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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris

Published: June 23, 2014 doi: 10.3791/51351
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1,2,3
1Department of Neurology-Neurosurgery, McGill University, 2Department of Biochemistry, Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Centre, University of Montréal, 3Department of Ophthalmology, Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Centre, University of Montréal

Summary

La rétine de rongeur a depuis longtemps été reconnue comme une fenêtre accessible au cerveau. Dans ce document technique que nous fournissons un protocole qui utilise le modèle de souris de la rétinopathie induite par l'oxygène d'étudier les mécanismes qui conduisent à l'échec de la régénération vasculaire dans le système nerveux central après lésion ischémique. Le système décrit peut également être mise à profit pour explorer des stratégies pour favoriser la repousse des vaisseaux sanguins fonctionnels au sein de la rétine et du système nerveux central.

Abstract

La rétine de rongeurs est peut-être le système de mammifère la plus accessible qui pour enquêter interaction neurovasculaire dans le système nerveux central (SNC). Il est de plus en plus reconnu que plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, sclérose en plaques et éléments présents latérale amyotrophique de compromis vasculaire. En outre, les causes les plus importantes de cécité chez les populations pédiatriques et en âge de travailler (rétinopathie du prématuré et de la rétinopathie diabétique, respectivement) sont caractérisées par une dégénérescence vasculaire et l'échec de la repousse vasculaire physiologique. Le but de ce document technique est de fournir un protocole détaillé pour étudier la régénération du SNC vasculaire dans la rétine. Le procédé peut être utilisé pour élucider les mécanismes moléculaires qui conduisent à une défaillance de la croissance vasculaire après une lésion ischémique. En outre, les modalités thérapeutiques potentiels pour accélérer et restaurer plexus vasculaires sains peuvent être explorées. Les résultats obtained en utilisant l'approche décrite peut fournir des pistes thérapeutiques pour les rétinopathies ischémiques telles que celle du diabète ou de prématurité et de bénéficier éventuellement d'autres troubles vasculaires du SNC.

Introduction

Tout au long de développement du système nerveux central, des nerfs, des cellules immunitaires et des vaisseaux sanguins établir des réseaux remarquablement couplés pour assurer une perfusion tissulaire suffisante et permettre la transmission de l'information sensorielle 5.1. La ventilation des résultats des systèmes vasculaires de l'oxygénation insuffisante des tissus et de l'offre de compromis métabolique et est de plus en plus reconnu comme un facteur important dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives 6. Abandon vasculaire et la détérioration de l'unité neurovasculaire dans le cerveau, par exemple, est associé à la démence vasculaire, lésions vasculaires de la substance blanche du cerveau 7 et la maladie d'Alzheimer avec une sténose des artérioles et des petits vaisseaux 8. En outre, la fonction vasculaire altération de la barrière est pensé pour contribuer sclérose en plaques 9 et la sclérose latérale amyotrophique 10.

Un intérêt direct pour le modèle de la rétine décrite dans ce protocole, aveuglantedes maladies telles que la rétinopathie diabétique et la rétinopathie de la 11 prématurité 12, 13 sont caractérisés par une phase de dégénérescence vasculaire précoce. La contrainte ischémique qui a suivi sur la rétine neuro-vasculaire déclenche une deuxième phase de la néovascularisation excessive et pathologique qui provient probablement comme une réponse compensatoire de rétablir la oxygène et de l'énergie 14-16. Une stratégie intéressante pour surmonter le stress ischémique qui est au cœur de la progression de la maladie est de rétablir les réseaux vasculaires fonctionnelles en particulier dans les zones ischémiques du neuro-rétine (figures 2 et 3). Provoquer une réponse angiogénique contrôlée peut apparaître comme contre-intuitif pour une condition dans laquelle les traitements anti-angiogéniques tels que des anti-VEGF sont considérés comme des traitements adaptés. Pourtant, la preuve de la validité de cette approche est de montage. Par exemple, l'amélioration de la repousse vasculaire "physiologique-like" dans ischemrétinopathies ic a été élégamment démontré par l'introduction de précurseurs de cellules endothéliales 17, l'inhibition de Müller VEGF exprimés cellule-régulation négative induite par d'autres facteurs angiogéniques 18, l'injection de progéniteurs myéloïdes 19, l'inhibition de la NADPH oxydase induite par l'apoptose 20, ce qui augmente l'alimentation ω-3 gras polyinsaturé l'apport d'acide 21, le traitement avec un fragment carboxy-terminal de tryptophane 22 ARNt synthétase, et l'administration directe de VEGF ou le FGF-2, pour la protection des cellules gliales 23. De plus, nous avons démontré que la modulation de signaux de guidage neuronales classiques tels que Sémaphorines ou Nétrines dans les rétinopathies ischémiques vasculaire accélère la régénération des vaisseaux sains à l'intérieur de la rétine et réduit l'angiogenèse pathologique 24, 25 en conséquence. De pertinence clinique directe, plusieurs des études sur les animaux mentionnés ci-dessus fournissent des preuves que la promotion de re vasculairegénération pendant la phase ischémique précoce des rétinopathies peut réduire considérablement menaçant la vue néovascularisation pré-rétinienne 19, 23, 24, 26, probablement grâce à la réduction de la charge ischémique.

L'élaboration de stratégies thérapeutiques qui stimulent la régénération des vaisseaux fonctionnels demeure un défi important pour les biologistes vasculaires. Ici, nous décrivons un système expérimental qui utilise le modèle de souris de rétinopathie induite par l'oxygène (OIR) pour explorer des stratégies pour moduler la repousse vasculaire dans la rétine. Développé par Smith et al., En 1994 27, ce modèle sert de proxy pour les rétinopathies prolifératives humaines et consiste à exposer les petits P7 de souris à 75% d'O 2 jusqu'à P12, puis réintroduire les chiots à la salle ambiante O 2-tension (Figure 1). Ce paradigme imite vaguement un scénario où un enfant prématuré est ventiléavec O 2. L'exposition des souriceaux à hyperoxie provoque la dégénérescence des capillaires rétiniens et microvasculaire, et donne une zone de reproduction de vaso-oblitération (VO) généralement évalué à la sortie de O 2 à P12, même si la superficie maximale de VO est atteinte à 48 h (P9) après exposition à O 2 28. Chez la souris, les zones de VO avasculaires régénérer spontanément au cours de la semaine suivant la réintroduction de l'air ambiant et, éventuellement, des zones VO sont complètement re-vascularisées (figure 2). Réintroduction de l'air ambiant de souris soumises à OIR provoque également la néovascularisation pré-rétinienne (NV) (maximale à P17) qui est généralement évaluée afin de déterminer l'efficacité des paradigmes de traitement anti-angiogéniques. Dans sa forme la plus pure, le modèle de ROC est un outil hautement reproductible et quantifiable pour évaluer la dégénérescence vasculaire induite par l'oxygène et de déterminer l'étendue de la destruction néovascularisation pré-rétinienne 29-31.

30, 31. Ici, nous fournissons une procédure simple étape par étape pour étudier la modulation de revascularisation physiologique dans la rétine neurale par des composés pharmacologiques, thérapeutiques potentiels, vecteurs viraux ou d'étudier l'influence de gènes candidats chez des souris transgéniques ou knock-out.

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Protocol

Déclaration éthique: Tout l'expérimentation animale est conforme aux directives de protection des animaux établies par l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research et le Conseil canadien de protection des animaux.

1. Oxygène induit la rétinopathie (OIR)

  1. Enregistrer la date de naissance de souriceaux que P0.
  2. Enregistrer tous les poids des animaux lors de l'entrée en O 2 pour assurer une gamme de poids adéquat. Remarque: Pour C57BL / 6 à P17, le poids corporel doit être comprise entre 5 et 7,5 g pour NV maximale 32. Afin de maintenir la cohérence de l'environnement, il est recommandé d'utiliser la même portée que le contrôle (pour les souris génétiquement modifiées ainsi que les souris recevant des traitements expérimentaux). Lors de l'évaluation des effets d'un vecteur viral, il faut considérer le tropisme du virus et laisser suffisamment de temps pour la pleine expression de transgènes d'origine virale livrés. Viral exprimant rapidementvecteurs tels que les lentivirus 3 e génération 24, 25, 33 sont recommandés.
  3. Chiots Lieu de souris à P7 (C57BL / 6 ou souhaité souche) et CD1 favoriser mère dans une chambre à oxygène fixé à 75% d'O 2 pendant 5 jours 27. L'humidité ambiante et la température ont été maintenues constantes tout au long de l'exposition O 2. Remarque: Les installations de recherche équipés d'une source centrale d'O 2 sont idéales et limitent le remplacement lourde de vide O 2 réservoirs. Si l'on travaille avec des souris transgéniques ou knock-out, il est important de veiller à ce que le contrôle et les souris expérimentales sont acquis auprès du même fournisseur de limiter les dérives génétiques dans les mêmes souches 30, 29.
  4. À P12, les souris retirer de la chambre de l'oxygène et de revenir à la température ambiante animaux O 2.

2. Injection intravitréenne de livraison des composés de la rétine interne (WhEffets en Évaluation d'un composé pharmacologique ou protéine recombinante)

  1. À P14, anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène de 2 L / min (ou à la protection des animaux anesthésique de choix comité approuvé). Afin de vérifier l'efficacité de l'anesthésie, pincer successivement la queue, pied arrière et l'oreille avec une pince.
  2. Placez la souris sur le ventre.
  3. L'utilisation d'un 10 ul seringue stérile munie d'une aiguille tirée verre biseauté, effectuer une injection d'un volume maximal de 1 pl de solution contenant le composé objet de l'enquête ou du véhicule (solution saline physiologique) au niveau du limbe postérieur de l'oeil, avec un 45 ° angle d'éviter la lentille. Remarque: Le verre-aiguille tirée est fixée à la seringue en utilisant une goutte de résine époxy.
  4. Appliquer une goutte de pommade ophtalmique lubrifiant (de préférence avec un antibiotique) avec un tampon à l'oeil de la souris.
  5. Retour de la souris vers la cage avec la promotion de la mère. Les souris sont ensuite soigneusement surveillés jusqu'à recouverte et entièrement ambulatoire.

3. Évaluation de la perfusion du navire et de la fonction barrière (intégrité) par angiographie à la fluorescéine

  1. Anesthésier les souris avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène de 2 L / min (ou à la protection des animaux anesthésique de choix comité approuvé). Afin de vérifier l'efficacité de l'anesthésie, pincer successivement la queue, pied arrière et l'oreille avec une pince. Note: Ceci est généralement effectuée au P17 lorsque la régénération est évaluée. Porter-out également l'analyse à P19 et P21 pour déterminer si l'intégrité vasculaire est conservé au fil du temps.
  2. Une fois anesthésié, peser la souris.
  3. Faire une incision médiane de l'abdomen avec des ciseaux de dissection. Remarque: Instruments de dissection doivent être régulièrement vérifiés et affûtés.
  4. Couper les côtes latéralement et soulever la cage thoracique à l'aide d'une pince. Remarque: Il est nécessaire de couper que latéralement que possible pour éviter des dommages au coeur.
  5. Après avoir retiré peripheral tissus du coeur, pince l'aorte descendante avec des pinces hémostatiques.
  6. Injecter lentement la fluorescéine-dextran dans le ventricule gauche à l'aide d'une aiguille G 25. Remarque: Si la fonction de barrière vasculaire est étudiée, 70 kDa fluorescéine-dextran est utilisé comme il fuira des navires lorsque l'intégrité du navire est compromise. Si l'enquêteur veut jeter les vaisseaux sanguins, 2 Mda fluorescéine-dextran est utilisé. Les étapes critiques: 1) Pour assurer une répartition homogène, centrifugeuse fluorescéine-dextran et injecter le surnageant, 2) Afin de prévenir la constriction des vaisseaux, injecter la solution de fluorescéine-dextran réchauffé, 3) Le temps de circulation ne devraient pas l'excès de 4 min.
  7. Décapiter souris 2 min après l'injection avec des ciseaux d'exploitation.

4. Énucléation des yeux et de fixation

Remarque: Lors de l'évaluation des taux de régénération vasculaire, d'abord recueillir des rétines à P12 et P14 et en outre au P17. Augmenter le nombre de point de temps échantillonnés pour une détermination plus précise des taux de revascularisation 24.

  1. Incliner la tête de la souris et placez-le sur le côté.
  2. Enlever la peau et les paupières couvrant l'œil en utilisant des ciseaux de dissection.
  3. Placez la pince courbes ci-dessous l'oeil et tirez-le doucement jusqu'à ce que le nerf optique est coupée.
  4. Tournez la tête de la souris sur son autre côté et effectuer les mêmes étapes (étapes 4.2 et 4.3).
  5. Afin d'assurer une meilleure pénétration de fixateur, percer un trou dans la chambre antérieure de l'oeil en utilisant aiguille G 30.
  6. Transfert yeux dans un tube contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) et le fixer pendant 1 heure à température ambiante.
  7. Retirer PFA et laver les yeux 4 fois avec une solution de PBS glacé.

5. Dissection de la rétine

  1. Placez les yeux de souris dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid et effectuer la dissection des rétines sous un stéréomicroscope.
  2. Retirez la graisse supplémentaire / tissu entourant l'oeil avec micro-dissection sciencessors.
  3. Coupez la cornée avec des ciseaux micro-dissection.
  4. L'utilisation de deux paires de pinces, éplucher minutieusement la sclérotique loin de la périphérie vers le nerf optique et jeter.
  5. Pincez la lentille (boule blanchâtre en dessous de la cornée) avec une pince et l'extraire de l'œilleton. Utilisez une paire de pinces comme un support, et l'autre pour saisir et soulever soigneusement et retirez l'objectif.
  6. Détachez les navires hyaloïde de la face interne de la rétine à l'aide de petites brosses (taille 0) et des pinces.
  7. Retirer des faisceaux de vaisseaux hyaloïde connectés au disque optique en utilisant une pince.
  8. Transfert disséqué rétines à 2 tubes ml à centrifuger contenant du PBS et placer sur la glace avant de commencer la procédure de coloration.

6. Vasculaire rétinienne coloration

  1. Incuber les rétines disséqués pendant une nuit sous agitation douce à 4 ° C dans une solution de fluorescence couplée-isolectine B4 (rhodamine-lectine ou autre) dans du PBS contenant 1 mM CaCl 2,
  2. Le lendemain, éliminer la solution colorante et laver rétines 3x dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.

7. Préparation de la rétine Flatmounts

  1. Transfert rétines, photorécepteur côté vers le bas, sur une lame de microscope et faire quatre incisions radiales équidistantes profondes à l'aide d'un scalpel pour diviser la rétine en quatre quadrants de taille égale. Au cours des incisions, de bloquer la rétine avec une brosse de sorte qu'il ne se déplace pas.
  2. L'utilisation de deux brosses trempées dans du PBS, aplatissez soigneusement quadrants photorécepteur tête en bas et plonger la rétine en milieu de montage pour empêcher photo-blanchiment. Ensuite, placer soigneusement une lamelle sur la surface de la rétine monté sans pression et faire en sorte que les bulles d'air ne s'accumulent pas sous la lamelle. </ Li>

8. Imagerie et la quantification des Vasoobliteration (VO) et la néovascularisation (NV) comme décrit précédemment 31

  1. Prenez des photos de toute montés rétines avec un microscope à épifluorescence à un grossissement de 10X.
  2. Ouvrez l'image rétinienne au logiciel de retouche photo, assembler et mesurer la superficie total de la rétine, et la zone avasculaire. Zone peut être exprimée en pixels.
  3. Déterminer l'étendue de VO en divisant le nombre de pixels dans la zone avasculaire par le nombre de pixels dans la zone de la rétine totale.
  4. Déterminer l'étendue de la SA en divisant le nombre de pixels de NV par le nombre de pixels dans la zone de la rétine totale comme décrit 31.

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Representative Results

Le modèle de ROC est largement utilisée pour étudier la dégénérescence vasculaire induite par l'oxygène et l'ischémie induite par la néovascularisation pathologique dans la rétine et a joué un rôle dans le développement de traitements anti-angiogéniques actuellement utilisés pour les maladies oculaires 27, 29, 30. Les résultats obtenus à l'aide de ce modèle peuvent être plus ou moins extrapolés à rétinopathies ischémiques telles que la rétinopathie diabétique proliférante et la rétinopathie du prématuré 30.

Ici, nous présentons une utilisation de ce modèle alternatif à étudier la régénération vasculaire. Nous allons décrire un exemple de stratégie pour régénérer la rétine ischémique qui a été récemment publié par notre laboratoire. Dans l'étude présentée, nous démontrons que l'ischémie neuronale soutenue active réticulum endoplasmique (RE) par l'intermédiaire d'une contrainte et de ses effecteurs endoribonucléases IRE1α, clive l'ARNm de l'orientation classique neuronale cue nétrine-1. Nous montronsque la livraison intra-oculaire de la nétrine-1, stimule un programme de l'angiogenèse de réparation dans les cellules myéloïdes de la rétine et accélère la revascularisation de tissus nerveux après ROC 25 donc. De plus, nous fournissons un exemple de régénération vasculaire accéléré en utilisant lentivirus médiée silence de IRE1α.

Les paradigmes expérimentaux décrits peuvent être modifiés pour enquêter sur le traitement exploratoire de choix. Fait important, le point d'injection intravitréenne de temps est déterminée sur la base de la nature du composé étudié et doit prendre en considération le mécanisme par lequel le traitement étudié agit. Par exemple, pour étudier un composé pharmacologique (agoniste du récepteur antagoniste, etc), P14 peut être choisi car il correspond à un point de temps où la revascularisation de la rétine s'accélère encore une intervention à action rapide peut aider à accélérer le taux de revascularisation (figures 2 et 3a). Lorsque les vecteurs viraux sontemployé, le temps doit être alloué pour permettre la pleine expression du gène de passagers et un point de temps auparavant peut être choisi pour assurer la pleine expression du transgène ou complet silence du gène cible (Figure 4). Lentiviraux à base de vecteurs sont particulièrement bien adaptés à cet égard en raison de leur expression rapide, faible réponse inflammatoire et la facilité de la production 24 25. Il est également essentiel de s'assurer que le gène cible est livré à la population de cellules rétiniennes approprié (RGC, cellules endothéliales, cellules Müller, etc), d'où le tropisme du vecteur viral choisi doit être considéré. En variante, l'étude du rôle d'un gène en utilisant la régénération vasculaire transgéniques ou knock-out animaux offre l'avantage de ne pas avoir besoin d'effectuer des injections intra-oculaires.

Figure 1 Figure 1. Représentation schématique du modèle de ROC de la souris. Chiots de souris et les mères allaitantes sont exposés à 75% d'O 2 de P7 à P12. Une chambre à oxygène ventilé avec une livraison régulière O 2 et oxymètre est nécessaire. Au cours de cette période initiale, la rétine vaso-oblitération se produit. À P12, les souris sont renvoyés à l'air ambiant (21% d'O 2) jusqu'à ce que P17 maximale lorsque tufter pré-rétinienne pathologique se produit. Néovascularisation recule dans les jours suivants. La période idéale pour étudier la régénération vasculaire est la fenêtre entre P12 et P17. L'échantillonnage et l'évaluation de plusieurs points dans le temps pour l'ampleur de vaso-oblitération est la clé pour élucider les taux exacts de revascularisation.

Figure 2
Figure 2. Cours Temps de revascularisation de la rétine induite par l'oxygène suivant vaso-obliteration. A) La représentation graphique d'une procédure de flatmounting rétine. Une incision est faite à travers le sommet de la cornée (dôme noir-gris) et la sclérotique (lignes rouges en pointillés) et la rétine est taquiné sur. La lentille peut être extraite, soit après l'ouverture de la cornée / sclère ou une fois la sclérotique est enlevée, comme indiqué sur le schéma. Navires hyaloïde sont ensuite retirés et la coloration des vaisseaux rétiniens effectuées. Une fois que le protocole de coloration est terminée, la rétine est ensuite découpé en quatre sections équidistantes et monté sur une lame de microscope navire-côte-up. B) de rétines flatmount lectine marqués des souris soumises à une OIR. Comme les navires se régénèrent, le domaine de la vaso-oblitération (ici maximale à P12) remplit po néovascularisation pathologique est maximale à P17 et apparaît comme des points saturés dans lectine teinté rétines OIR. Par P19-P21, rétines ont entièrement régénéré leurs réseaux vasculaires. (Ce chiffre a été modifié depuis Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> Figure 3
. Figure 3: Exemple d'un traitement injectable qui accélère la régénération vasculaire rétinienne: la nétrine-1. A) la nétrine-1 est injecté à P14 et l'étendue de la repousse vasculaire évaluée à P17. On observe une augmentation dose-dépendante de la régénération vasculaire. Intégrité B) vasculaire peut être évaluée par perfusion avec un faible poids moléculaire Dextran fluorescent. Si vaisseaux montrent la fonction de barrière altérée, la Dextran fluorescent aura une fuite hors de la cuve (flèches). (Ce chiffre a été modifié depuis Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

Figure 4
Figure 4. Exemple d'extinction génique wie-lentiviral délivré shRNA pour la régénération des vaisseaux rétiniens. Lv.shIRE1α Pour évaluer la capacité de l'inactivation de gène de IRE1α dans des neurones ganglionnaires de la rétine à l'aide régénération vasculaire, une injection intra-vitréenne d'un lentivirus codant pour une shIRE1α a été injectée à P3 à laisser suffisamment de temps pour l'inactivation de gène lorsque la croissance vasculaire et vaso-oblitération est évaluée. Le lentivirus 3 ème génération utilisé dans cet exemple contient une glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire modifié (VSV-G), conçus pour cibler les membranes plasmiques. Bien que ces vecteurs d'infecter efficacement des cellules ganglionnaires de la rétine, l'expression peut également être noté dans d'autres types de cellules locales. (A) Ce traitement n'a pas entraîné de variations notables dans induite par l'oxygène vaso-oblitération déterminée à P12, signifiant que tous les avantages observés sur vaso-oblitération mesurées à des moments ultérieurs sont dus à l'augmentation de la régénération vasculaire. (B) Inhibition de la IRE1α in ce paradigme considérablement améliorée régénération vasculaire dans la phase de repousse de ROC au P17. (Ce chiffre a été modifié depuis Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) L'évaluation d'un point de vaso-oblitération tels que P14 troisième fois, est nécessaire pour déterminer le taux précis de revascularisation. (Ce chiffre a été modifié depuis Joyal et al. Sang 2011 24) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Quel est le moyen le plus efficace pour stimuler la croissance de nouveaux vaisseaux sains dans les tissus nerveux ischémique? Est-il thérapeutique valable pour intervenir et accélérer naturels repousse vasculaire? Dans les pathologies neuro-ischémiques telles que les rétinopathies ischémiques ou accident vasculaire cérébral, la dégénérescence vasculaire est associée à la fonction neuronale réduite 35-38. Par conséquent, pour contrer blessure précoce, rétablir la micro-circulation régionale durant le segment immédiate / précoce de la maladie peut s'avérer bénéfique. Dans un contexte oculaire, paradigmes expérimentaux qui accélèrent la revascularisation de la rétine ischémique réduire la néovascularisation pathologique 21-25, 34 et donc cette approche mérite de complément d'enquête.

Depuis son introduction il ya 20 ans, le 27 du modèle de ROC a révolutionné la recherche sur l'angiogenèse rétinienne 30. Ici, nous fournissons une application supplémentaire pour ce modèle pour étudier stratégie prospectivegies pour moduler la régénération physiologique vasculaire dans la rétine ischémique. Un modèle animal idéal devrait englober plusieurs critères tels que la proximité de la physiopathologie humaine, une reproductibilité élevée, rapidité d'exécution et, idéalement, à faible coût. Le modèle de souris de OIR répond à tous ces critères et peut-être réalisée en moins de 3 semaines.

Malgré les nombreux avantages énumérés, inconvénients comprennent la nécessité actuelle de sacrifier la souris avant les analyses et le suivi longitudinal donc exacts d'un animal n'est pas encore possible avec des outils d'imagerie actuels. Actuellement, in vivo des techniques d'imagerie dans tels que PTOM ou angiographie à la fluorescéine sont largement échoué en raison de la limitation optique inhérente de l'œil de la souris (de rayon de courbure et de petite taille) qui réduit la couverture d'imagerie 39 dans les régions les plus centrales de la rétine qui ne sont pas pertinents pour les premiers stades du modèle.

Lorsqu'il est utilisé pour étudier la régénération vasculaire pPROPOSEES dans ce document de protocole, de toutes les considérations qui s'appliquent à l'étude de la néovascularisation doivent également être surveillées. Il s'agit notamment de l'enregistrement poids de l'animal pour évaluer la santé métabolique du chiot, qui influence fortement l'angiogenèse 32. Un contrôle précis de la pression d'oxygène dans la chambre hyperoxique est également critique. Variation de la concentration d'oxygène a un impact direct sur vasoobliteration, qui peut inévitablement conduire à une mauvaise interprétation des données critiques. Il est donc recommandé de mettre en œuvre, soit la surveillance électronique continue de la concentration chambre à oxygène ou à tout le moins, suivre l'évolution quotidienne des niveaux d'oxygène et de limiter oxycycler ouverture de la porte pour maintenir les niveaux d'oxygène constants. Traitement optimal de la rétine prend également pratique. Extraction, le montage et la coloration de la rétine doit être exécuté avec soin car la rétine relativement fragile doit être manipulé délicatement. En outre, comme pour toute expérimentation avec des animaux génétiquement modifiés, la dérive génétique d'une colonie cun résultat confondre. En l'absence d'une force sélective (dans une colonie de souris par exemple), la allélique ou la dérive génétique est un processus aléatoire qui peut conduire à d'importants changements dans la population au cours d'une courte période de temps. Les fréquences alléliques peuvent varier d'une génération à l'autre et entraîner la formation d'un sous-colonie 40, 41. Ces mutations sont en grande partie non détectable, et il est donc important de limiter le nombre de générations produites par les mêmes paires de reproduction dans la même colonie. Le moyen le plus efficace pour atteindre la stabilité génétique la plus élevée est de rafraîchir les «stocks» tous les cinq générations ou procéder à rétrocroisement avec une souris acheté de fond identique.

Il est également recommandé de tester des mutations de la dégénérescence de la rétine (e) 1 et 8 42, au moins une fois avant de commencer une nouvelle ligne afin d'éviter de confondre les phénotypes qui peuvent être attribués à la dégénérescence des photorécepteurs prématurée. Pour les animaux transgéniques,il est essentiel de s'assurer que la fois le contrôle et des souris mutantes sont obtenus à partir du même fournisseur et ne sont pas nécessairement sur le même fond génétique.

Comme nous continuons à élucider les mécanismes moléculaires de la formation de vaisseaux sanguins et de la croissance, de nouvelles approches pour accélérer, lente ou piloter des vaisseaux sanguins naissants se posent. Un système modèle dans lequel la modulation de la vascularisation peut être exploré in vivo dans un contexte pathologique peut fournir un outil précieux pour étudier les paradigmes thérapeutiques potentiels pour contrer l'ischémie neuronale dans le SNC. Adapter le modèle de ROC de souris pour étudier la régénération vasculaire fournit un tel lieu et continuera d'être un outil précieux pour améliorer notre compréhension de la base moléculaire de l'angiogenèse physiologique et pathologique.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

PS titulaire d'une chaire de recherche du Canada en biologie cellulaire de la rétine et de la bourse de nouveau chercheur Institut de recherche Alcon. Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada (221 478), l'Association canadienne du diabète (OG-3-11-3329-PS), les sciences naturelles et en génie du Canada (418 637) et La Fondation lutte contre la cécité Canada. Appui a été fourni par le Réseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Évaluation de la régénération vasculaire dans le SNC Utilisation de la rétine de souris
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Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

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