Summary
En dobbeltstrenget RNA-interferens (dsRNAi) teknik anvendes til at nedregulere majs cinnamoyl coenzym A reduktase (ZmCCR1) genet til lavere plante lignin-indhold. Lignin nedregulering fra cellevæggen visualiseres ved mikroskopiske analyser og kvantificeres ved Klason metoden. Sammensætningsmæssige ændringer i hemicellulose og krystallinsk cellulose analyseres.
Abstract
For at lette anvendelsen af lignocelluloseholdige biomasse som et alternativ bioenergiressource under biologiske omdannelsesprocesser, er der behov for et forbehandlingstrin til at åbne strukturen af plantecellevægge, øge tilgængeligheden af cellevæggen kulhydrater. Lignin, en polyphenolisk materiale til stede i mange cellevæg typer, er kendt for at være en væsentlig hindring for enzym adgang. Reduktion i lignin-indhold til et niveau, der ikke interfererer med den strukturelle integritet og forsvar af anlægget kan være et værdifuldt skridt til at reducere omkostningerne til bioethanol. I denne undersøgelse har vi genetisk nedreguleret en af lignin-biosyntese-gener, cinnamoyl-CoA-reduktase (ZmCCR1) via en dobbeltstrenget RNA-teknik interferens. Den ZmCCR1_RNAi konstruktionen blev integreret i majs genomet ved hjælp af partikel-bombardement metoden. Transgene majsplanter voksede normalt i forhold til planterne kontrol vildtype uden iterfering med vækst biomasse eller forsvarsmekanismer, med undtagelse af visning af brun-farvning i transgene planter blad midten ribben, avner og stilke. De mikroskopiske analyser, sammenholdt med den histologiske analyse, viste, at de blad sclerenchyma fibrene blev fortyndet men strukturen og størrelsen af andre vigtige vaskulære systemkomponenter blev ikke ændret. Ligninindholdet i transgen majs blev reduceret med 7-8,7%, blev indholdet af krystallinsk cellulose øges som reaktion på lignin reduktion og hemicelluloser forblev uændret. Analyserne kan indikere, at kulstof flow kunne have været flyttet fra lignin biosyntese til cellulose biosyntese. Denne artikel afgrænser de procedurer, der anvendes til at nedregulere lignin indhold i majs via RNAi teknologi og cellevæggen kompositoriske analyser bruges til at kontrollere effekten af ændringerne på cellens væg struktur.
Introduction
Produktionen af biobrændstoffer fra lignocellulose biomasse er meget ønskeligt på grund af sin nuværende overflod i USA 1, og i tilfælde af en bæredygtig høst af restprodukter fra landbrug og skovbrug, evnen til ikke at konkurrere direkte om dyrkede arealer, der anvendes til produktion af foder mad og dyr. Men i modsætning til majs korn, som er den vigtigste kilde til biobrændstof i øjeblikket genereres i USA, er lignocellulosematerialer betydeligt mere kompleks og vanskelig at bryde ned. Ud over de langkædede kulhydrater, cellulose og hemicellulose, som er de vigtigste kilder til sukkerarter ved fermentering af lignocellulosematerialer, mange typer af plantecellevægge også indeholder lignin, en phenylpropanoid polymer, som giver styrke, forsvar mod patogen angreb, og hydrofobicitet til celle vægge. Mens der er nødvendige for planternes vækst og overlevelse, lignin præsenterer også en væsentlig barriere for en vellykket enzymatisk omdannelse af cellulose og hemicellutabe til opløselige sukkerstoffer. Materialer med høj lignin indhold er generelt mindre ønskværdige materialer til både biobrændstof (gennem biologisk konvertering veje) og papirmasse-og papirindustrien på grund af de negative indvirkninger på forarbejdning egenskaber og produktkvalitet. Derfor kan genetisk manipulation af plantematerialer for lignin reduktion på et niveau, der ikke interfererer med afgrøde strukturel styrke og forsvarssystemer være vigtig for nedbringelse af produktionsomkostningerne for både lignocellulose biobrændstof og papirmasse-og papirindustrien.
I majs (Zea mays), lignin er kovalent krydsbundet til hemicellulose i den primære cellevæg via ferulate og diferulate broer 2. Lignin-hemicellulose kompleks binder til cellulosemikrofibrillerne via hydrogenbindinger til dannelse af en kompleks matrix, som giver integritet og styrke til den sekundære cellevæg. Den mekaniske styrke af plantecellevægge bestemmes i høj grad af den type lignin subunits 3-5. I tidligere undersøgelser har ændre proportionerne lignin underenheder vist nogen klar tendens på enzymatisk fordøjelighed 6-11. Men reduktioner i lignin-indhold viser generelt en forbedring af konverteringer 12,13 og kan være en nøgle til at øge fordøjeligheden af plantemateriale af hydrolytiske enzymer, herunder endocellulases, cellobiohydrolaser og β-glucosidaser 14.
Gensplejsning at regulere ekspressionsniveauet af transkripter er blevet grundigt praktiseres for at forbedre afgrøde træk. Avancerede teknikker, herunder anti-sense 15 og co-undertrykkelse 16, at muliggøre effektiv nedregulering af target gener. Komplet gen knock-out er også opnået ved hjælp af genkonstruktioner, der koder intron-splejset RNA med en hårnål struktur 17. Desuden en dobbeltstrenget RNA-interferens (dsRNAi) teknik, dvs en kraftfuld og effektiv genekspression mediertor, der virker ved enten målretning transkript nedbrydning eller oversættelse undertrykkelse, tilvejebringer et potent middel til at inducere en bred vifte af undertrykkelse virkninger på target mRNA 18. Gendæmpning teknikker viser flere begrænsninger. Disse teknikker ikke nøjagtigt regulere størrelsen af transkription, og det kan forårsage uventede lyddæmpningsvarianter virkninger på andre homologe gener.
I denne fremgangsmåde anvendte vi partikelbombardement at bære dsRNAi konstruktionerne i majs-genomet. Til dato har en bred vifte af plantearter succes blevet transformeret ved hjælp af partikel-bombardement, Agrobacterium-medieret transformation, elektroporation, og mikroinjektion metoder. I majs genetisk transformation, er partikelbombardement metode er fordelagtig i forhold til alle de andre metoder, fordi det er den mest effektive. Partikelbombardement er ikke afhængig af bakterier, så fremgangsmåden er fri for biologiske begrænsninger såsom størrelsen af genet arter af genet ellerigin eller planten genotype. Den fysiske transgen system gør DNA med høj molekylvægt og flere gener, der skal indføres i plantegenomer og i visse tilfælde ind i chloroplaster med høj transformationseffektivitet 19. Lignin reduktion i det vaskulære system af bladet midten ribben kan visualiseres via scanning elektronmikroskopi (SEM), som er gavnlige for behandlingen af topografien og sammensætningen af prøver.
I majsplanter, to af cinnamoyl-CoA reduktase (ZmCCR1: X98083 og ZmCCR2: Y15069) gener blev fundet i majsgenomet 20. Cinnamoyl-CoA reduktase katalyserer omdannelsen af hydroxycinnamoyl-CoA estere i cinnamyl aldehyder. Vi valgte ZmCCR1 genet nedregulere dette enzym, fordi genet udtrykkes i alle lignifying væv. De 523 nukleotider i 3'-enden af ZmCCR1 genet, blev valgt til en dsRNAi konstruere fordi sekvenserne viste sig at væremere forskelligartet i forhold til de af ZmCCR2. Således ville dsRNAi konstruktion præcist binder kun til ZmCCR1, undgå off-target lyddæmpning 21. En ZmCCR1_RNAi konstruktion blev splejset ind i cytoplasmatiske ekspressionssystem ImpactVector1.1-tag (IV 1.1) indeholdende grønne vævsspecifik promotor, ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase oxygenase (RuBisCO).
At studere virkningerne af dsRNAi konstruere transgene planter, blev indholdet lignin kvantificeres. Klason (syre-uopløselige) lignin måling er kendt for at være mere præcis i forhold til de sure detergent lignin kvantificering som solubiliserer noget af lignin 22. Derfor Klason lignin blev målt i transgene majsstængler. Denne procedure består af en to-trins syrehydrolyse, der konverterer polymere kulhydrater til opløselige monosaccharider 23. Den hydrolyserede biomasse blev derefter fraktioneret i syre opløselige og uopløselige materialerAls og syre uopløselige lignin blev målt i henhold til tidligere undersøgelser 23,24. Ideelt set bør lignin analysen indeholde ekstraktioner med vand og ethanol før hydrolysetrinnet for at opløselige materialer, som kan interferere med resultaterne fjerne, og en post-hydrolyse forbrænding af lignin remanensen tage hensyn til eventuel aske stede i remanensen. Uden disse trin, kan indholdet af prøven lignin kunstigt oppustet. Den fulde metode præsenteres her, men for vores eksperimenter, vi var ude af stand til at udføre begge disse trin på grund af den lille mængde materiale til rådighed for testning
To andre cellevægskomponenter, cellulose og hemicellulose blev også analyseret i lignin nedreguleret transgene majs. Det er blevet rapporteret, at transgene planter, som er blevet ned-reguleret i enten deres phenylalanin ammoniak-lyase (PAL) 25, 4-coumarat: CoA-ligase (4CL) 26 eller cinnamyl enlkohol dehydrogenase (CAD) 27 viser en stigning i andre celle væg strukturelle komponenter. Som et første skridt i vores studier blev krystallinsk cellulose målt ved hjælp af Updegraff metode 28. Denne fremgangsmåde blev oprindeligt udviklet til bestemmelse af cellulose i et stort antal af cellulolytiske bakterier og svampe. Kort fortalt blev de formalede af majs behandlet med Updegraff reagens (eddikesyre: salpetersyre: vand) for at fjerne hemicellulose, lignin og xylosans. Den krystallinske cellulose blev fuldstændig hydrolyseret til glucose via Saeman hydrolyse ved tilsætning af H 2 SO 4. Det krystallinske cellulose blev derefter analyseret under anvendelse af den kolorimetriske anthron metode 29. At kontrollere, om hemicellulose indhold blev ændret, blev monosakkarid uddrag fræsede stilke hydrolyseret hjælp trifluoreddikesyre, derivatiseret ved hjælp af alditol acetat metode og derefter analyseret ved gaskromatografi (GC) 30. De detaljerede procedurer for krystallinsk cellulose indhold og matrix polysaccharider sammensætning analyser er beskrevet i Foster et al. (2010) 31.
Her beskriver vi de anvendte procedurer for lignin nedregulering i majs via en RNAi teknologi, partikel bombardement transformation, og lignin analyse for accelereret dekonstruktion af majs lignocellulose biomasse til forgærbare sukkerarter til biobrændstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af dsRNAi konstruktioner Brugt til nedregulering af ZmCCR1
- Design genspecifikke primere, herunder nødvendige restriktionsenzymsteder for at gøre en dsRNAi konstruere til knock-out ZmCCR1 genet. To primersæt blev designet til at forstærke to fragment segmenter af ZmCCR1 cDNA:. Et 523 bp fragment fra nukleotid 748-1271, og en 285 bp fragment fra nukleotid 986-1271 The ZmCCR1 cDNA blev taget fra Arizona Genome Institute (AGI). Flere detaljer er beskrevet i figur 1..
- Forstærk det store fragment ved polymerasekædereaktion (PCR) fra ZmCCR1 cDNA-skabelon ved anvendelse af primerne ZmCCR1_748F_BglII (5'-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 ') og ZmCCR1_1271R_NcoI (5'-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3'). Forstærk mindre fragment (285 bp) ved anvendelse af primerne ZmCCR1_986F_BglII (5'-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 ') og en ZmCCR1_1271R_SacI (5R17-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 ').
- Individuelt ligere fragmenterne i pGEM-T Easy efter fabrikantens anvisninger.
- Udfør mini-prep-plasmid-DNA isoleret fra individuelle transformanter, som hver indeholder pGEM-T-konstruktioner under anvendelse af et kommercielt mini-prep plasmid kit.
- Skær både pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) og ImpactVector (IV) -1.1 (cytoplasma ekspressionsvektor) med både BglII og NcoI.
- Ligere det store fordøjet geloprenset ZmCCR1 fragment (523 bp) i det fordøjede geloprenset IV-1.1.
- Fordøje pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) og IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) med både BglII og SacI for at indsætte det lille fragment ind i IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Ligere lille fordøjet geloprenset ZmCCR1 fragment (285 bp) i det fordøjede geloprenset IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp).
- Klon både 523 bp og 285 bp fragmenteringts til IV-1.1 at gøre ZmCCR1 RNAi konstruere, som har en 285 bp omvendte repetitioner sekvens med en 238 bp spacer i midten af de inverterede gentagne fragmenter (se figur 1).
- Overfør denne konstruktion i Escherichia coli (E. coli), dyrke dem og udføre en midi prep størrelse plasmid-DNA isoleret for at opnå nok plasmid DNA til majs genetisk transformation.
2.. Majs Genetic Transformation
- Fremstilling af wolframpartikler
- Placer 60 mg wolfram-perler (M10) i et 1,5 ml rør og vaskes med 1 ml 70% ethanol ved hvirvelbehandling i 2 min. Inkuber i 10 minutter ved 23 ° C, hvorefter der centrifugeres ved 18.894 x g i 2 minutter, og supernatanten.
- Vask 3 gange med 1 ml 100% ethanol, centrifugering i 2 minutter og kassere supernatanten. Der tilsættes 1 ml steril 50% glycerol for at bringe mikropartiklen koncentrationen til 60 mg / ml.
- Fremstilling af DNA til Bombardement
- Place de 50 pi (3 mg) af wolfram perler forberedt i 50% glycerol i et 1,5 ml rør. Tilsæt 5 pi (1 mg) af IV-1.1 :: ZmCCR1 RNAi plasmid-DNA, 50 ul 2,5 M CaCI2 og 20 pi 0,1 M spermidin. Vortex kortvarigt mellem hver tilsætning af de ovennævnte reagenser.
- Vortex tungsten perle-DNA-blanding kortvarigt og centrifugeres ved 18.894 xg i 30 sek. Hæld supernatanten og resuspender pellets i 140 pi 70% ethanol. Fjern væsken og kasseres. Tilsættes 140 pi 100% ethanol. Fjern væsken og kasseres.
- Tilføj 48 pi 100% ethanol. Anvendes straks eller opbevares på is i op til 4 timer før bombardementet.
- Bombardement
- Placer en 3-5 cm i diameter Hi-II embryogen majs calli (forudsat fra majstransformation Center of Iowa State University) i midten af 100 mm petriskåle indeholdende N6OSM medier 32 (osmotium) mindst 4 timer før bombardementet.
- Prepare den PSD-1000/He Particle Delivery indretning ifølge producentens anvisninger 33.
- Steriliser kammervæg med 70% ethanol. Load steril 650 psi brud disk i steril omløberen. Spred 5-6 pi af M10-DNA-opløsning på overfladen af en makrobæreren, tør kortvarigt. Load makrobæreren og stoppe skærmen i mikrobærer lanceringen forsamling.
- Placer mikrobærer lanceringen montage og majs gyder i kammer ved en valgt afstand fra indstilling skærmen (L2 = 6 cm) og luk lågen. Accelerate i et vakuum på 27 psi mod et trådnet.
- Tryk på brand-knappen, indtil brud disk brister og helium manometer falder til nul. Slip brand knappen.
- Inkubér bombarderet calli i en petriskål indeholdende N6OSM (osmotisk medium) 32 i 16 timer i mørke ved 27 ° C. Bryde calliene i omkring ti stykker og overføre til N6E (callusinduktion medium) 32 i petriskåle og inkuberes i 5 dage jegn mørke ved 27 ° C.
- Selection
- Efter 5 dage på N6E overføre calliene onto N6S medium (udvælgelse medier) 32. Subkultur alle calli på udvælgelse medium hver 30 dage for 8-12 uger uden at forstyrre calliene struktur.
- Efter ca 8-10 uger, vil hvide hurtigtvoksende sektorer vokse ud af den ikke-prolifererende og delvist nekrotisk mor gyder. Udskære hvide hurtigtvoksende væv og videredyrke dem til frisk selektionsmedium (N6S) 32 og fortsætte med at udruge som ovenfor.
- Regeneration
- Overfør det hvide og hurtigt voksende embryonale kalli på regenereringsmedium 32 og inkuberes som ovenfor til 1 uge. Skift regenererende embryogeniske gyder til en periode på 16 timer dagslys og 8 timers mørke ved 25-27 ° C
- Overfør regenererende skud på forankring medium 32 i et reagensglas efter 3-4 uger, fortsætter med at inkubere som ovenfor. Efter væsentlig root udvikling synes, vask rødderne grundigt under vandhanen, så omplante småplanterne til 4 "potter med jord. Dæk potterne med plastposer til at holde fugtig. Efter 2 dage gøre små huller plastikposer. Efter 5-6 dage fjernes plastikposer. Fortsæt med at udruge som ovenfor i yderligere 5-6 dage.
- Greenhouse
- Overfør frøplanter i 18 "potter med jord og opretholde fuld sommer sollys eller drivhus lys. De første regenererede planter kaldes T 0, mens de første frø tilhører T 1 generation.
3.. Histologisk Assay
- Fastgør majs blad midten ribben i 5 ml 10% neutral bufferet formalin.
- Proces-og vakuum infiltrere med paraffin på en vævsprocessor hjælp af en vævsprocessor.
- Indlejre vævet i paraffin under anvendelse af en HistoCentre III indlejring station.
- Fjern den overskydende paraffin fra kanterne, når blokks afkøles.
- Afsnit prøve ved 4-5 um med en mikrotom anvendelse af en mikrotom.
- Placer afsnit om objektglas og tørre i en 56 ° C inkubator i 2-24 timer. Sørg sektioner er fuldt levet op til diaset.
- Afparaffiner sektioner i to skift af xylen i 5 minutter ved 23 ° C.
- Hydrate glider gennem to skift af 100% ethanol i 2 minutter og to skift af 95% ethanol i 2 min ved 23 ° C.
- Skyl afsnittene i rindende vand i 2 min.
- Pletten med 0,05% toluidinblåt O i 1-2 min og kort skylles med Hedeselskabet 2 O.
- Placer et dækglas på prøverne med fordybelse olie og visualisering med lysmikroskopi.
- Scanning Electron Microscopy (SEM)
- Fix tværsnit majs blad midten ribben i 4% glutaraldehyd og 0,1 M natriumphosphatpuffer (pH 7,4) ved 4 ° C i 1-2 timer.
- Kort skylles prøverne i bufferen, dehydrerede dem i enethanol-serien (25%, 50%, 75% og 95%) i 10-15 minutter ved hver trindeling og 100% ethanol i 10 minutter, 3x.
- Tør dehydrerede tværsnit majs blad midten ribben i et kritisk punkt tørretumbler brug af flydende kuldioxid som overgangs væske.
- Monter de tørrede prøver på aluminium stubbe ved hjælp af høj vakuum carbon faner
- Smør majs blad midten ribben monteret på aluminium stubbe med guld (ca. 20 nm tykkelse) i en pådampningsbelægningsmaskine med argon gas.
- Undersøg de coatede prøver i et JEOL JSM-6400V (lanthan hexaboride elektron emitter) scanning elektron mikroskop.
- Digitale billeder blev afbilledet ved hjælp af en analyse Pro-software (version 3.2).
4.. Klason Lignin Measurement
- Mill prøverne gennem en 2 mm sigte.
- Brug en fugt analysator at bestemme indholdet af hver prøve fugt og registrere værdien.
- Afvej ~ 1,5 g af hver prøve og optage masse. EXtract prøverne anvendelse af vand til den første ekstraktion efterfulgt af ethanol til den anden ekstraktion ved hjælp af enten en automatiseret opløsningsmiddel emhætte (3 cyklusser per udvinding, ~ 14 min per cyklus) eller Soxhlet-apparat (8 timers per ekstraktion). (Bemærk: Dette trin fjerner ekstraktiver der kan kondensere under sur hydrolyse og forstyrre nøjagtig lignin måling, øge den tilsyneladende Klason lignin indhold.)
- Tør de udtrukne prøver ved 45 ° C natten over, og derefter lade dem afkøles den i ekssikkator og vejer igen.
- Indstil en inkubator til 30 ° C. Mål 0,3 g af hver tørre, ekstraherede prøve i skruelågsglas højtryks rør (tre eksemplarer pr prøve anbefales) og registrere vægtene til nærmeste 0,1 mg. Tilsæt 3 ml 72% H 2 SO 4 til hvert trykrør.
- Prøven blandes ved hjælp af et glas eller Teflon stir stang. Lad røre stangen i røret, indtil vand tilsættes efter inkubation.
- Placer hætteglas i en inkubator set til 30 ° C og 150 rpm i 60 min. Efter 1 time tilsættes 84 ml deioniseret vand for at fortynde syrekoncentrationen til 4% og blandes med røre stangen. Vær omhyggelig med ikke at efterlade store mængder af prøven på siderne af hætteglasset over vandlinjen.
- Tæt forsegle propperne på alle hætteglas og placere dem i en metal rack eller store bægre. Autoklave ved 121 ° C ved anvendelse af en flydende steriliseringscyklus i 1 time. Lad dem køle af til stuetemperatur før åbning.
- Pre-aske filtrering digler i en ovn ved 575 ° C i mindst 4 timer. Lad digler at afkøles i ekssikkator i mindst en time.
- Vakuum foretage opløsning fra hvert rør gennem en særskilt smeltedigel, ved hjælp af en gummi-adapter til at sikre filterdigelen. Brug deioniseret vand til at skylle eventuelle resterende partikler fra røret.
- Tør lignin rest ved 105 ° C i mindst 4 timer. Man noterer vægten af den tørre digel og restprodukt.
- Hvis du bruger en 575 ° C, førBrand prøverne over en bunsenbrænder indtil der ikke er røg eller aske og derefter placere i ovnen i 24 timer, eller hvis du bruger en programmerbar ovn, ikke pre-aske og bruge følgende program:
- Rampe fra stuetemperatur til 105 ° C og hold i 12 min.
- Rampe til 250 ° C ved 10 ° C / min og hold i 30 min.
- Rampe til 575 ° C ved 20 ° C / min og holde i mindst 180 min.
- Fjern smeltedigler fra ovnen og afkøles i ekssikkator. Smeltediglen og aske afvejes.
- Beregn syre uopløselige rest ved hjælp af følgende ligning:
M PRE = Masse af præ-udvundet biomasse
M POST = Masse af post-udvundet biomasse
M VIAL = Masse af udvundet biomasse i hætteglasset
M RESIDUE = Masse af digel og lignin residue
M ASH = Masse af digel og aske
MC = Vandindholdet i præ-ekstraherede biomasse samlet vægtbasis
5.. Kulhydrat Analyse
- Udfør cellevæg kulhydrat analyser baseret på Foster et al. (2010) Protokol 31. Kort sagt, Forbered alkohol uopløselige rest fra frysetørret plantemateriale. Derefter hydrolyserer materialet med trifluoreddikesyre og matche de solubiliserede monosaccharidderivaterne til deres tilsvarende alditolacetater. Analyser af disse flygtige derivater ved gaskromatografi (GC) er forbundet til en firdobbelt massespektrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har påvist en reduktion i ligninindhold i majsplanter via RNAi. Den partikelbombardement transformation metode gav omkring 30% trnasformation effektivitet. Genet undertrykkelse af ZmCCR1 blev konsekvent overholdes i T0-T2 generationer. Lignin reducerede transgene voksede på samme måde vildtypeplanter majs undtagen til visning brunfarvning i blad midt ribben, skallerne, og stilken. Den histologiske analyse har vist, at de mutante linjer udviser en signifikant reduktion i cellen vægtykkelse sclerenchyma fibre i majs blad midten ribben 18. Trods nedsættelse af cellevægtykkelse, har strukturen af andre større vaskulære systemer, herunder veddet fartøj Phloem og kappe celler afslørede ingen forskelle sammenlignet med vildtype-kontrollen (figur 2A) 18. Dette indebærer, at der ikke er nogen skadelige virkninger for enten vand transport, overførsel af næringsstoffer, eller mekanisk styrke stænglerne in ZmCCR1_RNAi mutant linjer.
Ligninindholdet blev kvantificeret ved anvendelse af en Klason lingin måling. Figur 3 viser mængden af syre-uopløseligt Klason lignin (g / kg con stover) i vildtype majs og ZmCCR1_RNAi transgene linier (T1). Tre transgene linier (1c-4, -5 og -6) viste en statistisk signifikant reduktion lignin (8,1%, 7,0% og 8,7%) sammenlignet med det af vildtype majsplanter 18. For at bestemme om kulstof flow blev flyttet fra lignin biosyntesevejen til cellevæg kulhydrat biosynteseveje blev cellulose analyseret via Updegraff metoden. 3A viser, at to ZmCCR1_RNAi mutant linjer (1b-6 og 1c-6) indeholdt signifikant forhøjede niveauer af krystallinsk cellulose (henholdsvis 1,5 og 1,8 gange) 18. Indholdet hemicellulose blev også analyseret. Figur 4B viser mængden af fire hovedelementer hemicellulose komponenter (arabionose, xylose, galactose og glucose). Ingen af de fire carbohydratgrupper afslørede eventuelle ændringer i de muterede linjer 18.
Figur 1 Kloning strategi for dsRNAi plasmidkonstruktioner for nedregulering af ZmCCR1 PRbcS1:.. Ribulose bisphosphatcarboxylase promotor fra Chrysanthemum morifolium Ramat. T-RbcS1: ribulose bisphosphatcarboxylase lille enhed terminator fra Asteraceous krysantemum. Dette tal er blevet ændret fra Park et al (2012) 18.
Figur 2. Fænotypisk analyse af vildtype majs (Hi-II) og ZmCCR1_RNAimutant blad midtribbe. A) brunfarvning blev set i ZmCCR1 nedreguleret majs blade, stængler og majs avner. B) tværsnit majs blad midribs af vildtype HI-II (til venstre) og ZmCCR1_RNAi mutant linje (til højre) blev farvet med 0,05% toluidinblåt O i 1 min at visualisere sekundære veddet væv. Den røde pil angiver cellevægge sclerenchyma fibre af bladet midterribben. (C) Scanning elektronmikroskopi (SEM) af ZmCCR1 nedreguleret transgen majs blad midterribben (til højre) sammenlignet med den af vildtype ikke-transgen kontrol plante (til venstre). Den røde pil viser sclerenchyma fibre. Dette tal er blevet ændret fra Park et al. (2012) 18.
Figur 3.. Klason lignin målinger (ACID-uopløselig lignin indhold) af vildtype HI-II og ZmCCR1_RNAi mutant. De tre mutante linjer 1c, 1c-5 og 1c-6 havde statistisk lavere indhold lignin, 8,5%, 7,5% og 9,2% henholdsvis som procent tørstof i forhold til de planter kontrol vildtype. Middelværdi ± standardafvigelse (P <0,05, n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Park et al. (2012) 18.
Figur 4.. Cellevæg analyser af sammensætning. A) Krystallinsk cellulose analyse af ZmCCR1_RNAi linjer (Tukeys parvise sammenligninger, * P <0.05, n = 3). B) Hemicellulose sammensætningsanalyse af vildtype majs og ZmCCR_RNAi transgene majslinjer (T1) via gaschromatografi (GC). De vigtigste toppe fra kromatogrammerne were integreret, er identificeret på grundlag af retentionstider og fragmention underskrifter, og udtrykt som mol procent (P> 0,05, n = 3) (Tukeys parvise sammenligninger, P> 0,05, n = 3). Dette tal er blevet genbrugt fra Park et al. (2012) 18.
Figur 5 procent sukker (glucan og xylan) konverteringer for ubehandlet (UT) og AFEX TM-forbehandlet (90 ° C, 5 min) majs-halm ved forskellige koncentrationer af ammoniak (1.0:. 1,0 g NH3: g tør biomasse 1,5: 1,5 g NH 3:. g tør biomasse) Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien og er baseret på to gentagelser for de ubehandlede prøver og fire gentagelser (to forbehandling replikerer med to hydrolyse replikater hver) for de forbehandlede prøver. Forbehandlede sukker konverteringer(24 timer eller 72 timer) mærket med forskellige bogstaver er statistisk forskellige baseret på Tukeys parvise sammenligninger (p <0,05). Dette tal er blevet genbrugt fra Park et al. (2012) 18.
| Medier | Kemiske sammensætninger |
| N6OSM | 4 g / L N6 salte |
| (Osmotisk medium) | 1 ml / L N6 vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 0,69 g / L prolin | |
| 30 g / L saccharose | |
| 100 mg / l caseinhydrolysat | |
| 36.4 g / L sorbitol | |
| 36.4 g / L mannitol | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Tilføj filter steriliseret sølvnitrat (25 uM) efter autoklavering | |
| N6E | 4 g / L N6 salte |
| (Callusinduktion) | 1 ml / l (1.000 x) N6 vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 2,76 g / L prolin | |
| 30 g / L saccharose | |
| 100 mg / l caseinhydrolysat | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Tilføj filter steriliseret sølvnitrat (25 uM) efter autoklavering | |
| N6S medier | 4 g / L N6 salte |
| (Selection medier) | 1 ml / L N6 vitamin lager |
| 2 mg / L 2,4-D | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| <td> 0,69 g / L prolin | |
| 30 g / L saccharose | |
| 100 mg / l caseinhydrolysat | |
| 36.4 g / L sorbitol | |
| 36.4 g / L mannitol | |
| 2,5 g / L gelrite, pH 5,8 | |
| Tilføj filter steriliseret sølvnitrat (25 uM) efter autoklavering | |
| Regeneration medium | 4,3 g / l MS-salte |
| 1 ml / L (1000x) MS vitamin lager | |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 60 g / L saccharose | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriskåle) | |
| Tilføj filter steriliseret bialaphos (3 mg / l) tilsættes efter autoklavering | |
| Beskæftigelsesmaterialer medium | 4,3 g / l MS-salte |
| 100 mg / L myo-inositol | |
| 30 g / L saccharose | |
| 3 g / L gelrite, pH 5,8 (100 x 25 mm petriskåle) | |
| 10% Neutral pufret formalin | 100 ml formalin |
| (1 liter) | 900 ml ddH2O |
| 4,0 g Natriumdihydrogenphosphat monohydrat (NaH 2 PO 4 · H 2 O) |
Tabel 1. Tabel specifikke reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilgængeligheden af mikrobielle cellulaser til plantecellevægge polysaccharider er i vid udstrækning afhængig af, i hvilken grad de er forbundet med phenolpolymerer 23. Den omregningskurs fra lignocellulose biomasse til forgærbare sukker er negativt korreleret med ligninindhold deponeret i plante secondadry cellevægge. Denne korrelation tilskrives de fysiske egenskaber af lignin, såsom hydrofobicitet 24, kemisk heterogenitet, og fraværet af regelmæssige hydrolyserbar intermonomeric forbindelsesled 25.
I denne undersøgelse, en dsRNAi teknik induceret forskellige gen nedregulering om genetiske mål. Lignin nedregulering, formidlet af en ZmCCR1_RNAi opføre, har resulteret i brune farve i T1 transgneic linjer. Brun midterribbe (bm) farvning er et naturligt forekommende fænomen, der er forårsaget af reduceret ligninindhold og ændret lignin sammensætning. I modsætning til andre naturligt occurred bm mutanter, som viser brunfarvning kun blad midten ribben, de ZmCCR1_RNAi mutante linjer viste fænotype i andre dele af planten, herunder stængler og avner. Den histologiske analyse også, at sclerenchyma cellevæg tykkelse ZmCCR1 nedreguleret blade var meget mindre end de vildtypekontrollen planter (Figur 2A). Imidlertid blev sturucture og cellevægtykkelse af de vigtigste karsystemer inclduing veddet fartøjer, Phloem eller kappe celler ikke ændret. Dette kunne forklare den normale vækst af ZmCCR1_RNAi transgene linier som voksede normalt i form af plante højde og dæmme diameter.
En reduktion på mere end 20% i indholdet lignin har generelt forårsaget et tab af biomasse og gjort planterne mere sårbare over for mikrobielle patogener og skadedyr 27,28. Men de muterede linjer produceret i denne forskning, der udtrykker mindre end en 10% lignin reductiom, ikke kompromittere plantebiomasse og defensiv ordning mod abiotiske og biotiske påvirkninger.
Tidligere undersøgelser har vist, at transgene tobaksplanter linjer med betydeligt reduceret CCR ekspression viste også en stigning af andre cellevægsbestanddele, såsom glucose, xylose, og væg-bundne phenolforbindelser (f.eks sinapic og ferulic syrer). I denne undersøgelse, den milde lignin reduktionen øget niveau af krystallinsk cellulose i nogle af de ZmCCR1 nedreguleret majsplanter. Omvendt blev en cellulose kompensationsordning også observeret i Arabidopsis mutanter, som udviste ektopisk lignification når cellulose syntese gener var defekt 35. De kvantitative eller kvalitative ændringer i en cellevæg kulhydrat komponent inducerer vekslen af andre komponenter 36. Sådanne kompensation mechansims er vigtige for maintan homøostase af plante vaskulære systemer. Men i denne undersøgelse, hemicelluloSES viste ingen statistisk signifikante ændringer i ZmCCR1 nedreguleret mutant linjer. Dette resultat kan være, fordi de observerede lignin nedsættelsen ikke var tilstrækkelig til at udløse ekstra hemicellulose syntese.
Det lavere niveau af lignin og den øgede krystallinsk cellulose-niveau ville være dobbelt gavnligt for produktion af biobrændstoffer. De lavere lignin indhold ville kræve færre input (f.eks H 2 SO 4, cellulaser, osv.) under behandlingen og fremme af biomasse konverteringsprocessen. Den ekstra cellulose kan øge udbyttet af fermenterbare sukkerarter. Den genetiske manipulation af ZmCCR1 beskrevet i denne undersøgelse kan gennemføres for at bidrage til at gøre lignocelluosic bimoass afledt bioethanol mere kommercielt konkurrencedygtige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Den mikroskopiske billeddannelse blev gennemført via de tjenester i Michigan State University Center for Advanced Microscopy. Majs callus blev købt fra majstransformation Center of Iowa State University. Forfatterne vil gerne takke Jeffrey R. Weatherhead af MSU Plant Research Laboratory for sin tekniske bistand på analysen kulhydrat. Denne forskning blev generøst finansieret af Corn Marketing Program of Michigan (CMPM) og Konsortiet for Plantebioteknologi Research (CPBR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N6OSM (Osmotic medium) | Made in-house | ||
| N6E (Callus induction) | Made in-house | ||
| N6S media (Selection media) | Made in-house | ||
| Regeneration medium | Made in-house | ||
| Rooting medium | Made in-house | ||
| 10% Neutral buffered formalin (1 L) | Made in-house | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device | Hercules, CA, United States | ||
| Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Jena, Germany | For brightfield microscopy, the images were recorded using a Zeiss (Jena, Germany) PASCAL confocal laser scanning microscope with a 488 nm excitation mirror, a 560 nm emission filter, and a 505-530 nm emission filter. Image analysis was performed using Laser scanning microscope PASCAL LSM version 3.0 SP3 software. | |
| Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| HistoCentre III Embedding Station | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States | ||
| Microtome Model Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, United States | ||
| Emscope Sputter Coater model SC 500 | Ashford, Kent, England | ||
| JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope | JEOL Ltd., Tokyo, Japan | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| MA35 Moisture Analyzer | Sartorius | ||
| Critical point dryer, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States | ||
| Screw-top high pressure tubes | Ace Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Screw-top high pressure tube plugs | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
References
- Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins. Carbohydrate research. , 275-178 (1995).
- Park, S. -H. Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , Michigan State University. (2011).
- Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M.
- Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).
- Dien, B. S., et al. Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition. Bioresource technology. , 102-6486 (2011).
- Fu, C. X., et al. Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass. Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).
- Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability. Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnology for biofuels. 3, (2010).
- Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production. The New phytologist. 194, 91-101 (2012).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).
- Chen, F., Dixon, R. A. Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production. Nature. 25, 759-761 (2007).
- Ziebell, A., et al. Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin. The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).
- Park, S. -H., et al. The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars. Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).
- Mol, J. N., et al. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBS letters. 268, 427-430 (1990).
- Adamo, A., et al. Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).
- Smith, N. A., et al. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature. 407, 319-320 (2000).
- Park, S. -H., et al. Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels. Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).
- Altpeter, F., et al. Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities. Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).
- Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes. Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).
- Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. Engineering novel traits in plants through RNA interference. Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).
- Hatfield, R. D., Jung, H. -J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures. J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).
- Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytic Procedure. , (2008).
- Bate, N. J., et al. Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).
- Hu, W. J., et al. Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees. Nature. 17, 808-812 (1999).
- Lapierre, C., et al. Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins. Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).
- Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature. 7, 1590-1607 (2012).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates. J. Vis. Exp. (e1837), (2010).
- Department of Agronomy, Iowa State University. Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants. , (2005).
- Bio-Rad. Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_9075.pdf (1997).
- Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).
- Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses. Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).
