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Neuroscience

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

doi: 10.3791/51351 Published: June 23, 2014

Summary

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do SNC.

Abstract

A retina roedor é, talvez, o sistema de mamífero mais acessível que a investigar interacção neurovascular dentro do sistema nervoso central (SNC). É cada vez mais reconhecido que várias doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica apresentam elementos de comprometimento vascular. Além disso, as causas mais importantes de cegueira em populações pediátricas e de trabalho idade (retinopatia da prematuridade ea retinopatia diabética, respectivamente) são caracterizadas por degeneração vascular e insuficiência de rebrota vascular fisiológico. O objetivo deste documento técnico é fornecer um protocolo detalhado para estudar a regeneração vascular CNS na retina. O método pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares que conduzem à falha de crescimento vascular após lesão isquémica. Além disso, possíveis modalidades terapêuticas para acelerar e restaurar plexos vasculares saudáveis ​​podem ser exploradas. Achados obtained utilizando a abordagem descrita pode fornecer meios terapêuticos para retinopatias isquêmicas, tais como diabetes ou que de prematuridade e possivelmente beneficiar outros distúrbios vasculares do SNC.

Introduction

Ao longo do desenvolvimento do SNC, nervos, células do sistema imunológico e vasos sanguíneos estabelecer redes notavelmente acoplados para garantir adequada perfusão tecidual e permitir a transmissão de informações sensoriais 1-5. O colapso dos sistemas vascular resulta na oxigenação dos tecidos ea oferta insuficiente metabólica comprometida e é cada vez mais reconhecida como um importante contribuinte para a patogênese de doenças neurodegenerativas 6. Abandono vascular e a deterioração da unidade neurovascular dentro do cérebro, por exemplo, está associado com a demência vascular, lesões vasculares da matéria branca do cérebro 7 e doença de Alzheimer com estenose de arteríolas e vasos de pequeno calibre 8. Além disso, a função de barreira vascular prejudicada é pensado para contribuir esclerose múltipla 9 e esclerose lateral amiotrófica 10.

De relevância direta para o modelo de retina descrito neste protocolo, cegandodoenças tais como a retinopatia diabética 11 e retinopatia da prematuridade 12, 13 são caracterizados por uma fase de degeneração vascular precoce. O estresse isquêmico que se seguiu na retina neurovascular desencadeia uma segunda fase de neovascularização excessiva e patológica que provavelmente se origina como uma resposta compensatória ao oxigênio restabelecer o fornecimento de energia e 14-16. Uma estratégia atractiva para superar o stress isquémico que é central para a progressão da doença é o de restaurar redes vasculares funcionais especificamente nas zonas isquêmicas do sistema neuro-retina (Figuras 2 e 3). Provocar uma resposta angiogênico controlado pode vir transversalmente como um contra-senso para uma condição em que os tratamentos anti-angiogênicos, tais como anti-VEGF são considerados tratamentos adaptados. No entanto, a evidência para a validade desta abordagem é montagem. Por exemplo, aumentando a rebrota vascular "fisiológico-like" em ischemretinopatias ic foi elegantemente demonstrado através da introdução de células precursoras endoteliais 17, a inibição da Müller VEGF expresso de células na supressão induzida de outros fatores angiogênicos 18, injeção de células progenitoras mielóides 19, a inibição da NADPH oxidase a apoptose induzida por 20, aumentando dietético ω-3 fatty poliinsaturados ingestão de ácido 21, o tratamento com um fragmento do terminal carboxilo do triptofano tRNA 22, e a administração directa de VEGF ou FGF-2, para a protecção de células gliais 23. Além disso, foi demonstrado que o modulando pistas de orientação neuronais clássicos, tais como netrinas Semaforinas ou em retinopatias isquêmicas acelera a regeneração vascular de vasos saudáveis ​​dentro da retina e, consequentemente, reduz a angiogénese patológica 24, 25. De relevância clínica direta, vários dos estudos realizados em animais acima mencionados fornecem evidências de que a promoção re vasculargeração durante a fase isquêmica precoce de retinopatias pode reduzir significativamente risco de vista pré-retinal neovascularização 19, 23, 24, 26, provavelmente através da redução da carga isquêmica.

Elaboração de estratégias terapêuticas que estimulam a regeneração dos vasos funcionais continua a ser um desafio significativo para os biólogos vasculares. Aqui nós descrevemos um sistema experimental que utiliza o modelo do rato de retinopatia induzida por oxigênio (OIR), para explorar estratégias para modular a rebrota vascular dentro da retina. Desenvolvido por Smith et al., Em 1994, 27, este modelo serve como um proxy para retinopatias proliferativas humanos e consiste em expor filhotes P7 rato para 75% O 2 até P12 e, posteriormente, re-introduzir os filhotes para a sala ambiente O 2-tensão (Figura 1). Este paradigma vagamente imita um cenário onde um bebê prematuro é ventiladocom o O 2. A exposição de filhotes de rato à hiperóxia provoca degeneração dos capilares da retina e microcirculação, e produz uma área reprodutível de vaso-obliteração (VO) normalmente avaliada em saída de O 2 no P12, embora a área VO máxima é atingida aos 48 hr (P9) após exposição ao O 2 28. No ratinho, as zonas avasculares VO regenerar-se espontaneamente ao longo da semana seguinte re-introdução de ar ambiente e, eventualmente, as zonas de VO são completamente re-vascularização (figura 2). Re-introdução de ar ambiente, de ratinhos submetidos a OIR também provoca neovascularização pré-retinal (NV) (máximo a P17), que é tipicamente avaliada para determinar a eficácia de paradigmas de tratamento anti-angiogénicos. Na sua forma mais pura, o modelo OIR fornece uma ferramenta altamente reprodutível e quantificável para avaliar a degeneração vascular induzida por oxigénio e determinar a extensão da neovascularização destrutiva pré-retiniana 29-31.

30, 31. Aqui nós fornecemos um procedimento simples passo-a-passo para investigar a modulação da revascularização fisiológica dentro da retina neural por compostos farmacológicos, terapêuticos potenciais, vetores virais ou para estudar a influência dos genes candidatos em camundongos transgênicos ou nocaute.

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Protocol

Declaração de Ética: Todos experimentação animal adere as diretrizes de cuidados de animais estabelecidas pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research e pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal.

1. Oxigênio Induzida Retinopatia (OIR)

  1. Registar a data de nascimento de filhotes de rato como P0.
  2. Registre todos os pesos dos animais aquando da entrada em O 2 para garantir uma faixa de peso adequado. Nota: Para C57BL / 6 ratos em P17, o peso corporal deve variar entre 5 e 7,5 g de NV máxima 32. A fim de manter a consistência do ambiente, é recomendado o uso da mesma ninhada de controlo (para ratinhos geneticamente modificados, bem como ratinhos que receberam tratamentos experimentais). Ao avaliar os efeitos de um vetor viral, deve-se considerar o tropismo do vírus e dar tempo suficiente para a plena expressão de transgenes por vírus entregues. Rapidamente expressar viralOs vectores, tais como os lentivírus 3 ª geração 24, 25, 33 são recomendados.
  3. Filhotes lugar do mouse no P7 (C57BL / 6 ou desejado tensão) e um CD1 fomentar mãe em uma câmara de oxigênio fixado em 75% O 2 por 5 dias 27. Umidade e temperatura ambiental foram mantidas constantes durante toda a exposição O 2. Nota: As instalações de investigação equipados com uma fonte central de O 2 são ideais e limitar a substituição pesado de O vazio 2 tanques. Se estiver trabalhando com camundongos transgênicos ou nocaute, é importante para garantir que o controle e os ratos experimental são adquiridos do mesmo fornecedor para limitar desvios genéticos dentro das mesmas cepas 30, 29.
  4. Em P12, remover ratinhos a partir da câmara de oxigénio e retornar os animais ao ambiente de O 2.

2. Injeção intravítrea para entrega de Compostos para o Inner Retina (When avaliar os efeitos de um composto farmacológico ou proteína recombinante)

  1. No P14, anestesiar ratos com 2% de isoflurano em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça.
  2. Posicione o mouse sobre o ventre.
  3. Usando uma seringa esterilizada de 10 mL equipado com uma agulha de vidro puxado chanfrada, realizar uma injecção de um volume máximo de 1 ml de solução contendo o composto a ser investigada ou veículo (solução salina fisiológica) no limbo posterior do olho, com um 45 ° ângulo de evitar a lente. Nota: A-agulha de vidro puxado está ligado à seringa utilizando uma gota de epoxi-resina.
  4. Aplique uma gota de pomada oftálmica lubrificante (de preferência com antibiótico) com um cotonete para o olho do mouse.
  5. Retorne o mouse de volta para a jaula com a promoção mãe. Ratos são, então, cuidadosamente monitorizados até recoberto e totalmente ambulatorial.

3. Avaliação da perfusão navio e função de barreira (Integridade) por Angiofluoresceinografia

  1. Anestesiar ratos com isoflurano a 2% em oxigênio 2 L / min (ou proteção animal aprovado pelo comitê de anestésico de escolha). A fim de verificar a eficácia da anestesia, sequencialmente beliscar a cauda, ​​pé de trás e da orelha com uma pinça. Nota: Esta é normalmente realizada no P17 quando a regeneração é avaliada. Também levar a cabo a análise em P19 e P21 para determinar se a integridade vascular é preservada ao longo do tempo.
  2. Uma vez anestesiados, pesar o mouse.
  3. Faça uma incisão na linha média do abdome com uma tesoura de dissecação. Nota: Os instrumentos de dissecação devem ser regularmente verificados e afiada.
  4. Cortar costelas lateralmente e levantar a caixa torácica com o auxílio de uma pinça. Nota: É necessário cortar lateralmente como possível, para evitar danos no coração.
  5. Após a remoção peripHeral tecido do coração, prender a aorta descendente com pinça hemostática.
  6. Lentamente injetar fluoresceína-dextrano para o ventrículo esquerdo usando uma agulha G 25. Nota: Se a função de barreira vascular é investigado, 70 kDa fluoresceína-dextrano é empregado como ele vai vazar para fora dos vasos quando a integridade dos vasos é comprometida. Se o investigador quer fundido vasos sanguíneos, 2 MDa fluoresceína-dextrano é usado. As etapas críticas: 1) Para garantir uma repartição homogênea, centrífuga fluoresceína-dextrano e injetar o sobrenadante, 2) a fim de evitar a constrição dos vasos, injetar solução de fluoresceína-dextrano aquecido, 3) O seu tempo de circulação não deve excesso de 4 min.
  7. Decapitar ratos 2 min após a injeção com uma tesoura de operação.

4. Enucleação e Eye Fixation

Nota: Ao avaliar as taxas de regeneração vascular, primeiro coletar retinas no P12 e, adicionalmente, no P14 e P17. Aumentar o número de ponto de tempo amostrados para determinação mais precisa das taxas de revascularização 24.

  1. Incline a cabeça do rato e colocá-lo de lado.
  2. Retire a pele e as pálpebras cobrem os olhos com uma tesoura de dissecação.
  3. Coloque uma pinça curva abaixo do olho e puxe-o até que o nervo óptico é cortada.
  4. Vire a cabeça do rato para seu outro lado e realizar os mesmos passos (passos 4.2 e 4.3).
  5. Para garantir uma melhor penetração do fixador, perfurar um buraco na câmara anterior do olho usando 30 G agulha.
  6. Transferir os olhos para um tubo contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e fixar durante 1 hora à temperatura ambiente.
  7. Remover e lavar os olhos PFA 4 vezes com uma solução de PBS gelado.

5. Dissecção da retina

  1. Coloque rato olhos em uma placa de Petri contendo PBS frio e realizar dissecção das retinas sob microscópio estereoscópico.
  2. Retire a gordura / tecido extra em torno do olho com micro-dissecção scissors.
  3. Corte a córnea com uma tesoura micro-dissecção.
  4. O uso de dois pares de pinças, minuciosamente descascar a esclera distância a partir da periferia em direcção ao nervo óptico e descartar.
  5. Aperte a lente (bola esbranquiçada abaixo da córnea) com uma pinça e extraí-lo do copo olho. Utilizar um par de pinças, como um apoio, e a outra para agarrar e levantar cuidadosamente e remover a lente.
  6. Separar os vasos hialóide da face interna da retina utilizando escovas pequenas (tamanho 0) e uma pinça.
  7. Retirar feixes de vasos hialóide ligados ao disco óptico usando uma pinça.
  8. Transferência dissecados retinas de dois tubos ml de microcentrífuga contendo PBS e colocar em gelo antes de se iniciar o processo de coloração.

6. Retinal Vascular Coloração

  1. Incubar as retinas dissecados durante a noite com agitação suave a 4 ° C em uma solução de fluorescência acoplado a isolectina B4 (rodamina-lectina ou outra) em PBS contendo 1 mM de CaCl2
  2. No dia seguinte, remover a solução de corante e lavar retinas 3x em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.

7. Preparação de retina Flatmounts

  1. Retinas, do lado fotorreceptor para baixo de transferência, sobre uma lâmina de microscópio e fazer quatro incisões radiais equidistantes profundas utilizando um bisturi cirúrgico para dividir a retina em quatro quadrantes de igual tamanho. Durante as incisões, a cinta da retina, com uma escova, de modo que ele não se mova.
  2. Usando duas escovas embebidas em PBS, alise cuidadosamente a quadrantes fotorreceptor side-down e mergulhe a retina em meio de montagem para evitar a foto-branqueamento. Em seguida, coloque cuidadosamente uma lamela sobre a superfície da retina montado sem a aplicação de pressão e garantir que as bolhas de ar não se acumulam sob a lamínula. </ Li>

8. Imagem e Quantificação de Vasoobliteration (VO) e neovascularização (NV), como descrito anteriormente 31

  1. Tire fotos de retinas inteiras montado com um microscópio de epi-fluorescência com uma ampliação de 10x.
  2. Abra a imagem da retina em software de edição de fotos, unir e medir a área total da retina, ea área avascular. Área pode ser expressa em pixels.
  3. Determinar a extensão de VO, dividindo o número de pixels na área avascular pelo número de pixels na área total da retina.
  4. Determinar a extensão da NV-se dividindo o número de pixels de NV pelo número de pixels na área total da retina, tal como descrito 31.

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Representative Results

O modelo OIR é amplamente utilizada para estudar a degeneração vascular induzida por oxigênio e neovascularização patológica induzida por isquemia na retina e tem sido fundamental para o desenvolvimento de tratamentos atualmente empregados anti-angiogênicos para doenças oculares 27, 29, 30. Os resultados obtidos com este modelo pode ser vagamente extrapolados para retinopatias isquêmicas, como a retinopatia diabética proliferativa e retinopatia da prematuridade 30.

Aqui apresentamos uma alternativa de uso deste modelo para estudar a regeneração vascular. Vamos descrever um exemplo de uma estratégia para regenerar a retina isquêmica, que foi recentemente publicado pelo nosso laboratório. No estudo apresentado, demonstramos que a isquemia neuronal sustentado ativa retículo endoplasmático (ER) estresse e através de um dos seus Endorribonucleases efetoras IRE1α, cliva o mRNA do clássico neuronal sugestão orientação netrin-1. Nós mostramosque a entrega intra-ocular do Netrin-1, estimula um programa de angiogénese reparadora em células mielóides da retina e, assim, acelera a revascularização do tecido neural após OIR 25. Além disso, oferecemos um exemplo de regeneração vascular acelerado usando lentiviral mediada silenciamento de IRE1α.

Os paradigmas experimentais descritos pode ser modificado para investigar o tratamento exploratório de escolha. Importante, a ponto de tempo de injecção intravítrea é determinada em função da natureza do composto e explorado deve tomar em consideração o mecanismo pelo qual o tratamento investigados actua. Por exemplo, para estudar um composto farmacológico (agonista do receptor, antagonista, etc), P14 pode ser selecionado como corresponde a um ponto no tempo em que a revascularização da retina está acelerando ainda uma intervenção de ação rápida pode ajudar a acelerar a taxa de revascularização (Figuras 2 e 3-A). Quando os vectores virais sãoempregue, tempo suficiente deve ser colocado para permitir a expressão máxima do gene passageiro e um ponto temporal anterior pode ser seleccionada para garantir a total expressão do transgene, ou silenciamento completa do gene alvo (Figura 4). Lentivirais baseados são particularmente adequados a este respeito, devido à sua expressão rápida, baixa resposta inflamatória e facilidade de produção 24, 25. É também fundamental para assegurar que o gene alvo é entregue para a população de células da retina apropriado (RGC, célula endotelial, célula Müller, etc), portanto, o tropismo do vector viral seleccionado deve ser considerado. Alternativamente, a estudar o papel de um gene na regeneração vascular utilizando animais transgénicos ou knockout oferece a vantagem de não necessitar de realizar injecções intra-oculares.

Figura 1 Figura 1. Representação esquemática do modelo OIR mouse. Filhotes rato e lactantes estão expostos a 75% O 2 de P7 a P12. A câmara de oxigênio ventilado com constante O 2 entrega e oxímetro é necessária. Durante este período inicial, ocorre retina vaso-obliteração. Em P12, os ratos são devolvidos ao ar ambiente (21% de O 2) até P17 quando ocorre máxima tufos pré-patológica da retina. A neovascularização retrocede ao longo dos dias seguintes. O período ideal para investigar a regeneração vascular é a janela entre P12 e P17. Amostragem e avaliação de vários pontos de tempo para extensão do vaso-obliteração é a chave para elucidar as taxas precisas de revascularização.

Figura 2
Figura 2. Claro Tempo de revascularização retina seguinte vaso-oblite induzida por oxigênioração. A) representação gráfica de um procedimento flatmounting da retina. Uma incisão é feita pela parte superior da córnea (cúpula em preto-cinza) e esclera (linhas vermelhas pontilhadas) ea retina é provocado fora. A lente pode ser extraídos após a abertura da córnea / esclerótica ou uma vez a esclerótica é removido, como mostrado no diagrama. Vasos hialóide são então removidas e coloração dos vasos da retina realizados. Uma vez que o protocolo de coloração está terminado, a retina é então cortada em quatro secções igualmente espaçadas e montado sobre uma lâmina de microscópio vaso do lado do plano. B) retinas flatmount Lectina-corados de ratinhos submetidos a OIR. Como vasos regenerar, a área de vaso-obliteração (aqui máxima no P12) enche dentro neovascularização patológica é máxima em P17 e surge como manchas saturadas em lectina coradas retinas Oir. Ao P19-P21, retinas já totalmente regenerado suas redes vasculares. (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

<p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "always"> Figura 3
. Figura 3 Exemplo de um tratamento injectável que acelera a regeneração vascular da retina: Netrin-1. A) Netrin-1 é injectada a P14 ea extensão de recrescimento vasculares avaliados no P17. Observa-se um aumento dependente da dose na regeneração vascular. Integridade B) vascular pode ser avaliado através de perfusão com um baixo peso molecular fluorescentes dextrano. Se vasos mostrar a função de barreira comprometida, o dextrano fluorescente irá vazar no exterior do recipiente (setas). (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 25)

Figura 4
Figura 4. Exemplo de silenciamento de genes wiª lentiviral entregue shRNAs para a regeneração vascular da retina:. Lv.shIRE1α Para avaliar a capacidade de silenciamento gênico de IRE1α nos neurônios ganglionares da retina para ajudar a regeneração vascular, uma injeção intravítrea de uma codificação para um lentivírus shIRE1α foi injetado no P3 para que haja tempo suficiente para o silenciamento do gene, quando o crescimento vascular e vaso-obliteração é avaliada. O lentivírus 3 ª geração empregue neste exemplo contem uma glicoproteína do vírus da estomatite vesicular modificado (VSV-G), concebidos para visar as membranas plasmáticas. Embora estes vectores eficazmente infectar as células ganglionares da retina, a expressão também pode ser observado em outros tipos celulares locais. (A) Este tratamento não conduziu a variações notáveis ​​no induzida por oxigénio vaso-obliteração, determinada a P12, o que significa que todos os benefícios observados no vaso-obliteração medidos em pontos de tempo posteriores são devidas a um aumento da regeneração vascular. (B) Inibição da IRE1α in este paradigma melhorado dramaticamente a regeneração vascular na fase de rebrota da OIR em P17. (Esta figura foi modificada de Binet et al. Cell Metabolism 2013 25) (C) Avaliar um ponto terceira vez de vaso-obliteração, como P14, é necessário para determinar as taxas precisas de revascularização. (Esta figura foi modificada de Joyal et al. Sangue 2011 24) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Qual é a maneira mais eficaz de estimular o crescimento de novos vasos saudáveis ​​no tecido nervoso isquêmico? É terapeuticamente válida para interferir e acelerar ocorrem naturalmente rebrota vascular? Em patologias neuro-isquêmica, como retinopatias isquêmicas ou acidente vascular cerebral, degeneração vascular está associado à redução da função neuronal 35-38. Daí para combater lesão precoce, restabelecendo micro-circulação regional durante o segmento de imediato / precoce da doença pode ser benéfico. Em um contexto ocular, paradigmas experimentais que aceleram a revascularização da retina isquêmica reduzir a neovascularização patológica 21-25, 34 e, portanto, esta abordagem merece uma investigação mais aprofundada.

Desde a sua introdução, há 20 anos, a 27 de modelo OIR revolucionou pesquisa da angiogênese da retina 30. Aqui nós fornecemos uma aplicação adicional para este modelo para estudar strat prospectivogias para modular a regeneração fisiológica vascular na retina isquémica. Um modelo animal ideal deve englobar vários critérios, tais como a proximidade de fisiopatologia humana, alta reprodutibilidade, execução rápida e de preferência, de baixo custo. O modelo do rato da OIR atende a todos esses critérios e pode ser carregado-out em menos de 3 semanas.

Apesar dos inúmeros benefícios listados, desvantagens incluem a necessidade atual de sacrificar o mouse antes de análises e acompanhamento longitudinal, portanto, precisa de um animal ainda não é possível com ferramentas de imagem atuais. Atualmente, nas técnicas de imagem, como vivo outubro ou angiofluoresceinografia são em grande parte mal sucedido devido à limitação inerente óptico do olho do rato (raio de curvatura e tamanho pequeno), que reduz a cobertura de imagem 39 para as regiões mais centrais da retina que não são relevantes para as primeiras fases do modelo.

Quando empregada para estudar a regeneração vascular como pROPOSTA neste trabalho de protocolo, todas as considerações que se aplicam ao estudo neovascularização também devem ser monitorados. Estes incluem a gravação de peso do animal para estimar a saúde metabólica do filhote, que influencia fortemente a angiogênese 32. O controle preciso da tensão de oxigênio na câmara hiperóxico também é crítica. Variação da concentração de oxigênio tem um impacto direto sobre vasoobliteration, que pode inevitavelmente levar a erros de interpretação de dados críticos. Portanto, é recomendável que quer implementar o monitoramento eletrônico contínuo da concentração de oxigênio câmara ou, no mínimo, monitorar as mudanças diárias nos níveis de oxigênio e limitar oxycycler abertura da porta para manter os níveis de oxigênio constantes. Processamento otimizado de retinas também requer prática. Extração, montagem e coloração da retina deve ser executado com cuidado, pois a relativamente frágil retina deve ser delicadamente tratado. Além disso, como para toda a experimentação com animais geneticamente modificados, a deriva genética de uma colónia cum resultados confundir. Na ausência de uma força selectiva (de uma colónia rato, por exemplo), a alélica ou deriva genética é um processo aleatório que podem levar a grandes alterações na população ao longo de um curto período de tempo. As frequências alélicas podem mudar de geração para geração, resultando na formação de um sub-colónia 40, 41. Estas mutações são amplamente indetectável e é, portanto, importante para limitar o número de gerações produzidas pelos mesmos pares de matrizes da mesma colónia. A maneira mais eficiente de atingir a maior estabilidade genética é atualizar "stocks" a cada cinco gerações ou prosseguir para retrocruzamento com um mouse comprado de fundo idênticas.

Também é recomendado para testar mutações degeneração da retina (rd) 1 e 8 de 42, pelo menos uma vez antes de iniciar uma nova linha, a fim de evitar confundir fenótipos que podem ser atribuídos a prematura degeneração de fotorreceptores. Para os animais transgênicos,é vital para garantir que tanto o controle e ratos mutantes são obtidos a partir do mesmo fornecedor e estão necessariamente no mesmo fundo genético.

À medida que continuamos a elucidar os mecanismos moleculares da formação de vasos sanguíneos e de crescimento, novas abordagens para acelerar, lento, ou orientar os vasos sanguíneos nascentes estão surgindo. Um sistema de modelo em que a modulação da vascularização pode ser explorada in vivo em um contexto patológico pode proporcionar uma ferramenta valiosa para explorar paradigmas terapêuticos potenciais para contrariar isquemia neuronal no SNC. Adaptar o modelo OIR rato para estudar a regeneração vascular fornece tal local e continuará a ser uma ferramenta valiosa para promover nossa compreensão da base molecular para a angiogênese fisiológica e patológica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

PS tem um Canada Research Chair em Biologia Celular da retina e do Instituto de Pesquisa Alcon New Investigator Award. Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (221.478), a Canadian Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), Ciências Naturais e do Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia (418637) e A Fundação Fighting Blindness Canadá. O suporte também foi fornecido pelo Réseau de Recherche en Santé de la Visão du Québec.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers Vendor of choice
Operating Scissors straight World Precision Instruments 14192
Dissecting Scissors straight World Precision Instruments 14393
Vannas Eye Scissors Harvard Apparatus 72-8483
Iris Forceps, curved, serrated World Precision Instruments 15915
Brushes 362R size 0 Dynasty
Dumont Forceps #3; straight World Precision Instruments 500338
Surgical Blade, size 10 Bard-Parker 371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Laboratories, Inc RL-1102
Microscope slides VWR 16004-368
Fluoromount G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 Sigma-Aldrich 46945

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina
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Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).More

Miloudi, K., Dejda, A., Binet, F., Lapalme, E., Cerani, A., Sapieha, P. Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (88), e51351, doi:10.3791/51351 (2014).

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