 cicli per estrazione, ~ 14 min per ciclo) o apparecchio Soxhlet (8 ore per l'estrazione). (Nota: Questo passaggio rimuove estrattivi che può condensare durante l'idrolisi acida e interferire con la misura lignina accurate, aumentando l'apparente contenuto di lignina Klason.)
- Asciugare i campioni estratti a 45 ° C per una notte, poi lasciare raffreddare nell'essiccatore e pesare di nuovo.
- Impostare un incubatore a 30 ° C. Misura 0.3 g di ciascun secca, campione estratto nel tappo a vite tubi ad alta pressione (triplicato per campione è consigliato) e registrare i pesi con un'approssimazione di 0,1 mg. Aggiungere 3 ml di 72% H 2 SO 4 in ciascuna provetta pressione.
- Mescolare il campione con un bicchiere o una barra Teflon mescolare. Lasciare l'asta scalpore nel tubo fino a quando viene aggiunta acqua a seguito di incubazione.
- Posizionare le fiale in un incubatore sét a 30 ° C e 150 rpm per 60 min. Dopo 1 ora aggiungere 84 ml di acqua deionizzata per diluire la concentrazione di acido al 4% e mescolare con l'asta di agitazione. Fare attenzione a non lasciare grandi quantità di campione sui lati del flaconcino di sopra della linea di galleggiamento.
- Strettamente sigillare i tappi su tutti i flaconi e metterli in un telaio di metallo o grandi bicchieri. Autoclave a 121 ° C con un ciclo di sterilizzazione liquido per 1 ora. Lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima di aprire.
- Pre-cenere i crogioli filtranti in un forno a 575 ° C per almeno 4 ore. Lasciare crogioli raffreddare in un essiccatore per almeno un'ora.
- Filtro a vuoto la soluzione da ciascuna provetta attraverso un crogiolo separata, utilizzando un adattatore di gomma per fissare il crogiolo. Usare acqua deionizzata per lavare ogni residuo di particelle dal tubo.
- Essiccare il residuo lignina a 105 ° C per un minimo di 4 ore. Registrare il peso del crogiolo e residuo secco.
- Se si utilizza un 575 ° C, preFuoco i campioni nel corso di un becco Bunsen fino a quando non c'è fumo o cenere e poi mettere in forno per 24 ore, o se si utilizza un forno programmabile, non pre-cenere e utilizzare il seguente programma:
- Rampa da temperatura ambiente a 105 ° C e mantenere per 12 min.
- Rampa a 250 ° C a 10 ° C / min premuto per 30 min.
- Rampa a 575 ° C a 20 ° C / min e tenere premuto per almeno 180 min.
- Rimuovere i crogioli dal forno e lasciare raffreddare in un essiccatore. Pesare il crogiolo e cenere.
- Calcolare il residuo insolubile acido utilizzando la seguente equazione:
M PRE = massa di biomassa pre-estratto
M POST = Massa di biomassa post-estratti
M VIAL = massa di biomassa estratta aggiunto al flaconcino
M RESIDUO = Massa di resid crogiolo e ligninaue
M ASH = Massa del crogiolo e cenere
MC = contenuto di umidità della biomassa pre-estratti, in base peso totale
5. Analisi Carboidrati
- Eseguire cella carboidrati muro di analisi basato sulla Foster et al. (2010) il protocollo 31. In breve, Preparare alcol residuo insolubile da liofilizzati materiale vegetale. Poi idrolizzare il materiale con acido trifluoroacetico e abbinare i derivati solubilizzate monosaccaridi ai loro acetati alditolo corrispondenti. Analizzare questi derivati volatili mediante gascromatografia (GC) collegato ad uno spettrometro di massa quadrupla.
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Representative Results
Abbiamo dimostrato una riduzione del tenore di lignina in piante di mais tramite RNAi. Il metodo di trasformazione bombardamento di particelle ceduto circa il 30% di efficienza trnasformation. Il silenziamento genico di ZmCCR1 è stata costantemente osservata nelle generazioni T0-T2. I transgenici lignina ridotta cresciuto in modo simile a piante di mais di tipo selvatico, tranne per la visualizzazione di colorazione marrone in foglia venatura, buccia, e gambo. L'analisi istologica ha dimostrato che le linee mutanti mostrano una significativa riduzione dello spessore della parete cellulare delle fibre sclerenchima nella foglia granturco venatura 18. Nonostante la riduzione dello spessore della parete cellulare, la struttura di altri grandi sistemi vascolari tra cui la nave xilema, floema, e cellule della guaina non ha evidenziato differenze rispetto al controllo wild-type (Figura 2A) 18. Ciò implica che non ci sono effetti dannosi sia per il trasporto di acqua, trasferimento di nutrienti, o resistenza meccanica agli steli in le linee mutanti ZmCCR1_RNAi.
Il contenuto di lignina è stata quantificata utilizzando una misurazione lingin Klason. Figura 3 mostra la quantità di acido insolubili Klason lignina (g / kg con Stover) nel mais tipo selvatico e linee transgeniche ZmCCR1_RNAi (T1). Tre linee transgeniche (1c-4, -5 e -6) hanno mostrato una riduzione statisticamente significativa lignina (8,1%, 7,0% e 8,7% rispettivamente) rispetto a quello delle piante di mais wild-type 18. Per determinare se il flusso di carbonio è stata spostata dalla via biosintetica lignina alla cella parete carboidrati vie di biosintesi, cellulosa è stata analizzata mediante il metodo Updegraff. Figura 3A mostra che due linee ZmCCR1_RNAi mutanti (1b-1c-6 e 6) contenevano notevolmente accresciuti di cristallina cellulosa (1,5 e 1,8 volte, rispettivamente) 18. Il contenuto di emicellulosa è stato anche analizzato. Figura 4B mostra la quantità di quattro componenti principali (emicellulosaarabionose, xilosio, galattosio e glucosio). Nessuno dei quattro gruppi di carboidrati ha rivelato eventuali modifiche delle linee mutanti 18.
Figura 1 clonazione strategia per dsRNAi costrutti plasmidici per la down-regolazione del ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulosio bisfosfato carbossilasi promotore da Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RbcS1: ribulosio bisfosfato carbossilasi piccola unità di terminazione di crisantemo Asteraceous. Questa cifra è stata modificata dal Parco et al (2012) 18.
Figura 2. Fenotipica analisi di wild-type corn (Hi-II) e ZmCCR1_RNAimutante nervatura centrale foglia. A) Brown colorazione è stato visto in ZmCCR1 foglie di mais down-regolati, steli e foglie di mais. B) Le costole foglia di mais sezionata di wild-type HI-II (a sinistra) e la linea mutante ZmCCR1_RNAi (a destra) sono state colorate con il 0,05% toluidina O blu per 1 min per visualizzare i tessuti xilema secondario. La freccia rossa indica le pareti cellulari di fibre sclerenchima della nervatura di foglia. (C) Scanning Electron Microscopy (SEM) di ZmCCR1 down-regolato transgenico nervatura foglia di mais (a destra) rispetto a quello di tipo selvaggio impianto controllo non transgenico (a sinistra). La freccia rossa indica fibre sclerenchima. Questa cifra è stata modificata dal Parco et al. (2012) 18.
Figura 3. Klason misure lignina (acid-insolubile contenuti lignina) di wild-type HI-II e ZmCCR1_RNAi mutante. Le tre linee mutanti 1c, 1c-5, e 1c-6 aveva contenuto statisticamente inferiore lignina, 8,5%, 7,5% e 9,2%, rispettivamente, in percentuale di sostanza secca rispetto alle piante di controllo di tipo selvatico. Media ± deviazione standard (P <0,05, n = 3). Questa cifra è stata modificata dal Parco et al. (2012) 18.
Figura 4. Analizza Parete cellulare compositiva. Analisi A) cristallino cellulosa delle linee ZmCCR1_RNAi (confronti a coppie di Tukey, * p <0.05, n = 3). B) emicellulosa analisi composizionale di wild-type di mais e le linee di mais transgenico ZmCCR_RNAi (T1) via gascromatografia (GC). Le principali vette dei cromatogrammi were integrato, individuato in base ai tempi di ritenzione e firme di ioni frammento, ed espressa in percentuale mol (P> 0.05, n = 3) (confronti a coppie di Tukey, P> 0.05, n = 3). Questa cifra è stata riutilizzata dal Parco et al. (2012) 18.
Figura 5 Percentuale di zucchero conversioni (glucano e Xylan) per greggia (UT) e AFEX TM pretrattati (90 ° C, 5 min) mais Stover a differenti concentrazioni di ammoniaca (1.0:. 1,0 g di NH 3: g biomassa secca 1.5: 1.5 g NH 3:. g biomassa secca) Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media e si basano sui due repliche per i campioni non trattati e quattro repliche (due pretrattamento replica con due idrolisi replicati ciascuno) per i campioni pretrattati. Conversioni di zucchero pretrattati(24 ore o 72 ore) marcato con lettere diverse sono statisticamente differenti sulla base di confronti a coppie di Tukey (P <0,05). Questa cifra è stata riutilizzata dal Parco et al. (2012) 18.
| Media | Composizioni chimiche |
| N6OSM | Sali di 4 g / L N6 |
| (Medio osmotico) | 1 ml / L N6 vitamina magazzino |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositolo | |
| 0.69 g / L prolina | |
| 30 g / L di saccarosio | |
| 100 mg / L di caseina idrolizzato | |
| 36,4 g / L di sorbitolo | |
| 36,4 g / L mannitolo | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Aggiungere sterilizzato per filtrazione di nitrato d'argento (25 mM) dopo autoclave | |
| N6E | Sali di 4 g / L N6 |
| (Callo induzione) | 1 ml / l (1.000 x) N6 vitamina magazzino |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositolo | |
| 2.76 g / L prolina | |
| 30 g / L di saccarosio | |
| 100 mg / L di caseina idrolizzato | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Aggiungere sterilizzato per filtrazione di nitrato d'argento (25 mM) dopo autoclave | |
| Supporti N6S | Sali di 4 g / L N6 |
| (Supporti Selezione) | 1 ml / L N6 vitamina magazzino |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositolo | |
| <td> 0,69 g / L prolina | |
| 30 g / L di saccarosio | |
| 100 mg / L di caseina idrolizzato | |
| 36,4 g / L di sorbitolo | |
| 36,4 g / L mannitolo | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Aggiungere sterilizzato per filtrazione di nitrato d'argento (25 mM) dopo autoclave | |
| Mezzo di rigenerazione | Sali di 4.3 g / L SM |
| 1 ml / L (1000x) MS vitamina magazzino | |
| 100 mg / L myo-inositolo | |
| 60 g / L di saccarosio | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm piastre Petri) | |
| Aggiungi filtro sterilizzato bialaphos (3 mg / L) aggiunta dopo la sterilizzazione in autoclave | |
| Radicamento medio | Sali di 4.3 g / L SM |
| 100 mg / L myo-inositolo | |
| 30 g / L di saccarosio | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm piastre Petri) | |
| 10% formalina tamponata neutra | 100 ml di formalina |
| (1 litro) | 900 ml di DDH 2 O |
| 4.0 g di sodio fosfato monobasico, monoidrato (NaH 2 PO 4 · H 2 O) |
Tabella 1. Tabella dei reagenti specifici.
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Discussion
L'accessibilità di cellulasi microbiche per piantare polisaccaridi della parete cellulare dipende in larga misura il grado in cui essi sono associati con polimeri fenolici 23. Il tasso di conversione da biomassa lignocellulosica fermentabili zucchero è correlato negativamente con il contenuto di lignina depositato nelle pareti cellulari secondadry vegetali. Questa correlazione è attribuito alle proprietà fisiche della lignina come idrofobicità 24, eterogeneità chimica, e l'assenza di regolare intermonomeric idrolizzabile parallelogrammi 25.
In questo studio, una tecnica dsRNAi indotto vari livelli del gene down-regulation su obiettivi genetici. La lignina down-regulation, mediato da un ZmCCR1_RNAi costruire, ha portato alla colorazione marrone-in linee transgneic T1. Brown-nervatura (bm) colorazione è un fenomeno naturale che è causato dalla riduzione del contenuto di lignina e composizione lignina modificata. A differenza di altri, naturalmente, si verificasseromutanti ed bm, che mostrano la colorazione marrone solo nel centro-foglia costole, le linee mutanti ZmCCR1_RNAi rivelato il fenotipo in altre parti della pianta, compresi i gambi e bucce. L'analisi istologica ha anche indicato che lo spessore della parete cellulare sclerenchima di ZmCCR1 foglie down-regolati era molto inferiori a quelle delle piante di controllo di tipo selvatico (Figura 2A). Tuttavia, la parete cellulare sturucture e spessore dei principali sistemi vascolari inclduing vasi dello xilema, floema, o cellule della guaina non è stato modificato. Questo potrebbe spiegare la normale crescita delle linee transgeniche ZmCCR1_RNAi che crescevano normalmente in termini di altezza della pianta e diametro derivano.
Una riduzione di oltre il 20% del contenuto di lignina è generalmente provocato una perdita di biomassa e reso piante più vulnerabili contro gli agenti patogeni microbici e parassiti 27,28. Tuttavia, le linee mutanti prodotti in questa ricerca, esprimendo meno di lignina reducti 10%su, non compromettere la biomassa vegetale e il meccanismo di difesa contro gli stress abiotici e biotici.
Precedenti studi hanno dimostrato che le linee di tabacco transgeniche con l'espressione CCR significativamente ridotto anche mostrato un aumento di altre componenti della parete cellulare come il glucosio, xilosio, e composti fenolici legato a parete (per esempio, acidi sinapico e ferulico). In questo studio, la riduzione lignina lieve aumentato il livello di cellulosa cristallina in alcuni dei ZmCCR1 piante di mais down-regolati. Al contrario, un meccanismo di compensazione di cellulosa è stato osservato anche in mutanti di Arabidopsis che esibivano lignificazione ectopica quando i geni di sintesi di cellulosa erano difettose 35. I cambiamenti quantitativi e qualitativi di un componente della parete cellulare di carboidrati induce l'alternarsi di altri componenti 36. Tali mechansims compensazione sono importanti per maintan l'omeostasi vascolare della pianta. Tuttavia, in questo studio, hemicelluloses mostrato statisticamente significative variazioni ZmCCR1 linee mutanti down-regolati. Questo risultato può essere perché la riduzione lignina osservato non era sufficiente per far scattare ulteriori sintesi emicellulosa.
La diminuzione del livello di lignina e l'aumento del livello di cellulosa cristallina sarebbe doppiamente vantaggioso per la produzione di biocarburanti. Il contenuto di lignina inferiori richiederebbe un minor numero di ingressi (ad esempio, H 2 SO 4, cellulasi, ecc) durante la lavorazione e facilitare il processo di conversione della biomassa. La cellulosa aggiuntiva può aumentare la produzione di zuccheri fermentabili. La manipolazione genetica di ZmCCR1 dettagliato in questo studio può essere implementato per rendere bimoass lignocelluosic bioetanolo derivato più competitiva sul mercato.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La rappresentazione microscopica è stata condotta tramite i servizi della Michigan State University Center for Advanced Microscopia. Il mais callo è stato acquistato dalla trasformazione centro di mais dell'Iowa State University. Gli autori desiderano ringraziare Jeffrey R. Weatherhead della MSU Plant Research Laboratory per la sua assistenza tecnica per l'analisi dei carboidrati. Questa ricerca è stata generosamente finanziata dal Programma Corn Marketing del Michigan (CMPM) e il Consorzio per la Plant Biotechnology Research (CPBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N6OSM (Osmotic medium) | Made in-house | ||
| N6E (Callus induction) | Made in-house | ||
| N6S media (Selection media) | Made in-house | ||
| Regeneration medium | Made in-house | ||
| Rooting medium | Made in-house | ||
| 10% Neutral buffered formalin (1 L) | Made in-house | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device | Hercules, CA, United States | ||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Jena, Germany | For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software. | |
| Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| HistoCentre III Embedding Station | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| Microtome Model Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, United States | ||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 | Ashford, Kent, England | ||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope | JEOL Ltd., Tokyo, Japan | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| MA35 Moisture Analyzer | Sartorius | ||
| Critical point dryer, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States | ||
| Screw-top high pressure tubes | Ace Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Screw-top high pressure tube plugs | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
References
- Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
