Summary
En dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikken er ansatt for å ned-regulere mais cinnamoylforbindelser koenzym A-reduktase (ZmCCR1) genet til lavere plante lignin innhold. Lignin nedregulering av celleveggen blir visualisert ved mikroskopiske analyser og kvantifiseres ved Klason metoden. Sammensetningsendringer hemicellulose og krystallinsk cellulose blir analysert.
Abstract
For å lette bruken av lignocelluloseholdig biomasse som et alternativ bioenergi ressurs, under biologiske omvandlingsprosesser, er en forbehandling trinn som trengs for å åpne opp strukturen av plantecelleveggen, noe som øker tilgjengeligheten av celleveggen karbohydrater. Lignin, en polyfenoliske materiale som finnes i mange cellevegg-typer, er kjent for å være en betydelig hindring for enzym tilgang. Reduksjon i lignin-innhold til et nivå som ikke forstyrrer den strukturelle integriteten og forsvarssystemet i anlegget kan være et verdifullt skritt for å redusere kostnadene ved produksjon av bioetanol. I denne studien, har vi genetisk nedregulert en av lignin-biosyntese-relaterte gener, cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1) via en dobbelt-trådet RNA-interferens teknikk. Den ZmCCR1_RNAi konstrukt ble integrert i genomet ved hjelp av mais partikkel bombardement metoden. Transgene maisplanter vokste normalt i forhold til villtype kontrollanlegg uten iterfering med biomassevekst eller forsvarsmekanismer, med unntak av visning av brun-farge i transgene planter blad midten av ribbeina, skall og stilker. De mikroskopiske analyser, i forbindelse med den histologisk assay viste at blad sclerenchyma fibre ble tynnet men strukturen og størrelsen på andre viktige vaskulære system komponenter ble ikke forandret. Det lignin-innholdet i den transgene mais ble redusert med 7 til 8,7%, ble den krystallinske cellulose-innhold økes som reaksjon på lignin reduksjon, og hemicelluloser forble uendret. Analysene kan tyde på at karbonstrømmen kan ha blitt flyttet fra lignin biosyntese til cellulose biosyntese. Denne artikkelen delineates Fremgangsmåtene anvendt til å ned-regulere lignin-innholdet i mais via RNAi-teknologi, og celleveggen komposisjonelle analyser anvendes for å kontrollere effekten av endringer av celleveggstrukturen.
Introduction
I produksjon av biodrivstoff fra lignocelluloseholdig biomasse er meget ønskelig på grunn av den foreliggende mengde i US 1, og i tilfelle av en bærekraftig innhøstingen av rester jord-og skogbruk, evnen til å konkurrere direkte til dyrket mark anvendes for mat-og dyrefor-produksjon. Imidlertid, i motsetning til mais korn, som er hovedkilden for biodrivstoff tiden genereres i USA, lignocelluloseholdige materialer er betydelig mer komplisert og vanskelig å bryte ned. I tillegg til det langkjedede karbohydrater, cellulose og hemicellulose, som er de viktigste kilder til sukker ved gjæring av lignocelluloseholdige materialer, mange typer av plantecellevegger også inneholder lignin, et styrene polymer som gir styrke, forsvar mot patogene angrep, og hydrofobisitet til celleveggene. Mens nødvendige for plantevekst og overlevelse, lignin presenterer også en betydelig hindring for den vellykkede enzymatisk omdannelse av cellulose og hemicellutape mot løselige sukker. Materialer med høy lignin innholdet er generelt mindre ønskelig materialer for både biodrivstoff (gjennom biologisk konverterings pathways) og masse-og papirindustrien på grunn av de negative virkninger på prosesseringskarakteristika og produktkvalitet. Derfor kan genetisk manipulering av plantemateriale for lignin reduksjon på et nivå som ikke forstyrrer med crop strukturell styrke og forsvarssystemer være viktig for reduksjon av produksjonskostnader for både lignocellulose biobrensel og masse-og papirindustrien.
I mais (Zea Mays), er lignin kovalent kryssbundet til hemicellulose i den primære celleveggen via ferulate og diferulate broer to. Det lignin-hemicellulose-komplekset bindes til cellulose mikrofibriller gjennom hydrogenbindinger, som danner et kompleks matrise som confers integritet og styrke til den sekundære celleveggen. Den mekaniske styrken av plantecellevegger er i stor grad bestemt av hvilken type lignin subenheter 3-5. I tidligere studier har endre proporsjonene av lignin subenheter vist noen klar trend på enzymatisk fordøyelighet 6-11. Men reduksjon i lignin-innhold generelt viser en forbedring i konverteringer 12,13 og kan være en nøkkel til å øke fordøyeligheten av plantemateriale av hydrolytiske enzymer, inkludert endocellulases, cellobiohydrolases og β-glucosidases 14.
Genteknologi for å regulere uttrykket nivået av vitnemål har blitt grundig praktisert å forbedre avlingstrekk. Avanserte teknikker, inkludert anti-sense 15 og co-undertrykkelse 16 teknologier, muliggjøre effektiv nedregulering av målet gener. Komplett genet knock-out har også blitt oppnådd ved hjelp genet konstruerer koder intron-skjøtes RNA med en hårnål struktur 17. Videre, en dobbelttrådet RNA interferens (dsRNAi) teknikk, dvs. en kraftig og effektiv genuttrykk mediator som fungerer ved enten å målrette transkripsjon nedbrytning eller oversettelses undertrykkelse, gir en potent middel for å indusere en lang rekke undertrykkelse virkninger på mRNA-target 18.. Genet stanse teknikker viser flere begrensninger. Disse teknikkene ikke nøyaktig regulere nivået av transkripsjon og det kan føre til uventede Silencing effekter på andre homologe gener.
I denne fremgangsmåten anvendes vi partikkel bombardement for å bære dsRNAi konstruerer inn i mais genom. Til dags dato har et stort utvalg av plantearter blitt forvandlet ved hjelp partikkel bombardement, Agrobacterium mediert transformasjon, elektroporering, og mikroinjeksjon metoder. I mais genetisk transformasjon, er partikkel-bombardement-metoden fordelaktig fremfor alle de andre metodene, fordi det er det mest effektive. Partikkel bombardement er ikke avhengig av bakterier, slik at metoden er fritt for biologiske begrensninger som for eksempel størrelsen av genet, arter av genet ellerigin eller planten genotype. Den fysiske transgenet leveringssystem muliggjør høy molekylvekt-DNA og multiple gener for å bli introdusert inn i plante genomer, og i visse tilfeller i kloroplaster med høy transformasjonseffektivitet 19.. Den lignin reduksjon i det vaskulære system av bladet midten av ribben kan visualiseres via scanning elektronmikroskopi (SEM) som er gunstig for behandlingen av topografi og sammensetningen av prøvene.
I maisplanter, to av cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase (ZmCCR1: X98083 og ZmCCR2: Y15069) gener ble funnet i maisgenomet 20. Cinnamoylforbindelser-CoA-reduktase katalyserer omdannelsen av hydroxycinnamoyl-CoA estere i cinnamyl aldehyder. Vi valgte ZmCCR1 genet for å ned-regulere dette enzymet, fordi genet blir uttrykt i alle lignifying vev. De 523 nukleotider ved 3'-terminus av ZmCCR1-genet ble valgt ut for en dsRNAi konstruere fordi de sekvenser som syntes å væremer mangfoldig i forhold til de av ZmCCR2. Dermed vil den dsRNAi konstruere presist binde bare til ZmCCR1, unngå off-target stanse 21. En ZmCCR1_RNAi konstruere ble manipulert inn i cytoplasma uttrykk system ImpactVector1.1-tag (IV 1,1) som inneholder den grønne vev promoter, ribulose-bifosfatase-karboksylase/oksygenase-proteinet-1, 5-bisfosfat karboksylase oksygenase (Rubisco).
For å studere effektene av den dsRNAi konstruere den transgene planter ble lignininnhold kvantifisert. Den Klason (syre-uløselig) lignin-måling er kjent for å være mer nøyaktig enn i de sure vaskemiddel lignin kvantifisering metoder som solubilisere noe av ligninet 22.. Derfor ble Klason lignin målt i transgene maisstengler. Denne fremgangsmåten består av en to-trinns syrehydrolyse som omdanner polymere karbohydrater til monosakkarider 23 oppløselige. Den hydrolysert biomasse ble deretter fraksjonert i syre løselig og uløselig materialerals og syren uløselig lignin ble målt i henhold til tidligere studier 23,24. Ideelt sett bør lignin-analyse omfatter ekstraksjoner med vann og etanol før hydrolyse-trinnet, for vannløselige materialer som kan påvirke resultatene for å fjerne, og en post-hydrolyse forbrenning av ligninet residuet å registrere eventuell aske som finnes i residuet. Uten disse trinn, kan lignin-innholdet i prøven økes kunstig. Den fullstendige fremgangsmåte er presentert her, men for våre eksperimenter var vi ute av stand til å utføre begge disse trinn på grunn av det lille volum av materiale som er tilgjengelig for testing
To andre cellevegg komponenter, cellulose og hemicellulose ble også analysert i lignin nedregulert transgen maislinjer. Det har blitt rapportert at transgene planter som har blitt nedregulert i enten deres fenylalanin ammoniakk-lyase (PAL) 25, 4-coumarate: CoA ligase (4CL) 26, eller cinnamyl enlcohol dehydrogenase (CAD) 27 viser en økning i andre cellevegg-konstruksjonsdeler. Som et første skritt i våre studier, ble krystallinsk cellulose målt ved hjelp av Updegraff metode 28. Denne fremgangsmåten ble opprinnelig utviklet for bestemmelse av cellulose i et stort antall cellulolytic bakterier og sopp. Kort sagt ble de malte mais stocks behandlet med Updegraff reagens (eddiksyre: salpetersyre: vann) for å fjerne hemicellulose, lignin og xylosans. Den krystallinsk cellulose ble fullstendig hydrolysert til glukose via Saeman hydrolyse ved å legge H 2 SO 4. Det krystallinske cellulose ble deretter analysert ved hjelp av den kolorimetriske metoden anthrone 29.. For å kontrollere om den hemicellulose innholdet ble endret, ble monosakkarid ekstrakter fra malte stilker hydrolysert ved anvendelse av trifluoreddiksyre, derivatisert ved hjelp av alditol-acetat-metoden, og deretter analysert ved gasskromatografi (GC) 30. De detaljerte prosedyrer for krystallinsk cellose innhold og matrise polysakkarider sammensetning analyser er beskrevet i Foster et al. (2010) 31.
Her beskriver vi de prosedyrer som brukes for lignin nedregulering i mais via en RNAi teknologi, partikkel bombardement transformasjon, og lignin analyse for akselerert dekonstruksjon av mais lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker for biodrivstoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av dsRNAi konstruerer brukt for nedregulering av ZmCCR1
- Design genet spesifikke primere inkludert nødvendige restriksjonsenzym nettsteder for å lage en dsRNAi konstruere til knock-out på ZmCCR1 genet. To primer settene ble designet for å forsterke to fragment segmenter av ZmCCR1 cDNA:. En 523 bp fragment fra nukleotid 748-1271, og en 285 bp fragment fra nukleotid 986-1271 The ZmCCR1 cDNA ble levert fra Arizona Genome Institute (AGI). Ytterligere detaljer er beskrevet i figur 1.
- Forsterke store fragment av polymerase kjedereaksjon (PCR) fra den ZmCCR1 cDNA malen ved hjelp av primere ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') og ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Forsterke mindre fragment (285 bp) ved hjelp av primere ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') og en ZmCCR1_1271R_SacI (5R17,-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
- Individuelt ligate fragmentene inn pGEM-T Easy følge produsentens anvisninger.
- Utfør mini-prep plasmid DNA isolert fra individuelle transformanter, som hver inneholder det pGEM-T ved bruk av en kommersiell konstruerer mini-prep plasmid kit.
- Fordøy både pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) og ImpactVector (IV) -1.1 (cytoplasma ekspresjonsvektor) med både Bglll og Ncol.
- Å ligere det store fordøyd gelrenset ZmCCR1 fragment (523 bp) i den fordøyde gelrenset IV-1.1.
- Fordøye pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) og IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) med både BglII og Saci for å sette den lille fragmentet i IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Ligere liten fordøyd gelrenset ZmCCR1 fragment (285 bp) i den fordøyde gelrenset IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Klone både 523 bp og 285 bp fragments i IV-1.1 for å gjøre ZmCCR1 RNAi konstruere, som har et 285 bp invertert repetisjonssekvensen med en 238 bp avstandsstykke i midten av de inverterte gjentatte fragmenter (se figur 1).
- Overfør dette konstruere i Escherichia coli (E. coli), vokser dem og utføre et midi-prep størrelse plasmid DNA isolasjon å skaffe nok plasmid DNA for mais genetisk transformasjon.
2. Mais Genetisk Transformation
- Utarbeidelse av Tungsten Partikler
- Plasser 60 mg av wolfram-perler (M10) i et 1,5 ml rør og vask med 1 ml 70% etanol ved å virvle i 2 min. Inkuber i 10 minutter ved 23 ° C og sentrifuger ved 18 894 xg i 2 min og kast supernatanten.
- Vask 3 ganger med 1 ml av 100% etanol, sentrifugering i 2 minutter og fjerner supernatanten. Tilsett 1 ml steril 50% glycerol for å bringe mikropartikkelkonsentrasjon på 60 mg / ml.
- Utarbeidelse av DNA for bombardementet
- Place de 50 pl (3 mg) av wolfram-perler fremstilt i 50% glycerol i et 1,5 ml rør. Tilsett 5 pl (1 pg) av IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi plasmid DNA, 50 pl 2,5 M CaCl 2 og 20 pl 0,1 M spermidin. Vortex kort mellom hver tilsetning av de ovennevnte reagenser.
- Vortex wolfram bead-DNA blandingen raskt og sentrifuger ved 18 894 xg i 30 sek. Hell av supernatanten og resuspender pelleten i 140 pl av 70% etanol. Fjern væsken og kast. Til 140 ul av 100% etanol. Fjern væsken og kast.
- Til 48 ul av 100% etanol. Brukes umiddelbart eller lagre på is i inntil 4 timer før bombingen.
- Bombardement
- Plasser en 3-5 cm diameter Hi-II embryogenic mais calli (tilgjengelig fra Maize transformasjon Center of Iowa State University) i midten på 100 mm petriskåler inneholdende N6OSM mediet 32 (som osmotium) i minst 4 timer før bombardementet.
- Prepare det PSD-1000/He Particle Levering enhet i henhold til produsentens instruksjoner 33.
- Steriliser kammer vegg med 70% etanol. Laste steril 650 psi ruptur disk i sterile holde cap. Spre 5-6 pl av M10-DNA-løsningen på overflaten av en macrocarrier, tørr kort. Laste macrocarrier og stoppe skjermen i mikro lanseringen forsamlingen.
- Plasser mikro lanseringen montering og mais Calli i kammeret ved en valgt avstand fra stoppe skjermen (L2 = 6 cm) og lukk døren. Akselerer i et vakuum på 27 kPa mot en wire mesh sikt.
- Trykk på brann-knappen til ruptur disk bursts og helium manometer synker til null. Slipp brann-knappen.
- Inkuber bombardert calli i en petriskål inneholdende N6OSM (osmotisk medium) 32 i 16 timer i mørke ved 27 ° C. Bryt Calli inn omtrent ti stykker og overføre til N6E (callus induksjon medium) 32 i petriskåler og inkuberes i 5 dager jegn mørke ved 27 ° C.
- Utvalg
- Etter fem dager på N6E, overføre Calli på N6S medium (medievalg) 32. Subkultur all Calli på valg medium hver 30. dag i 8-12 uker uten å forstyrre den Calli struktur.
- Etter omtrent 8-10 uker, vil hvite hurtigvoksende sektor vokse ut av den ikke-formerende, og delvis nekrotisk mor calli. Skjære de hvite raskt voksende vev og subkultur dem til friskt utvalg medium (N6S) 32 og fortsette å ruge som ovenfor.
- Regenerering
- Overfør den hvite og raskt voksende embryonale Calli på regenerering medium 32 og inkuberes som ovenfor for en uke. Slå regenererende embryogenic Calli til en periode på 16 timer dagslys og 8 timers mørke ved 25-27 ° C
- Overfør den regenererende skyter ut mot forankring medium 32 i et glass testrør etter 3-4 uker, fortsetter å inkubere som ovenfor. Etter betydelig root utvikling vises, vaske røtter nøye under vann fra springen, og deretter transplantere plantlets til 4 "potter med jord. Dekk pottene med plastposer for å holde fuktig. Etter to dager lage små hull i plastposer. Etter 5-6 dager fjerne plastposene. Fortsett å ruge som ovenfor for ytterligere 5-6 dager.
- Drivhus
- Overfør spirene til 18 "potter med jord og vedlikeholde i full sommer sollys eller drivhus lys. De opprinnelige regenererte planter er kalt T 0, mens de første frø tilhører T 1 generasjon.
Tre. Histologisk analyse
- Fest mais blad mid-ribber i 5 ml 10% nøytral bufret formalin.
- Prosess og vakuum infiltrere med parafin på en vev prosessor ved hjelp av en vev-prosessor.
- Legge vev i parafin bruker en HistoCentre III embedding stasjonen.
- Fjern det overskytende parafin fra kantene når blokkenKS er avkjølt.
- Seksjon prøven på 4-5 mikrometer med en mikrotom bruker en mikrotom.
- Plasser seksjoner på objektglass og tørt i en 56 ° C inkubator for 2-24 hr. Pass på at delene er helt levd opp til lysbildet.
- Deparaffinize seksjoner i to med xylen for 5 min ved 23 ° C.
- Hydrat kan skyves gjennom to endringer av 100% etanol til 2 min og to endringer av 95% etanol i 2 min ved 23 ° C.
- Skyll delene i rennende vann fra springen i 2 min.
- Flekk med 0,05% toluidinblått O for 1-2 min og skyll kort med DDH 2 O.
- Plasser et dekkglass på prøvene med nedsenking olje og visualisering med lysmikroskopi.
- Scanning elektronmikroskopi (SEM)
- Løser de tverr seksjonert mais blad midten av ribbene i 4% glutaraldehyd og 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,4) ved 4 ° C i 1-2 timer.
- Kort skylle prøvene i buffer, dehydrert dem i enetanolserie (25%, 50%, 75% og 95%) i 10-15 min ved hver gradering og 100% etanol i 10 min, 3x.
- Tørk de dehydrerte kryss-seksjonert mais blad midten av ribbeina i et kritisk punkt tørketrommel bruker flytende karbondioksid som overgangs væske.
- Monter de tørkede prøver på aluminiums stubber ved hjelp av høy vakuum karbon faner
- Smør mais blad midten av ribbeina montert på aluminiums stubber med gull (ca. 20 nm tykkelse) i en frese coater spylt med argon gass.
- Undersøk belagt prøver i en JEOL JSM-6400V (lantan hexaboride elektron emitter) scanning elektronmikroskop.
- Digitale bilder ble avbildet ved hjelp av en analyse Pro-programvare (versjon 3.2).
4. Klason Lignin Måling
- Mill prøvene gjennom en 2 mm sikt.
- Bruk en fuktighets analysator for å bestemme fuktighetsinnholdet i hver prøve og registrere verdien.
- Vei opp ~ 1,5 g av hver prøve, og ta opp massen. EXtract prøvene ved bruk av vann for den første ekstraksjon, etterfulgt av etanol i den andre ekstraksjon ved hjelp av enten en automatisert løsningsmiddel vifte (3 sykluser pr ekstraksjon, ~ 14 min per syklus) eller Soxhlet apparatur (8 timers per ekstraksjon). (Merk: Dette trinnet fjerner ekstraktivstoffer som kan kondensere under syrehydrolyse, og forstyrrer nøyaktig lignin-måling, noe som øker den tilsynelatende Klason lignin-innhold.)
- Tørk de ekstraherte prøvene ved 45 ° C over natten, og deretter la dem avkjøles i eksikatoren, og veie på nytt.
- Sett en inkubator til 30 ° C. Mål 0,3 g av hver tørr, ekstraherte prøven inn skrue-top høytrykksrørene (triplicates per prøve er anbefalt) og ta opp vektene til nærmeste 0,1 mg. Tilsett 3 ml av 72% H SO 2 4 til hvert trykkrør.
- Bland prøven ved hjelp av en glass-eller teflonrørestav. La rørestav i røret før vann tilsettes etter inkubasjon.
- Plasser hetteglassene i en inkubator set til 30 ° C og 150 rpm i 60 min. Etter 1 time legg 84 ml deionisert vann for å fortynne syrekonsentrasjonen til 4% og blandes med rørestav. Vær forsiktig så du ikke å forlate store mengder prøven på sidene av hetteglasset over vannlinjen.
- Tett forsegle stopperne på alle hetteglassene og plassere dem i en metallstativ eller store kanner. Autoklav ved 121 ° C ved hjelp av et flytende steriliseringssyklus i 1 time. La dem avkjøles til romtemperatur før du åpner.
- Pre-aske filtrerings digler i en ovn ved 575 ° C i minst 4 timer. Tillat digler for å kjøle i en eksikator i minst en time.
- Vakuum filtrere løsningen fra hvert rør via en separat digel, ved hjelp av en gummi-adapter for å feste digelen. Bruk avionisert vann for å skylle eventuelt gjenværende partikler fra røret.
- Tørk lignin residuet ved 105 ° C i minst 4 timer. Noter vekten av den tørre digelen og rester.
- Hvis du bruker en 575 ° C, pre-Brann prøvene enn en gassbrenner til det ikke er røyk eller aske og deretter plassere i ovnen i 24 timer, eller hvis du bruker en programmerbar ovn, ikke pre-aske og bruker følgende program:
- Rampe fra romtemperatur til 105 ° C og holder i 12 min.
- Rampe til 250 ° C ved 10 ° C / min og hold i 30 min.
- Rampe til 575 ° C ved 20 ° C / min og hold i minst 180 min.
- Fjern digler fra ovnen og avkjøl i en eksikkator. Vei smeltedigelen og aske.
- Beregn syre uoppløselige resten ved hjelp av følgende ligning:
M PRE = Masse av pre-utvunnet av biomasse
M POST = Masse av post-utvunnet av biomasse
M VIAL = Mass of hentet biomasse tilsatt hetteglasset
M-rest = Masse av digel og lignin residue
M ASH = Masse av digel og aske
MC = Fuktighetsinnholdet i pre-ekstrahert biomasse, total vektbasis
5. Karbohydrat Analysis
- Utfør cellevegg karbohydrat analyser basert på Foster et al. (2010) protokoll 31. I korte trekk, Forbered alkohol uløselig rester fra fryse tørket plantemateriale. Deretter hydrolyserer materialet med trifluoreddiksyre og samsvarer med de oppløseliggjorte monosakkarid-derivater til de tilsvarende acetater alditol. Analyser disse flyktige derivater ved hjelp av gasskromatografi (GC) som er koplet til en firedoble massespektrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har vist en reduksjon i lignin-innholdet i maisplanter via RNAi. Partikkel bombardement transformasjon metoden ga rundt 30% trnasformation effektivitet. Genet stanse av ZmCCR1 ble konsekvent observert i T0-T2 generasjoner. Lignin redusert transgenics vokste på samme måte som villtype maisplanter unntatt for visning brun farge i blad midten av ribben, skrelle, og stammen. Histologisk analyse har vist at de mutante linjer utviser en signifikant reduksjon i celleveggtykkelse av de sclerenchyma fibrene i mais blad midten av ribben 18. Til tross for reduksjon av celleveggtykkelse, har strukturen av andre store vaskulære systemer, inkludert Margen fartøyet, barken og kappe-celler viste ingen forskjeller i forhold til villtype kontroll (figur 2A) 18. Dette innebærer at det ikke er noen skadelige effekter for enten vann transport, næringstransport, eller mekanisk styrke til stilkene jegn de ZmCCR1_RNAi mutant linjer.
Ligninet innholdet ble kvantifisert ved hjelp av en Klason lingin måling. Figur 3 viser mengden syre-uløselige Klason lignin (g / kg con Stover) i villtype mais og ZmCCR1_RNAi transgene linjer (T1). Tre transgene linjer (1c-4, -5 og -6) viste en statistisk signifikant reduksjon av lignin (8,1%, 7,0% og 8,7% henholdsvis) sammenlignet med villtype maisplanter 18. For å avgjøre om karbonstrømmen ble flyttet fra ligninet biosyntetiske vei til celleveggen karbohydrat biosyntese trasé, ble cellulose analysert via Updegraff metoden. Figur 3A viser at to ZmCCR1_RNAi mutant linjer (1b-6 og 1c-6) inneholdt betydelig økte nivåer av krystallinsk cellulose (1,5 og 1,8 ganger henholdsvis) 18. Den hemicellulose-innhold ble også analysert. Figur 4B viser mengden av fire hovedkomponenter (hemicellulosearabionose, xylose, galaktose, og glukose). Ingen av de fire karbohydratgruppene viste noen endring i de mutante linjene 18.
Figur 1 Kloning strategi for dsRNAi plasmidkonstruksjoner for ned-regulering av ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulose-bifosfatase-karboksylase/oksygenase-proteinet promoter fra Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RbcS1: ribulose-bifosfatase-karboksylase/oksygenase-proteinet liten enhet terminator fra Asteraceous krysantemum. Dette tallet har blitt forandret fra Park et al (2012) 18.
Figur 2. Fenotypisk analyse av villtype mais (Hi-II) og ZmCCR1_RNAimutant blad midrib. A) Brun farge ble sett i ZmCCR1 nedregulert mais blader, stilker og korn skall. B) De tverr seksjonert mais blad midribs av villtype HI-II (til venstre) og ZmCCR1_RNAi mutant linjen (til høyre) ble farget med 0,05% toluidinblått O for en min for å visualisere sekundære Xylem vev. Den røde pilhode angir celleveggene i sclerenchyma fibre av bladet midrib. (C) Scanning elektronmikroskopi (SEM) av ZmCCR1 nedregulert transgen mais blad midrib (til høyre) i forhold til det av villtype ikke-transgen plante kontroll (venstre). Den røde pilen indikerer sclerenchyma fibre. Dette tallet har blitt forandret fra Park et al. (2012) 18.
Figur 3. Klason lignin målinger (ACId-uløselig lignin innholdet) av villtype HI-II og ZmCCR1_RNAi mutant. De tre mutant linjer 1c 1c-5, og 1c-6 hadde statistisk lavere lignininnhold, 8,5%, 7,5% og 9,2% henholdsvis, som prosent av tørrstoff i forhold til villtype kontroll-planter. Gjennomsnitt ± standard avvik (P <0,05, n = 3). Dette tallet har blitt forandret fra Park et al. (2012) 18.
Figur 4. Cellevegg kompositorisk analyser. A) krystallinsk cellulose analyse av ZmCCR1_RNAi linjer (Tukey sin parvise sammenligninger, * P <0,05, n = 3). B) Hemicellulose kompositoriske analyse av vill type mais og ZmCCR_RNAi transgene maislinjene (T1) via gasskromatografi (GC). De viktigste toppene fra kromatogrammene were integrert, identifisert basert på retensjonstidene og fragment ion signaturer, og uttrykt som mol prosent (P> 0,05, n = 3) (Tukey sin parvise sammenligninger, P> 0,05, n = 3). Dette tallet har blitt gjenbrukt fra Park et al. (2012) 18.
Figur 5 Prosent sukker (glukan-og xylan) konverteringer for ubehandlet (UT), og AFEX TM-forbehandlet (90 ° C, 5 min) mais Stover ved forskjellige konsentrasjoner av ammoniakk (1.0:. 1,0 g NH 3: g tørr biomasse 1.5: 1.5 g NH 3:. g tørr biomasse) Feil søylene representerer standardavviket til gjennomsnittet og er basert på to gjentak for de ubehandlede prøver og fire gjentak (to forbehandling gjentak med to hydrolyse gjentak) for forbehandlet prøvene. Forbehandlet sukker konverter(24 timer eller 72 timer) som er merket med forskjellige bokstaver er statistisk forskjellig basert på Tukey største parvise sammenligninger (P <0,05). Dette tallet har blitt gjenbrukt fra Park et al. (2012) 18.
| Media | Kjemiske sammensetninger |
| N6OSM | 4 g / L N6 salter |
| (Salt medium) | 1 ml / L N6 vitamin lager |
| 2 mg / l 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 0,69 g / L proline | |
| 30 g / L sukrose | |
| 100 mg / L kasein hydrolysat | |
| 36,4 g / L sorbitol | |
| 36,4 g / L mannitol | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Legg filter sterilisert sølvnitrat (25 mm) etter autoklavering | |
| N6E | 4 g / L N6 salter |
| (Callus induksjon) | 1 ml / l (1000 x) N6 vitamin lager |
| 2 mg / l 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 2,76 g / L proline | |
| 30 g / L sukrose | |
| 100 mg / L kasein hydrolysat | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Legg filter sterilisert sølvnitrat (25 mm) etter autoklavering | |
| N6S media | 4 g / L N6 salter |
| (Utvalg media) | 1 ml / L N6 vitamin lager |
| 2 mg / l 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| <td> 0,69 g / L proline | |
| 30 g / L sukrose | |
| 100 mg / L kasein hydrolysat | |
| 36,4 g / L sorbitol | |
| 36,4 g / L mannitol | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Legg filter sterilisert sølvnitrat (25 mm) etter autoklavering | |
| Regenerering medium | 4,3 g / L MS salter |
| 1 ml / L (1000x) MS vitamin lager | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 60 g / l sukrose | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriplater) | |
| Legg filter sterilisert bialaphos (3 mg / L) lagt etter autoklavering | |
| Rooting medium | 4,3 g / L MS salter |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 30 g / L sukrose | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriplater) | |
| 10% nøytral buffret formalin | 100 ml formalin |
| (1 liter) | 900 ml DDH 2 O |
| 4,0 g natrium-dihydrogenfosfat, monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O) |
Tabell 1. Fortegn spesifikke reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilgjengeligheten av mikrobielle cellulaser å plante cellevegg polysakkarider er i stor grad avhengig av i hvilken grad de er forbundet med fenoliske polymerer 23. Konverteringskursen fra lignocellulose biomasse til gjæringsdyktig sukker er negativt korrelert med lignin innhold deponert i plante secondadry celleveggene. Denne korrelasjon er henført til de fysikalske egenskaper av lignin slik som hydrofobisitet 24, kjemisk heterogenitet, og fraværet av vanlig hydrolyserbar intermonomeric leddene 25..
I denne studien, en dsRNAi teknikk indusert ulike nivåer av genet nedregulering på genetiske mål. Lignin nedregulering, formidlet av en ZmCCR1_RNAi konstruere, har resultert i den brune-farge i T1 transgneic linjer. Brun-midrib (bm) farge er et naturlig fenomen som er forårsaket av redusert lignin-innhold og endres lignin sammensetning. I motsetning til andre naturlig occurred bm mutanter, som viser den brune fargen bare i blad midten av ribbeina, de ZmCCR1_RNAi mutant linjene avslørte fenotype i andre deler av anlegget, inkludert stilkene og agner. Histologisk analysen viste også at sclerenchyma celleveggtykkelse på ZmCCR1 nedregulert blader var mye mindre enn de av vill type kontroll planter (figur 2a). Imidlertid sturucture og celleveggtykkelsen av hoved vaskulære systemer inclduing Xylems fartøy, barken eller kappe-celler ble ikke endret. Dette kan forklare den normale veksten av ZmCCR1_RNAi transgene linjer som vokste normalt i form av plantehøyde og stammediameter.
En reduksjon på mer enn 20% i lignin-innhold har vanligvis forårsaket et tap av biomasse og gjort plantene mer sårbare mot mikrobielle patogener og skadedyr 27,28. Men, produserte de muterte linjer i denne forskningen, uttrykker mindre enn en 10% lignin reduksjonenpå, ikke kompromittere plantebiomasse og defensiv mekanisme mot abiotiske og biotiske påkjenninger.
Tidligere studier har vist at transgene tobakk linjer med vesentlig nedsatt CCR uttrykk viste også en økning av andre cellevegg bestanddeler som glukose, xylose, og vegg-bundet fenoliske forbindelser (f.eks sinapic og ferulic acids). I denne studien, økte mild lignin reduksjon i nivået av krystallinsk cellulose i noen av de ZmCCR1 nedregulert maisplanter. Motsatt kan en cellulose kompensasjon mekanismen ble også observert i Arabidopsis mutanter som utstilt utenfor livmoren lignification når cellulose syntese gener var defekt 35. De kvantitative eller kvalitative endringer av en cellevegg karbohydrat komponent induserer veksling av andre komponenter 36. Slike kompensasjons mechansims er viktig å maintan homeostase av plante vaskulære systemer. Men i denne studien, hemicelluloSES viste ingen statistisk signifikante endringer i ZmCCR1 nedregulert mutant linjer. Dette resultatet kan være at det observerte lignin reduksjonen var ikke tilstrekkelig til å utløse ytterligere hemicellulose syntese.
Den redusert nivå av lignin og økt krystallinsk cellulose nivå ville være dobbelt gunstig for produksjon av biodrivstoff. De lavere lignin innholdet ville kreve færre innganger (f.eks H 2 SO 4, cellulaser, etc.) under behandlingen og lette biomasse konverteringsprosessen. Den ekstra cellulose kan øke utbyttet av fermenterbare sukkere. Den genetisk manipulering av ZmCCR1 beskrevet i denne studien kan iverksettes for å bidra til å gjøre lignocelluosic bimoass avledet bioetanol mer kommersielt konkurransedyktig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Den mikroskopiske bildebehandling ble gjennomført via tjenestene til Michigan State University Center for Advanced Mikros. Mais callus ble kjøpt fra Mais Transformation Center of Iowa State University. Forfatterne ønsker å takke Jeffrey R. Weather av MSU Plant Research Laboratory for sin teknisk assistanse på karbohydrat analyse. Denne forskningen ble sjenerøst finansiert av Corn Marketing Program of Michigan (CMPM) og Consortium for Plant Biotechnology forskning (CPBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N6OSM (Osmotic medium) | Made in-house | ||
| N6E (Callus induction) | Made in-house | ||
| N6S media (Selection media) | Made in-house | ||
| Regeneration medium | Made in-house | ||
| Rooting medium | Made in-house | ||
| 10% Neutral buffered formalin (1 L) | Made in-house | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device | Hercules, CA, United States | ||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Jena, Germany | For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software. | |
| Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| HistoCentre III Embedding Station | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| Microtome Model Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, United States | ||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 | Ashford, Kent, England | ||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope | JEOL Ltd., Tokyo, Japan | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| MA35 Moisture Analyzer | Sartorius | ||
| Critical point dryer, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States | ||
| Screw-top high pressure tubes | Ace Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Screw-top high pressure tube plugs | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
References
- Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
