ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.
חלקיקים מהונדסים ניחנו עם תכונות מבטיחות מאוד למטרות טיפוליות ואבחון. עבודה זו מתארת שיטה מהירה ואמינה של ניתוח על ידי cytometry זרימה ללמוד אינטראקציה nanoparticle עם תאים חיסוניים. יכולים להיות מטוהרים תאים חיסוניים ראשוניים בקלות מרקמות אדם או עכבר על ידי בידוד מגנטי בתיווך נוגדנים. במקרה הראשון, ניתן להבחין אוכלוסיות תאים השונות פועלות בcytometer זרימה על ידי האור מפוזר קדימה (FSC), שהיא פרופורציונלית לגודל תא, והאור מפוזר הצד (SSC), הקשורים לתא מורכב פנימי. יתר על כן, נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד קולטני תא שטח ספציפי מאפשרים זיהוי של מספר אוכלוסיות במדגם זהה. לעתים קרובות, כל התכונות הללו להשתנות כאשר תאים שיפרה ידי גירויים חיצוניים המשנים את המצב הפיזיולוגי ומורפולוגיות שלהם. הנה, 50 ננומטר FITC-SiO 2 חלקיקים משמשים כמודל לזיהוי ההפנמת דואר של חומרי nanostructured בתאים חיסוניים בדם אדם. הקרינה הסלולרי וגידול אור מפוזר צד לאחר דגירה עם חלקיקים אפשרו לנו להגדיר את הזמן ואת תלות ריכוז של אינטראקציה nanoparticle תאים. יתר על כן, פרוטוקול כזה ניתן להאריך לחקור אינטראקציה 2 nanoparticle Rhodamine-SiO עם מיקרוגליה ראשוניים, תאי העצבים המרכזיים תושב מערכת חיסוניים, מבודדים מעכברים שעברו מוטציה שבמיוחד מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) בשושלת מונוציטים / מקרופאג. לבסוף, cytometry זרימת נתונים הקשורים להפנמת nanoparticle לתוך התאים אושרו על ידי מיקרוסקופיה confocal.
ננו המהונדס כיום השראה האינטרס של מדעני חיים עבור יישומים פוטנציאליים לביו 1. מגוון רחב של חומרים אורגניים ואורגניים יכול לשמש לייצור ננו עם צורות שונות, פיזיות ותכונות כימיות. בין המבנים הללו, חלקיקים מהונדסים של צורה כדורית הפגינו פוטנציאל גדול לרפואת אבחון וtranslational 2. הליבה שלהם ועיצוב פני השטח מונעים על ידי יישום אפשרי וזה מרמז על מחקר מעמיק של תגובות תא היעד הבא במגע nanoparticle ואינטראקציה. חלקיקים כי הם חשבו להיות מנוהלים במכוון לבני אדם יבואו במגע ישיר עם מספר סוגים של תאי מערכת החיסון. האחריות שלהם כדי לשמור על שלמות הגוף הופכת אותם לנושא קריטי של החקירה בnanomedicine 3.
החלק התאי של מערכת החיסון המולדת ה"רשת phagocytes. ביניהם, את שושלת מונוציטים / מקרופאג תאים שמקורם, ביניהם מיקרוגליה תושב מערכת עצבים המרכזיים, לשחק תפקיד מפתח בהגנה החיסונית 4,5. הם מסוגלים לעורר תגובות המגן בתוך כמה שעות, לאחר שנקלע עם גופים זרים. יתר על כן, תאי monocytic לתאם ולהנחות את התגובה החיסונית אדפטיבית דרך השחרור של ציטוקינים. כל האירועים הללו מתרחשים גם בנוכחותם של חומרים מהונדסים, אשר נתפסים בעיקר כ" nonself "על ידי מערכת החיסון 6.
בין השיטות היסטורית משמשות באימונולוגיה לניתוח תא, cytometry זרימה מייצגת את אחד הכלים החזקים ביותר. יתר על כן, הזמינות של טכנולוגיות לזיהוי או הטיהור של subpopulation ספציפי חיסוניים (לעתים קרובות מנצל את ההרחקה או נוכחות של חלבון קרום אחד) מאפשרת חקירה מדויקת של ההשפעות של nanoparticle מסוים על ce העיקרי מסויםסוג ll 7. עם זאת, תאים עשויים להציג שינויים פיסיולוגיים ומורפולוגיים לאחר חשיפה לחלקיקים. כמו כן, חלקיקים עלולים להפריע לפרמטרים ספציפיים אופטיים, כגון קליטה או פליטה של אור באורכי גל מוגדר, המשפיעים על התוצאות שהושגו 8. לכן, גבולות שימוש ועיבודים הסופיים של מבחני חיסוניים קלאסיים לחקר חומרים חדשים צריכים להיחשב.
עבודה זו עוסקת באיתור של אינטראקציות nanoparticle עם תאים חיסוניים ראשוניים על ידי cytometry זרימה. כדי לטפל בבעיה זו, 50 ננומטר FITC-SiO 2 חלקיקים הועסקו כnanomaterial מודל כדי לתאר את השיטה. ניתן לייצר חלקיקי סיליקה באופן מדויק מאוד בקנה מידת ננו מטרי. גודל, צורה, ופני שטח תכונות, כגון תשלום או הידרופוביות, יכולות להיות מכוונת היטב כדי להגדיל את ההתאמה הביולוגית שלהם 9. תכונות רבות של SiO 2 חלקיקים מאפשרים להם לשמש כמודל עבור משלוח סמים חלקיקי 10. יתר על כן, יכולים להיות ממולכדים צבעי ניאון או נקודות קוונטיות, או צמוד לחלקיקים אלה מציעים ננו כלים שימושיים למטרות הדמיה 11.
פרוטוקול הניסוי מציג נקודות קריטיות מאוד שיש לקחת בחשבון. זה באמת חשוב לעבוד על 4 ° C (על קרח), ואולי בחושך במהלך כל שלבי הצביעה, משום שטמפרטורות ואורות גבוהות יותר עשויות להשפיע לרעה על התשואה מכתים. חלקיקים יכולים להיות sonicated להיות טוב יותר resuspended רק לפני השימוש.
זרימה נכונה ניתוח cytometry דורשת כיול נכון בערוצים השונים. כיול של המכשיר יש לבצע לפני כל פגישה ניסיונית. חוץ מבעיות טכניות עם המכשור, לא יכולה להיות גם בעיות עם תיוג הנוגדן. זה חובה להשתמש בנוגדן בריכוז מתאים. אם הריכוז גבוה מדי או נמוך מדי, עוצמות אות אי שביעות רצון יכולה להיות התוצאה.
החסרונות של דאגה בטכניקה זו את הצורך בעבודה עם דגימות monodisperse, חוסר היכולת למקם אתאתר של מקור האות (תאים סלולריים שונים, כלומר). יש גם כמה מגבלות בבחירת fluorochromes לשמש בשילוב: אורך הגל של העירור ולהקות הפליטה חייב להיות מופרד במידה מספקת כדי לאפשר המדידה המתאימה שלהם. אם ספקטרום הנוגדן משמש חופף, נדרש פיצוי נכון.
Cytometry זרימה היא שיטה רבת עוצמה לניתוח תא בנוכחות או עדר של חלקיקים. טכניקה זו מאפשרת מחקר multiparametric של תא, מספר גבוה של אירועים שנבדק, מהירות של ניתוח (יותר מ 1,000 תאים / sec), שחזור וקריאות סטטיסטיות. יכולות להיות מעובד דוגמאות בלי לאבד את יכולת הקיום של תאים.
באמצעות חלקיקים שכותרתו fluorescently זה אפשרי להעפיל ולכמת ההפנמה שלהם בתת אוכלוסיות של תאים, אשר מזוהות על ידי סמנים ספציפיים נחשפו על קרום התא. פרמטרים ניידים יכולים לשנות בנוכחותו של ים חלקיקי pecific. בהתאם למטרה של המחקר, ניתן להשתמש בם וריאציות אלה כדי לזהות תופעה ספציפית, כגון פיזור צד של תאים שאופן יחסי עולה עם קצב הפנמת nanoparticle הגובר.
שינויים הנגרמים Nanoparticle של תא שטח יכולים גם לייצג מגבלה של הטכניקה. מסיבה זו, מחזור קולטני קרום התא חייב להיות תמיד נלקח בחשבון ואולי ידוע מראש לאפיין את אוכלוסיית התא של עניין בדיוק. ליקויים קיצוניים של אוסמוזה קרום בדגימות nanoparticle העמוס יכולים להוביל למוות של תאים.
רעילות תלויה מינון nanomaterial צריכה להיבדק באופן אמפירי לכל אוכלוסיית תא. תאים מתים מוגדרים חייבים להיות מחוץ כימות הקרינה. למשל, מכתים Annexin V / PI הוא אחד ממספר השיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות תאי שני נמקים ואפופטוטיים.
"> תאים ראשוניים-GFP-לבטא גם כלי רב עוצמה כדי לבחור subpopulation תאים מסוים ולאסוף נתונים ללא prelabeling. השילוב עם חלקיקי ניאון משלימים מאפשר כימות מהירה מאוד ומדויקת של אינטראקציה תא nanoparticle. הוא חשב משלוח סמים או גנטי כדי להשתפר בעתיד על ידי היישום של חלקיקים מסוגלים לשחרר ספציפי עומס תרופה לרקמות שנבחרו.תעסוקה של חלקיקי מאפננים כספציפיים נושאות אספקה ו / או חיסון לרוקחות דורשת הידע של הסביבה הביולוגית (כלומר, באמצעות cytometry זרימה) כדי לחקור אינטראקציות תא nanoparticle.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia.
המחברים רוצים להכיר Miltenyi יוטכנולוגיים GmbH (ברגיש גלאדבך, גרמניה) עבור החסות של כתב היד הזה, ד"ר פאולו פטרוצ'יאני (המחלקה להמטולוגיה החיסונית ועירוי שירות, בית החולים לוטי Pontedera, פיזה, איטליה) לאספקת מעילים באפי אדם ו פרופ 'מאסימו Pasqualetti (מחלקה לביולוגיה – יחידה נייד וביולוגיה התפתחותית, האוניברסיטה של פיזה, פיזה, איטליה) לדיור המושבה העכבר.
HBSS | Gibco | 14170-088 | Warm in 37 °C water bath before use |
RPMI-1640 (ATCC Modified) | Gibco | A10491-01 | Warm in 37 °C water bath before use |
DMEM, High Glucose, phenol red | Gibco | 41966-029 | |
Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140-122 | |
Gentamycin | Gibco | 15710-049 | |
Horse Serum (lot n° 1131917) | Gibco | 16050-122 | |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090-046 | |
Human Pooled Serum | Invitrogen | 34005100 | |
Versene | Invitrogen | 15040-033 | |
DNAse I | Sigma Aldrich | D5025-150KU | |
CD11b-VioBlue human & mouse | Miltenyi Biotec | 130-097-336 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
Running buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-747 | |
autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
Human Pan monocyte isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-096-537 | |
Whole Blood Column Kit | Miltenyi Biotec | 130-093-545 | |
Whole Blood CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-879 | |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Red Blood Cell Lysis Solution | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
Pre-Separation Filters 30 µm | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
MACSQuant Analyzer flow cytometer | Miltenyi Biotec | 130-092-197 | |
MACSQuant Calibration Beads | Miltenyi Biotec | 130-093-607 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | GEH17544202 | |
FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV) | HiQ-Nano Company | ||
12-well plate Falcon | Becton Dickinson | 353043 |