Analyse af nanopartikel interaktion med definerede underpopulationer af immunceller ved flowcytometri.
Nanopartikler er udstyret med meget lovende egenskaber til terapeutiske og diagnostiske formål. Dette arbejde beskriver en hurtig og pålidelig metode til analyse ved flowcytometri at studere nanopartikel interaktion med immunceller. Primære immunceller kan oprenses let fra humane eller muse-væv ved hjælp af antistof-medieret magnetisk isolation. I første omgang kan de forskellige cellepopulationer kører i et flowcytometer være kendetegnet ved den fremadrettede spredte lys (FSC), som er proportional med cellens størrelse, og side-spredte lys (SSC), relateret til celle interne kompleksitet. Desuden fluorescensmærkede antistoffer mod specifikke celleoverfladereceptorer mulighed for identifikation af flere subpopulationer i samme prøve. Ofte alle disse funktioner varierer, når cellerne er forstærket af eksterne stimuli, der ændrer deres fysiologiske og morfologiske tilstand. Her er 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler bruges som en model til at identificere the internalisering af nanostrukturerede materialer i humant blod immunceller. Cellen fluorescens og side-spredte lys stigning efter inkubation med nanopartikler tilladt os at definere tid og koncentration afhængighed af nanopartikel-celle-interaktion. Desuden kan en sådan protokol udvides til at undersøge rhodamin-SiO2 nanopartikel interaktion med primær microglia centralnervesystemet hjemmehørende immunceller, isoleret fra muterede mus, der specifikt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i monocyt / makrofaglinien. Endelig flowcytometri data relateret til nanopartikel internalisering i cellerne er blevet bekræftet af konfokal mikroskopi.
Konstruerede nanomaterialer er i dag inspirerende interesse biovidenskabelige forskere for potentielle ansøgninger til biomedicin 1. En bred vifte af uorganiske og organiske materialer kan anvendes til at fremstille nanostrukturer med forskellige former, fysiske og kemiske egenskaber. Blandt disse strukturer, manipuleret nanopartikler af kugleform viste stort potentiale for diagnostik og translationel medicin 2.. Deres kerne og overflade design er drevet af en mulig anvendelse, og det indebærer en dybtgående undersøgelse af target celle respons efter nanopartikel kontakt og samspil. Nanopartikler, der menes at være bevidst administreres til mennesker vil komme i direkte kontakt med flere typer af immunceller. Deres ansvar for at opretholde kroppens integritet gør dem til et afgørende emne for undersøgelse i nanomedicin 3.
Den cellulære del af det medfødte immunsystem er hovedsageligt repræsenteret ved phagocytes. Blandt dem, monocyt / makrofaglinien afledte celler, herunder centralnervesystemet bosiddende mikroglia, spiller en central rolle i immunforsvaret 4,5. De er i stand til at udløse beskyttende responser inden for få timer efter at have mødt med fremmedlegemer. Desuden monocytceller koordinere og instruere svaret adaptive immunrespons gennem frigivelse af cytokiner. Alle disse begivenheder ske, selv i tilstedeværelse af manipuleret materialer, som i vid udstrækning opfattes som "ikke-selv" af immunsystemet 6.
Blandt de metoder, der historisk set er benyttet i immunologi for celle analyse, flowcytometri repræsenterer en af de mest kraftfulde værktøjer. Desuden tilgængeligheden af teknologier til identifikation eller oprensning af en specifik immun subpopulation (ofte udnytte udelukkelse eller tilstedeværelsen af en enkelt membran protein) giver mulighed for en præcis undersøgelse af virkningerne af en bestemt nanopartikel på denne særlige primær cell type 7. Dog kan celler præsentere fysiologiske og morfologiske forandringer efter eksponering for nanopartikler. Samt, kan nanopartikler interferere med specifikke optiske parametre, såsom absorption eller emission af lys ved definerede bølgelængder, påvirke de opnåede resultater 8. Så bør grænserne for brug og eventuelle tilpasninger af klassiske immunologiske assays til studiet af nye materialer overvejes.
Dette arbejde vedrører påvisning af nanopartikel interaktioner med primære immunceller ved flowcytometri. For at løse dette problem, 50 nm FITC-SiO 2 nanopartikler blev ansat som en model nanomateriale til at beskrive metoden. Silicapartikler kan fremstilles på en meget præcis måde i nano-målestok. Størrelse, form og overflade egenskaber, såsom ladning eller hydrofobicitet, kan fintunet til at øge deres biokompatibilitet 9. Mange funktioner i SiO 2 nanopartikler tillader dem at blive brugt som enmodel for drug delivery partikler 10. Desuden kan fluorescerende farvestoffer eller kvantepunkter blive indfanget eller er knyttet til disse partikler, der tilbyder nyttige nano-værktøjer til afbildningsformål 11.
Forsøgsprotokollen præsenterer meget afgørende punkter, der skal tages i betragtning. Det er virkelig vigtigt at arbejde ved 4 ° C (på is), og muligvis i mørke under alle farvningsprocedurer trin, fordi højere temperaturer og lys negativt kan påvirke farvning udbytte. Nanopartikler kan sonikeres til bedre resuspenderes umiddelbart før brug.
Et korrekt flowcytometri analyse kræver en korrekt kalibrering i de forskellige kanaler. Kalibrering af instrumentet bør udføres før hver eksperimentel session. Udover tekniske problemer med den instrumentering, kan der også være problemer med antistof mærkning. Det er obligatorisk at anvende antistoffet i en passende koncentration. Hvis koncentrationen er for høj eller for lav, kan utilfredsstillende signalintensiteter være følgen.
Ulemperne ved denne teknik omhandler behovet for at arbejde med monodisperse prøver, den manglende evne til at lokalisere denoprindelsesstedet af signalet (dvs. forskellige cellulære rum). Der er også nogle begrænsninger i valget af fluorokromer, der skal anvendes i kombination: bølgelængden af excitation og emission bands skal være tilstrækkeligt adskilt for at tillade, at deres passende måling. Hvis de anvendte antistof spektre overlapper hinanden, er en korrekt krævede kompensation.
Flowcytometri er en kraftfuld metode til celleanalyse i nærvær eller fravær af nanopartikler. Denne teknik tillader en multiparametric undersøgelse af en celle, et stort antal begivenheder undersøgte hurtige analyse (mere end 1.000 celler / sek), reproducerbarhed og statistiske målinger. Prøver kan behandles uden at miste cellelevedygtighed.
Ved hjælp af fluorescens-mærkede nanopartikler er det muligt at kvalificere og kvantificere deres internalisering i cellesubpopulationer, der er identificeret ved specifikke markører eksponeret på cellemembranen. Cell parametre kan ændre sig i nærvær af s PECIFIKKE nanopartikler. Afhængigt af formålet med undersøgelsen, kan disse variationer kan anvendes til at identificere et specifikt fænomen, såsom side spredning af celler, der proportionalt øger med stigende nanopartikel internalisering sats.
Nanopartikel-inducerede modifikationer af celleoverfladen kan også repræsentere en begrænsning af teknikken. Af denne grund, skal cellemembranreceptorer omsætning skal altid tages i betragtning og eventuelt kendt på forhånd præcist at karakterisere cellepopulationen af interesse. Ekstreme nedskrivninger på membran osmose i nanopartikel overbelastet prøver kan føre til celledød.
Nanomateriale dosisafhængig toksicitet bør empirisk testet for hver cellepopulation. Klart definerede døde celler skal udelukkes fra fluorescens kvantificering. For eksempel Annexin V / PI farvning er en af de mange metoder, der sædvanligvis anvendes til at detektere både nekrotiske og apoptotiske celler.
"> GFP-udtrykkende primære celler er også et effektivt værktøj til at vælge en bestemt cellesubpopulation og indsamle data uden prelabeling. Kombinationen med supplerende fluorescerende nanopartikler giver mulighed for en meget hurtig og præcis kvantificering af celle-nanopartikel interaktion. Drug eller gen levering menes at forbedres i fremtiden ved anvendelse af nanopartikler i stand til at frigive et specifikt lægemiddel belastning i udvalgte væv.Ansættelse af nanopartikler som specifikke levering bærere og / eller immunmodulatorer for farmaci forudsætter kendskab til det biologiske miljø (dvs. gennem flowcytometri) at undersøge celle-nanopartikel interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
Forfatterne vil gerne anerkende Miltenyi Biotec GmbH (Bergisch Gladbach, Tyskland) til sponsorering af dette manuskript, Dr. Paolo Petrucciani (Department of Immuno-hæmatologi og Transfusion Service Hospital Lotti Pontedera, Pisa, Italien) til at tilvejebringe humane buffy coats og Prof. Massimo Pasqualetti (Biologisk Institut – Enhed for Cellulær og Developmental Biology, University of Pisa, Pisa, Italien) for boliger musen koloni.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |