माउस रेटिना का प्रयोग सीएनएस में संवहनी उत्थान के आकलन

Summary

कृंतक रेटिना लंबे मस्तिष्क के लिए एक सुलभ खिड़की के रूप में पहचाना गया है. इस तकनीकी पत्र में हम इस्कीमिक चोट के बाद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के भीतर संवहनी उत्थान की विफलता के लिए नेतृत्व कि तंत्र का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी के माउस मॉडल काम में एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. वर्णित व्यवस्था भी रेटिना और सीएनएस के भीतर कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं के regrowth को बढ़ावा देने के लिए रणनीतियों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

कृंतक रेटिना शायद केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर neurovascular परस्पर क्रिया की जांच के लिए जो सबसे सुलभ स्तनधारी प्रणाली है. यह तेजी से मान्यता प्राप्त किया जा रहा है कि अल्जाइमर, एकाधिक काठिन्य, और नाड़ी समझौता के amyotrophic पार्श्व काठिन्य मौजूद तत्वों के रूप में कई neurodegenerative रोगों. इसके अलावा, बाल चिकित्सा और काम करने की उम्र आबादी (क्रमशः कुसमयता और मधुमेह रेटिनोपैथी की रेटिनोपैथी,) में अंधापन के सबसे प्रमुख कारणों में शारीरिक संवहनी regrowth की संवहनी अध: पतन और विफलता की विशेषता है. इस तकनीकी पेपर का उद्देश्य रेटिना में सीएनएस संवहनी उत्थान अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है. विधि इस्कीमिक चोट के बाद संवहनी विकास की विफलता के लिए नेतृत्व कि आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इसके अलावा, संभावित चिकित्सीय तौर तरीकों स्वस्थ संवहनी चक्रों में तेजी लाने और बहाल करने के लिए पता लगाया जा सकता है. निष्कर्ष obtaineडी वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग मधुमेह या कुसमयता के रूप में इस्कीमिक retinopathies के लिए चिकित्सीय रास्ते प्रदान और संभवतः सीएनएस के अन्य संवहनी विकारों लाभ हो सकता है.

Introduction

सीएनएस विकास, नसों, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के दौरान पर्याप्त ऊतक छिड़काव सुनिश्चित करने और संवेदी जानकारी ^1-5 के प्रसारण की अनुमति उल्लेखनीय युग्मित नेटवर्क की स्थापना. अपर्याप्त ऊतक oxygenation और छेड़छाड़ की चयापचय की आपूर्ति और में संवहनी सिस्टम के परिणाम के टूटने तेजी neurodegenerative रोगों ⁶ के रोगजनन के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान के रूप में मान्यता प्राप्त है. संवहनी छोड़ने वालों और मस्तिष्क के भीतर neurovascular इकाई की गिरावट, उदाहरण के लिए, संवहनी मनोभ्रंश, मस्तिष्क ⁷ की सफेद पदार्थ की संवहनी घावों और धमनियों और छोटे जहाजों ⁸ के एक प्रकार का रोग के साथ अल्जाइमर रोग के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, बिगड़ा संवहनी बाधा समारोह एकाधिक काठिन्य ⁹ और amyotrophic पार्श्व काठिन्य ¹⁰ योगदान माना जाता है.

चकाचौंध, इस प्रोटोकॉल में वर्णित रेटिना मॉडल को प्रत्यक्ष प्रासंगिकता केऐसे मधुमेह रेटिनोपैथी ¹¹ और कुसमयता ¹² की रेटिनोपैथी जैसे ^{रोगों, 13} जल्दी संवहनी अध: पतन का एक चरण की विशेषता है. neurovascular रेटिना पर आगामी इस्कीमिक तनाव की संभावना को फिर से हासिल करना ऑक्सीजन और ऊर्जा की आपूर्ति ^14-16 के लिए एक प्रतिपूरक प्रतिक्रिया के रूप में निकलती है कि अत्यधिक और रोग neovascularization के दूसरे चरण से चलाता है. रोग प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है कि इस्कीमिक तनाव पर काबू पाने के लिए एक आकर्षक रणनीति विशेष रूप से न्यूरो रेटिना (आंकड़े 2 और 3) के इस्कीमिक क्षेत्रों में कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क बहाल करने के लिए है. एक नियंत्रित वाहिकाजनक प्रतिक्रिया उत्तेजक काउंटर सहज ज्ञान युक्त इस तरह के विरोधी VEGFs के रूप में विरोधी angiogenic उपचार अनुकूलित उपचार के रूप में माना जाता है, जिसमें एक की हालत के लिए के रूप में सामने आ सकता है. फिर भी, इस दृष्टिकोण की वैधता के लिए सबूत बढ़ते है. उदाहरण के लिए, ischem में "शारीरिक" की तरह संवहनी regrowth बढ़ानेआईसी retinopathies सुंदर ढंग से endothelial कोशिकाओं अग्रदूत ^17, आहार ω-3 पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी बढ़ती अन्य वाहिकाजनक कारकों ^18, माइलॉयड progenitors ¹⁹ इंजेक्शन, NADPH oxidase प्रेरित apoptosis ²⁰ के निषेध के मुलर सेल व्यक्त VEGF प्रेरित डाउनरेगुलेशन के निषेध की शुरूआत के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है एसिड की मात्रा ^21, एक tryptophan tRNA synthetase ²² की carboxyl टर्मिनल टुकड़ा, और glial कोशिकाओं ²³ की सुरक्षा के लिए VEGF या FGF-2 के प्रत्यक्ष प्रशासन के साथ उपचार. इसके अलावा, हम इस्कीमिक retinopathies में ऐसे Semaphorins या Netrins के रूप में शास्त्रीय neuronal मार्गदर्शन संकेत modulating रेटिना के भीतर स्वस्थ वाहिकाओं के संवहनी उत्थान accelerates और फलस्वरूप रोग angiogenesis ^{24, 25} को कम कर देता है कि प्रदर्शन किया है. प्रत्यक्ष नैदानिक ​​प्रासंगिकता के aforementioned, जानवरों के अध्ययन के कई प्रमाण उपलब्ध कराने कि संवहनी फिर से बढ़ावा देनेretinopathies के शुरुआती इस्कीमिक चरण के दौरान पीढ़ी काफी संभावना इस्कीमिक बोझ की कमी के माध्यम से, दृष्टि धमकी पूर्व रेटिना neovascularization ^{19, 23, 24, 26} को कम कर सकते हैं.

कार्यात्मक वाहिकाओं के उत्थान को प्रोत्साहित कि चिकित्सीय रणनीति तैयार करने संवहनी जीव के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम रेटिना के भीतर संवहनी regrowth व्यवस्थित करना रणनीतियों का पता लगाने के लिए ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (OIR) के माउस मॉडल है कि रोजगार एक प्रायोगिक प्रणाली का वर्णन. स्मिथ एट अल द्वारा विकसित 1994. ²⁷ में, इस मॉडल मानव proliferative retinopathies के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है और परिवेश कमरे ₂ हे तनाव (चित्रा को P12 तक 75% ओ ₂ के लिए P7 माउस पिल्ले को प्रकाश में लाने और बाद में पिल्ले को फिर से शुरू करने के होते हैं 1). इस प्रतिमान शिथिल एक समयपूर्व शिशु हवादार है जहां एक परिदृश्य mimicsओ ₂ के साथ. hyperoxia के लिए माउस पिल्ले का जोखिम रेटिना केशिकाओं और microvasculature के अध: पतन भड़काती है, और अधिक से अधिक वीओ क्षेत्र के बाद 48 घंटे (P9) पर पहुंच गया है, हालांकि आम तौर पर, P12 पर ओ ₂ से बाहर निकलने पर आकलन किया vaso-विस्मृति की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्षेत्र (वीओ) पैदावार ओ ₂ ²⁸ के लिए जोखिम. माउस में, avascular वीओ क्षेत्रों अनायास कमरे में हवा के लिए फिर से शुरूआत के बाद सप्ताह के पाठ्यक्रम पर पुनर्जन्म और अंततः वो जोनों पूरी तरह से (चित्रा 2) फिर से vascularized रहे हैं. OIR के अधीन चूहों के कमरे में हवा को पुनः शुरूआत भी आम तौर पर विरोधी angiogenic उपचार मानदंड की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए मूल्यांकन किया है कि पूर्व रेटिना neovascularization (NV) (P17 पर अधिक से अधिक) भड़काती. अपने शुद्ध रूप में, OIR मॉडल ऑक्सीजन प्रेरित संवहनी अध: पतन का आकलन और विनाशकारी पूर्व रेटिना neovascularization ^29-31 की सीमा निर्धारित करने के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और quantifiable उपकरण प्रदान करता है.

30, 31 के द्वारा वर्णित किया गया है. यहाँ हम औषधीय यौगिकों, भावी चिकित्सा विज्ञान, वायरल वैक्टर द्वारा तंत्रिका रेटिना के भीतर शारीरिक revascularization के मॉडुलन जांच करने के लिए या ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों में उम्मीदवार जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक सरल कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करते हैं.

Protocol

आचार बयान: सभी पशु प्रयोग दृष्टि और नेत्र विज्ञान नेत्र में जानवरों के इस्तेमाल और विजन रिसर्च और पशुओं की देखभाल के कनाडा परिषद के लिए (ARVO) बयान में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन द्वारा स्थापित जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन करता है.

1. ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी (OIR)

1. रिकॉर्ड P0 के रूप में माउस पिल्ले की जन्म तिथि.
2. एक पर्याप्त वजन सीमा सुनिश्चित करने के ओ ₂ में प्रवेश पर जानवरों के सभी वजन रिकार्ड. नोट: P17 पर C57BL 6 / चूहों के लिए, शरीर के वजन को अधिक से अधिक NV ³² के लिए 5 और 7.5 ग्राम के बीच सीमा चाहिए. पर्यावरण स्थिरता बनाए रखने के लिए, यह (आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए और साथ ही चूहों प्रयोगात्मक उपचार प्राप्त करना) नियंत्रण के रूप में littermates उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. एक वायरल वेक्टर के प्रभाव का आकलन करते हैं, एक वायरस की tropism पर विचार और virally दिया transgenes की पूर्ण अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त समय की अनुमति मिलनी चाहिए. तेजी से व्यक्त वायरलइस तरह के ³ पीढ़ी lentiviruses ^{24, 25} के रूप में ^{वैक्टर, 33} की सिफारिश की है.
3. P7 (C57BL 6 / या वांछित तनाव) और 5 दिनों ²⁷ के लिए 75% ₂ हे पर सेट एक ऑक्सीजन चैम्बर में मां को बढ़ावा देने के एक CD1 पर जगह माउस पिल्ले. पर्यावरण नमी और तापमान ₂ हे जोखिम में निरंतर आयोजित की गई. नोट: ओ ₂ के एक केंद्रीय स्रोत से सुसज्जित अनुसंधान सुविधाओं आदर्श होते हैं और खाली ओ ₂ टैंक का बोझिल प्रतिस्थापन की सीमा. ट्रांसजेनिक या पीटा चूहों के साथ काम कर रहे हैं, यह है कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों ही उपभेदों ^{30, 29} के भीतर आनुवंशिक drifts सीमित करने के लिए एक ही विक्रेता से प्राप्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
4. P12 पर, ऑक्सीजन चैम्बर से चूहों को हटाने और ओ ₂ परिवेश जानवरों वापसी.

इनर रेटिना को यौगिकों के वितरण के लिए 2. Intravitreal इंजेक्शन (कएक औषधीय यौगिक या पुनः संयोजक प्रोटीन की एन आकलन प्रभाव)

1. P14 पर, ऑक्सीजन 2 एल / मिनट (या पसंद के पशु संरक्षण समिति को मंजूरी दी संवेदनाहारी) में 2% isoflurane के साथ चूहों anesthetize. संज्ञाहरण के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, क्रमिक रूप से संदंश के साथ पूंछ, रियर पैर और कान चुटकी.
2. उसके पेट पर माउस रखें.
3. एक beveled खींच लिया गिलास सुई के साथ लगे एक बाँझ 10 μl सिरिंज का प्रयोग, एक 45 डिग्री के साथ, आँख के पीछे किनारी पर जांच की जा रही यौगिक या वाहन (शारीरिक खारा) युक्त समाधान के 1 μl की एक अधिकतम मात्रा का एक इंजेक्शन प्रदर्शन लेंस से परहेज कोण. नोट: खींच लिया गिलास सुई epoxy राल की एक बूंद का उपयोग सिरिंज से जुड़ा हुआ है.
4. माउस की आंख को एक झाड़ू के साथ स्नेहक नेत्र मरहम (आदर्श एंटीबायोटिक के साथ) की एक बूंद लागू करें.
5. मां को बढ़ावा देने के साथ वापस पिंजरे के लिए माउस लौटें. चूहे तो ध्यान से पुनः तक निगरानी कर रहे हैंकवर और पूरी तरह से चल.

Fluorescein एंजियोग्राफी द्वारा पोत छिड़काव और बाधा समारोह (इंटेग्रिटी) 3. आकलन

1. ऑक्सीजन 2 एल / मिनट (या पसंद के पशु संरक्षण समिति को मंजूरी दी संवेदनाहारी) में 2% isoflurane के साथ चूहों anesthetize. संज्ञाहरण के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, क्रमिक रूप से संदंश के साथ पूंछ, रियर पैर और कान चुटकी. नोट: उत्थान का आकलन किया जाता है जब यह आमतौर पर P17 पर किया जाता है. इसके अलावा ले आउट विश्लेषण P19 और P21 पर संवहनी अखंडता समय में संरक्षित रखा जाता है तो यह निर्धारित करने के लिए.
2. एक बार anesthetized, माउस तौलना.
3. विदारक कैंची के साथ एक midline पेट चीरा. नोट: विदारक उपकरणों को नियमित रूप से जाँच की है और बढ़ाई जानी चाहिए.
4. Laterally पसलियों में कटौती और संदंश की सहायता से ribcage बढ़ा. नोट: यह दिल को नुकसान से बचने के लिए laterally संभव के रूप में कटौती करने के लिए आवश्यक है.
5. Perip हटाने के बाददिल से heral ऊतक, hemostatic संदंश के साथ उतरते महाधमनी दबाना.
6. धीरे धीरे एक 25 जी सुई का उपयोग करते हुए बाएं वेंट्रिकल को fluorescein-dextran इंजेक्षन. नोट: संवहनी बाधा समारोह की जांच की जाती है, तो 70 केडीए fluorescein-dextran पोत अखंडता समझौता किया है जब यह वाहिकाओं के बाहर रिसाव जाएगा के रूप में कार्यरत है. अन्वेषक रक्त वाहिकाओं कास्ट करने के लिए इच्छुक है, 2 एमडीए fluorescein-dextran प्रयोग किया जाता है. महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) एक समरूप पुनर्विभाजन, अपकेंद्रित्र fluorescein-dextran सुनिश्चित करने और सतह पर तैरनेवाला इंजेक्षन, 2) पोत कसना को रोकने के क्रम में, गरम fluorescein-dextran समाधान इंजेक्षन करने के लिए, 3) इसका प्रचलन समय चाहिए अतिरिक्त नहीं 4 मिनट.
7. ऑपरेटिंग कैंची के साथ इंजेक्शन के बाद चूहों 2 मिनट सिर काटना.

4. स्पष्टीकरण और आंख नियतन

नोट: संवहनी उत्थान की दरों का आकलन करते समय, पहली P12 पर और साथ ही P14 और P17 पर retinas इकट्ठा. नमूना समय बिंदु की संख्या में वृद्धिrevascularization ²⁴ की दर से अधिक सही निर्धारण के लिए है.

1. माउस सिर झुकाएं और अपने पक्ष पर जगह है.
2. त्वचा और विदारक कैंची का उपयोग आंख को कवर पलकें निकालें.
3. आंख के नीचे घुमावदार संदंश प्लेस और धीरे ऑप्टिक तंत्रिका कटे है जब तक यह पुल.
4. इसके दूसरे पक्ष पर माउस के सिर बारी और एक ही कदम (4.2 और 4.3 कदम) प्रदर्शन करते हैं.
5. लगानेवाला की बेहतर पहुंच सुनिश्चित करने के लिए, 30 ग्राम सुई का उपयोग आंख की पूर्वकाल कक्ष में एक छेद पंचर.
6. 4% paraformaldehyde (पीएफए) युक्त एक ट्यूब के लिए आँखें स्थानांतरण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए तय कर लो.
7. पीएफए ​​निकालें और ठंडा पीबीएस के समाधान के साथ आंखों में 4 बार धो लो.

5. रेटिना विच्छेदन

1. ठंड पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में माउस आँखों रखें और एक stereomicroscope के तहत retinas के विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं.
2. सूक्ष्म विच्छेदन विज्ञान के साथ आंख के आसपास अतिरिक्त वसा ऊतक / निकालेंssors.
3. सूक्ष्म विच्छेदन कैंची से कॉर्निया काट दिया.
4. संदंश के दो जोड़े का प्रयोग, प्रतिमिनट दूर ऑप्टिक तंत्रिका की ओर परिधि से श्वेतपटल छील और त्यागें.
5. संदंश के साथ लेंस (कॉर्निया के नीचे सफेद गेंद) चुटकी और आंख कप से इसे निकाल सकते हैं. एक एक सहायता के रूप में संदंश की जोड़ी, और पकड़ के लिए अन्य प्रयोग करें और ध्यान से लेंस उठाते हैं और हटा दें.
6. छोटे ब्रश (आकार 0) और संदंश का उपयोग रेटिना के भीतर की ओर से काँचाभ जहाजों को अलग करें.
7. संदंश का उपयोग ऑप्टिक डिस्क से जुड़ा काँचाभ वाहिकाओं के बंडलों निकालें.
8. स्थानांतरण से पहले धुंधला प्रक्रिया शुरू करने के लिए बर्फ पर पीबीएस और जगह से युक्त 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों को retinas विच्छेदित.

6. रेटिना संवहनी धुंधला

1. रात भर कोमल की fluorescently पीबीएस में युग्मित isolectin B4 (rhodamine-लेक्टिन या अन्य) 1 मिमी ₂ CaCl युक्त समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ विच्छेदित retinas सेते
2. अगले दिन, धुंधला समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 3x retinas धो लो.

रेटिना Flatmounts की 7. तैयारी

1. एक खुर्दबीन स्लाइड पर, फोटोरिसेप्टर साइड नीचे retinas, स्थानांतरण और चार बराबर आकार के quadrants में रेटिना को विभाजित करने के लिए एक शल्य चिकित्सा स्केलपेल का उपयोग चार गहरी समान दूरी रेडियल चीरों बनाने. यह कदम नहीं करता है तो चीरों के दौरान, एक ब्रश के साथ रेटिना को संभालो.
2. पीबीएस में भिगो दो ब्रश का प्रयोग, ध्यान quadrants फोटोरिसेप्टर पक्ष नीचे समतल और तस्वीर विरंजन रोकने के बढ़ते मध्यम में रेटिना विसर्जित कर दिया. तो ध्यान से दबाव लागू करने और हवा के बुलबुले कवर पर्ची के तहत जमा नहीं करना सुनिश्चित बनाने के बिना घुड़सवार रेटिना की सतह पर एक coverslip जगह. </ ली>

8. इससे पहले ³¹ में वर्णित इमेजिंग और Vasoobliteration (वीओ) और neovascularization (NV) की मात्रा का ठहराव के रूप में

1. 10X के एक बढ़ाई एक महामारी प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ पूरे घुड़सवार retinas की छवियों ले लो.
2. तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर में रेटिना छवि को खोलने, एक साथ सिलाई और कुल रेटिना क्षेत्र, और avascular क्षेत्र को मापने. क्षेत्र पिक्सल में व्यक्त किया जा सकता है.
3. कुल रेटिना क्षेत्र में पिक्सल की संख्या से avascular क्षेत्र में बॉलीवुड की संख्या से विभाजित करके वीओ की सीमा निर्धारित.
4. वर्णित ³¹ के रूप में कुल रेटिना क्षेत्र में पिक्सल की संख्या से एनवी की बॉलीवुड की संख्या से विभाजित करके एनवी की सीमा निर्धारित.

Representative Results

OIR मॉडल व्यापक रूप से रेटिना में ऑक्सीजन प्रेरित संवहनी अध: पतन और ischemia प्रेरित रोग neovascularization अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और नेत्र रोगों के ^{27, 29, 30} के लिए वर्तमान में कार्यरत विरोधी angiogenic उपचार के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. इस मॉडल का उपयोग कर प्राप्त निष्कर्ष शिथिल ऐसे proliferative मधुमेह रेटिनोपैथी और कुसमयता ³⁰ की रेटिनोपैथी के रूप में इस्कीमिक retinopathies के लिए extrapolated किया जा सकता है.

यहाँ हम संवहनी उत्थान अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का एक विकल्प का उपयोग उपस्थित थे. हमने हाल ही में हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित किया गया था कि इस्कीमिक रेटिना को पुनर्जीवित करने के लिए एक रणनीति का एक उदाहरण का वर्णन करेंगे. प्रस्तुत अध्ययन में, हम निरंतर neuronal ischemia जालिका (ईआर) तनाव और अपने प्रेरक endoribonucleases IRE1α, शास्त्रीय neuronal मार्गदर्शन क्यू netrin -1 की cleaves mRNA की एक के माध्यम से सक्रिय हो जाता है कि प्रदर्शित करता है. हम बताते हैंNetrin -1 की कि इंट्रा आंख का वितरण, रेटिना माइलॉयड कोशिकाओं में विरोहक angiogenesis के एक कार्यक्रम को उत्तेजित करता है और इस प्रकार OIR ²⁵ के बाद तंत्रिका ऊतक revascularization accelerates. इसके अलावा, हम IRE1α की lentiviral मध्यस्थता मुंह बंद का उपयोग कर त्वरित संवहनी उत्थान का एक उदाहरण प्रदान करते हैं.

वर्णित प्रयोगात्मक मानदंड विकल्प की खोज का उपचार जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, intravitreal इंजेक्शन के समय बिंदु का पता लगाया परिसर की प्रकृति के आधार पर निर्धारित किया जाता है और ध्यान में जांच की उपचार कृत्यों व्यवस्था है जिसके द्वारा ले लेना चाहिए. यह एक तेजी से अभिनय हस्तक्षेप revascularization (आंकड़े की दर में तेजी लाने में मदद मिल सकती रेटिना revascularization अभी तक तेजी है जहां एक समय बिंदु से मेल खाती है के रूप में उदाहरण के लिए, एक औषधीय यौगिक (रिसेप्टर agonist, प्रतिपक्षी, आदि) का अध्ययन करने के लिए, P14 चुना जा सकता है 2 और 3 ए). वायरल वैक्टर हैं जब, कार्यरत पर्याप्त समय यात्री जीन और एक पहले के समय बिंदु की पूर्ण अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देने के लिए आवंटित किया जाना चाहिए transgene या लक्ष्य जीन का पूरा मुंह बंद (चित्रा 4) की पूर्ण अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए चुना जा सकता है. Lentiviral आधारित वैक्टर विशेष रूप से अच्छी तरह से अपने तेजी अभिव्यक्ति, कम भड़काऊ प्रतिक्रिया और उत्पादन ^{24, 25} की आसानी के लिए इस संबंध में उपयुक्त हैं. यह लक्ष्य जीन उपयुक्त रेटिना सेल की आबादी (RGC, endothelial सेल, मुलर सेल, आदि) के लिए दिया जाता है, इसलिए चयनित वायरल वेक्टर के tropism विचार किया जाना चाहिए कि कुछ बनाने के लिए भी महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों का उपयोग संवहनी उत्थान में एक जीन की भूमिका का अध्ययन इंट्रा आंख का इंजेक्शन प्रदर्शन करने की जरूरत नहीं का लाभ प्रदान करता है.

चित्रा 1.. माउस पिल्ले और नर्सिंग माताओं P12 के लिए P7 से 75% ₂ हे के संपर्क में हैं माउस OIR मॉडल के योजनाबद्ध चित्रण. स्थिर ओ ₂ वितरण और oximeter के साथ एक हवादार ऑक्सीजन चैम्बर की आवश्यकता है. इस प्रारंभिक अवधि के दौरान, रेटिना vaso-विस्मृति होती है. P12, चूहों में अधिक से अधिक रोग पूर्व रेटिना tufting तब होता है जब P17 जब तक कमरे में हवा (21% ₂ हे) के लिए लौट रहे हैं. Neovascularization के बाद के दिनों से अधिक शराबा. संवहनी उत्थान की जांच के लिए आदर्श अवधि P12 और P17 के बीच खिड़की है. Vaso-विस्मृति की हद के लिए कई बार अंक नमूना और आकलन revascularization का सटीक दरों elucidating के लिए महत्वपूर्ण है.

चित्रा 2. ऑक्सीजन प्रेरित vaso-oblite निम्नलिखित रेटिना revascularization के समय पाठ्यक्रमराशन. एक रेटिना flatmounting प्रक्रिया का एक) ग्राफिक चित्रण. एक चीरा कॉर्निया (काला ग्रे गुंबद) के शीर्ष और श्वेतपटल (बिंदीदार लाल लाइनों) के माध्यम से किया जाता है और रेटिना बाहर छेड़ा है. लेंस कॉर्निया / श्वेतपटल खोलने के बाद या श्वेतपटल चित्र में दिखाया गया के रूप में निकाले जाने के बाद या तो निकाला जा सकता है. शीशे जैसा वाहिकाओं तो हटा दिया और प्रदर्शन किया रेटिना वाहिकाओं के धुंधला कर रहे हैं. धुंधला प्रोटोकॉल समाप्त हो जाने के बाद, रेटिना तो 4 समान रूप से स्थान दिया गया है वर्गों में कटौती और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पोत साइड अप. बी) OIR के अधीन चूहों से Lectin से सना हुआ flatmount retinas पर मुहिम शुरू की है. जहाजों पुनर्जन्म के रूप में, (यहां P12 पर अधिक से अधिक) vaso-विस्मृति के क्षेत्र रोग neovascularization P17 पर अधिक से अधिक है और लेक्टिन दाग OIR retinas में संतृप्त धब्बे के रूप में दिखाई देता है अंदर भर जाता है. P19-P21 करके, रेटिना पूरी तरह से उनके संवहनी नेटवर्क पुनर्जीवित किया है. (यह आंकड़ा बिनेट एट अल. सेल चयापचय 2013 ²⁵ से संशोधित किया गया है)

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Netrin-1:. रेटिना संवहनी उत्थान accelerates कि एक इंजेक्शन उपचार के चित्रा 3 उदाहरण. ए) Netrin -1 P17 पर मूल्यांकन संवहनी regrowth की P14 और हद में इंजेक्ट किया जाता है. संवहनी उत्थान में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि मनाया जाता है. बी) संवहनी अखंडता एक कम आणविक भार फ्लोरोसेंट dextran साथ छिड़काव द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. जहाजों समझौता बाधा समारोह दिखाने के लिए, फ्लोरोसेंट dextran पोत (तीर) के बाहर लीक करेंगे. (यह आंकड़ा बिनेट एट अल. सेल चयापचय 2013 ²⁵ से संशोधित किया गया है)

जीन मुंह बंद वाई की चित्रा 4. उदाहरणवें रेटिना संवहनी उत्थान के लिए shRNAs lentiviral दिया. Lv.shIRE1α संवहनी उत्थान सहायता करने के लिए रेटिना नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में IRE1α की जीन मुंह बंद करने की क्षमता का आकलन करने के लिए, एक shIRE1α के लिए एक lentivirus कोडिंग की एक intravitreal इंजेक्शन पर्याप्त समय की अनुमति पी 3 में इंजेक्ट किया गया था संवहनी विकास और vaso-विस्मृति का आकलन किया जाता है जब जीन मुंह बंद करने के लिए. इस उदाहरण में कार्यरत ³ पीढ़ी lentivirus प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित करने के लिए इंजीनियर एक संशोधित vesicular stomatitis वायरस ग्लाइकोप्रोटीन (VSV जी), शामिल हैं. इन वैक्टर प्रभावी रूप से रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं को संक्रमित हालांकि, अभिव्यक्ति अन्य स्थानीय प्रकार की कोशिकाओं में यह भी कहा जा सकता है. (क) इस उपचार बाद में समय बिंदुओं पर मापा vaso-विस्मृति पर सभी मनाया लाभ बढ़ संवहनी उत्थान के कारण हैं कि वाचक, P12 पर निर्धारित के रूप में ऑक्सीजन प्रेरित vaso-विस्मृति में ध्यान देने योग्य बदलाव के लिए नेतृत्व नहीं किया था. IRE1α (बी) निषेध मैंn इस प्रतिमान नाटकीय रूप P17 पर OIR के regrowth चरण में संवहनी उत्थान बढ़ाया. ऐसे P14 के रूप में vaso-विस्मृति का एक तिहाई समय बिंदु का आकलन (सी) (यह आंकड़ा बिनेट एट अल. सेल चयापचय 2013 ²⁵ से संशोधित किया गया है), revascularization का सही दरों का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है. (यह आंकड़ा Joyal एट अल. रक्त 2011 ²⁴ से संशोधित किया गया है) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस्कीमिक तंत्रिका ऊतक में नए स्वस्थ वाहिकाओं के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका क्या है? इसके साथ हस्तक्षेप और नाड़ी regrowth होने वाली स्वाभाविक रूप से तेजी लाने के लिए चिकित्सा के आधार पर वैध है? ऐसे इस्कीमिक retinopathies या स्ट्रोक के रूप में न्यूरो इस्कीमिक विकृतियों में, संवहनी अध: पतन कम neuronal समारोह ^35-38 के साथ जुड़ा हुआ है. इसलिए इस रोग के प्रारंभिक / तत्काल खंड दौरान क्षेत्रीय माइक्रो परिसंचरण बहाली, जल्दी चोट का मुकाबला करने के लिए फायदेमंद साबित हो सकता है. एक आंख का संदर्भ में, इस्कीमिक रेटिना की revascularization में तेजी लाने कि प्रयोगात्मक मानदंड रोग neovascularization ^{21-25, 34} और इस तरह इस दृष्टिकोण गुण आगे की जांच पड़ताल को कम.

20 साल पहले इसकी शुरूआत के बाद, OIR मॉडल ²⁷ रेटिना angiogenesis अनुसंधान ³⁰ क्रांति ला दी है. यहाँ हम भावी शुरू अध्ययन करने के लिए इस मॉडल के लिए एक अतिरिक्त आवेदन प्रदानइस्कीमिक रेटिना में शारीरिक संवहनी उत्थान व्यवस्थित करना egies. एक आदर्श पशु मॉडल ऐसे मानव patho-शरीर क्रिया विज्ञान के लिए निकटता, उच्च reproducibility, आदर्श तेजी से निष्पादन और, कम लागत के रूप में कई मानदंडों घेरना चाहिए. OIR के माउस मॉडल इन सभी मापदंडों को पूरा करने और किए बाहर किया जा सकता है कम से कम 3 सप्ताह में.

कई सूचीबद्ध लाभ के बावजूद, कमियां पूर्व विश्लेषण करने के लिए माउस का बलिदान करने के लिए वर्तमान की आवश्यकता शामिल हैं और एक जानवर की इसलिए सही अनुदैर्ध्य निगरानी वर्तमान इमेजिंग उपकरणों के साथ अभी तक संभव नहीं है. वर्तमान में, इस तरह के अक्तूबर या fluorescein एंजियोग्राफी के रूप में vivo इमेजिंग तकनीक के कारण के लिए प्रासंगिक नहीं हैं जो रेटिना के सबसे केंद्रीय क्षेत्रों के लिए इमेजिंग कवरेज ³⁹ कम कर देता है जो माउस आंख (वक्रता त्रिज्या और छोटे आकार के) के निहित ऑप्टिकल सीमा को काफी हद तक असफल रहे हैं मॉडल के प्रारंभिक दौर.

पी के रूप में संवहनी उत्थान का अध्ययन करने के लिए नियोजित करते हैंइस प्रोटोकॉल के पेपर में roposed, neovascularization का अध्ययन करने के लिए लागू होने वाले सभी कारणों से भी निगरानी की जानी चाहिए. ये भारी angiogenesis ³² को प्रभावित करती है जो पिल्ला की चयापचय स्वास्थ्य, अनुमान लगाने के लिए रिकॉर्डिंग पशु वजन शामिल हैं. Hyperoxic कक्ष में ऑक्सीजन तनाव की सटीक नियंत्रण भी महत्वपूर्ण है. ऑक्सीजन एकाग्रता में परिवर्तन अनिवार्य रूप से महत्वपूर्ण डेटा अशुद्ध अर्थ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो vasoobliteration पर सीधा प्रभाव पड़ता है. इसलिए यह चैम्बर ऑक्सीजन एकाग्रता की निरंतर इलेक्ट्रॉनिक निगरानी को लागू करने या कम से कम में, ऑक्सीजन के स्तर में दैनिक परिवर्तन की निगरानी और लगातार ऑक्सीजन के स्तर को बनाए रखने के लिए oxycycler दरवाजा खोलने की सीमा या तो सिफारिश की है. Retinas के इष्टतम प्रसंस्करण भी अभ्यास लेता है. निष्कर्षण, बढ़ते और रेटिना के धुंधला अपेक्षाकृत कमजोर रेटिना के रूप में देखभाल के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए नाजुक नियंत्रित किया जाना चाहिए. इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों, एक कॉलोनी सी की आनुवंशिक बहाव के साथ सभी प्रयोग के लिए के रूप मेंएक उलझाना परिणाम. (उदाहरण के लिए एक माउस कॉलोनी में) एक चयनात्मक बल के अभाव में, allelic या आनुवंशिक बहाव समय की एक छोटी अवधि में जनसंख्या में बड़ा परिवर्तन हो सकता है कि एक यादृच्छिक प्रक्रिया है. एलील आवृत्तियों पीढ़ी से पीढ़ी को बदलने के लिए और एक उप कॉलोनी ^{40, 41} के गठन में परिणाम कर सकते हैं. ये परिवर्तन काफी हद तक undetectable रहे हैं और यह एक ही कॉलोनी में एक ही ब्रीडर जोड़े द्वारा उत्पादित पीढ़ियों की संख्या सीमित करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. उच्चतम आनुवंशिक स्थिरता प्राप्त करने के लिए सबसे कारगर तरीका हर पांच पीढ़ियों "स्टॉक" ताज़ा या समान पृष्ठभूमि की एक खरीदे माउस के साथ backcrossing के लिए आगे बढ़ना है.

यह भी रेटिना अध: पतन उत्परिवर्तन (आरडी) 1 और 8 ^42, कम से कम एक बार के लिए परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है समयपूर्व फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है कि phenotypes confounding से बचने के लिए एक नई लाइन शुरू करने से पहले. ट्रांसजेनिक जानवर,यह नियंत्रण और उत्परिवर्ती चूहों दोनों एक ही विक्रेता से प्राप्त की है और एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर जरूरी होते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.

हम रक्त वाहिनियों के गठन और विकास के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए जारी है, उपन्यास, तेजी लाने धीमी गति से, या नवजात रक्त वाहिकाओं उत्पन्न कर रहे हैं बधिया करने के लिए दृष्टिकोण. Vascularization के मॉडुलन एक रोग संदर्भ में vivo में पता लगाया जा सकता है, जिसमें एक मॉडल प्रणाली सीएनएस के भीतर neuronal ischemia मुकाबला करने के लिए संभावित चिकित्सकीय मानदंड का पता लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान कर सकता है. संवहनी उत्थान अध्ययन करने के लिए माउस OIR मॉडल आदत डाल इस तरह के एक स्थल प्रदान करता है और शारीरिक और रोग angiogenesis के लिए आणविक आधार की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945