Summary
نحن تصف سلسلة من الطرق لحقن الأصباغ وناقلات الحمض النووي، والفيروسات، والخلايا من أجل رصد كل من مصير الخلية والنمط الظاهري من الخلايا الذاتية والمطعمة المشتقة من الخلايا الجنينية أو المحفزة داخل أجنة الفئران في اليوم الجنينية (E) 9.5 و مراحل لاحقة التنمية.
Abstract
اختبار مصير الجنينية أو الجذعية المحفزة الخلايا في المختبر المشتقات في بروتوكولات أدى إلى نتائج مثيرة للجدل والتي لا تعكس بالضرورة في الجسم الحي المحتملة. ويفضل، ينبغي أن توضع هذه الخلايا الجنينية في بيئة سليمة من أجل الحصول على النمط الظاهري محددة. وعلاوة على ذلك، ظلت نسب خلية تتبع الدراسات في الماوس بعد وضع العلامات الخلايا مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات محدودة معظمها إلى أوائل أجنة الفئران المرحلة مع أجهزة تزال ضعيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتصميم بروتوكولات القياسية وحقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية لحقن عوامل مختلفة في المناطق المستهدفة من القلب في أجنة فئران في مراحل لاحقة E9.5 والتنمية. يزدرع الجنينية أو الأجنة ثم مثقف أو اليسار لمزيد من التطور في الرحم. وتشمل هذه العوامل الأصباغ الفلورية، فيروس، shRNAs، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الاصلية. نهجنا يسمح الحفاظ على فوnction للجهاز في حين رصد الهجرة ومصير الخلايا المسمى و / أو حقن. هذه التقنيات يمكن أن تمتد إلى الأجهزة الأخرى، وسوف تكون مفيدة جدا لمعالجة المسائل الرئيسية في علم الأحياء البيولوجية للتنمية.
Introduction
منذ أكثر من عقد من الزمان، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HuESCs) قد استمدت من مثانات بلاستولية الإنسان 1. منذ ذلك الحين، أصبحت هذه الخلايا موضوع حقل مهم من الأبحاث التي تتناول المسائل التي لم تتم تلبيتها في البيولوجيا التطورية الإنسان. وقد وفرت HuESCs علاوة على ذلك الآمال في الطب التجديدي. في السنوات الأخيرة، تم إنشاؤها الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية المريض محددة، وتوفير نماذج من مرض وراثي 2. العديد من البروتوكولات في المختبر لتمايز الخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة نحو مختلف الأنساب الخلية، بما في ذلك القلب الأنساب 3، تم الإبلاغ عنها. وغالبا ما phenotyped خلايا متمايزة عن طريق تحليل الحمض النووي الريبي والبروتينات التعبير، المناعية، و / أو في اختبارات الوظائف المختبر. ومع ذلك، المحفزة مشتقات الخلايا الجذعية يجب أن توضع في بيئة الجنينية المناسبة من أجل اختبار ما إذا يكتسبون تماما سلل مصير نظيرتها الجنينية وما إذا كانت ألخص في الجسم الحي وظيفة حقيقية في استجابة لمنبهات الإقليمية. بينما هندسة الأنسجة واعدة، فإنه لا يوفر بعد كل الاشارات المعروفة وغير المعروفة من السليم في الجسم الحي الأنسجة الجنينية النامية 4،5.
وسم الخلية مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات في الأجنة، بما في ذلك أجنة الفئران، جلبت معلومات هامة فيما يتعلق بمنشأ الجنينية الأنساب الخلية أثناء التطور القلب 6. على سبيل المثال، صبغ الحقن في الفضاء التامور من أجنة الفئران فيفو السابقين، تليها الثقافة في المختبر من قلوب معزولة، وكان يستخدم لتسمية الخلايا النخابية وذريتهم 7. ومع ذلك، صبغ ووسم الخلية فيروسات طبقت معظمها لأجنة الفئران في وقت مبكر مع أجهزة تزال ضعيفة، أو أجنة الدجاج، والتي هي أكثر يمكن الوصول إليها بسهولة 8. استثناء هو الدماغ، وهو أسهل لاستهداف في البريدmbryos 9،10. لم يتم حتى الآن تطبيق هذا النهج لضرب قلب الجنينية الماوس.
لاستكمال وضع العلامات مباشرة مع الأصباغ أو الفيروس وإجراء النسب التتبع في أكثر تقدما أجنة الفئران والجرذان مرحلة الكبار، وقد تم الجمع بين نهج وضع العلامات الخلية مع تحليل الفئران المعدلة وراثيا باستخدام التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن. إلا أن نهج لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن 11 ملامح بعض القيود بسبب خصوصية الزمانية المكانية للمناطق التنظيمية الجيني يستخدم لدفع التعبير عن recombinase، وكفاءة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية / لوكس 12. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لا يعالج تماما الأسئلة محددة من الخلايا اقتناء يحركها هجرة مصير الخلية كما يمكن تسمية فقط السلائف بعد تفعيل المنطقة التنظيمية المستخدمة لدفع لجنة المساواة العرقية التعبير. فإنه أيضا لا يمكن أن تنطبق على الأجنة البشرية من أجل قضايا أخلاقية واضحة.
ونظرا لهذه القيود، قمنا بتصميم سلسلة من ع جديدةrotocols لحقن مجموعة متنوعة من وكلاء وسم الخلية مثل الأصباغ الفلورية، فيروس، جهري التعبير الجيني مثل shRNAs وناقلات توسيم الخلايا المعتمدة على الحمض النووي، أو الخلايا في الجنين الماوس في E9.5 ومراحل لاحقة من التنمية في المناطق المستهدفة من القلب.
حقن الحمض النووي / خلية استخدام stereomicroscope وجهاز حقن مكروي بسيطة جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين الثقافة الجنين تصل إلى 48 ساعة، أو القلب معزولة أو الثقافة يزدرع الجنينية ل48-72 ساعة. نحن أيضا تقريرا بروتوكول حقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية في قلوب الماوس الجنينية في الرحم، وهذا الأسلوب يسمح رصد تطور الأجنة 13 ويسمح على المدى الطويل متابعة من injectates و / أو الخلايا المسمى.
وجدنا أن هذه المناهج الحفاظ على وظيفة الجهاز وتوفير بيئة أكثر من ممثل في المختبر اختبار إمكانات الخلايا الجذعية. كما يوفر الفرصة لمتابعة الهجرةمن وصفت و / أو حقن خلايا لرصد مصيرهم. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي أن تسفر عن فهم أفضل للتنميط الأنسجة الإقليمية والعمليات البيولوجية الرئيسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
إجراءات الحيوان
الحصول على موافقة من لجنة أخلاقية الحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية للعمل مع الفيروس، HuESC و / أو التوجيهية (عند الاقتضاء)، وكذلك التعامل مع الماوس، والحصول على أجنة الفئران، وإجراء العمليات الجراحية الماوس. لتوقيت التزاوج، وتعتبر اليوم من المكونات اليوم الجنينية (E) 0.5 / 0.5 أيام تال للجماع.
- الإبر حقن مكروي:
لالسابقين الرحم حقن مكروي، وسحب الماصات الزجاج (1.2 ملم أنابيب قطرها الخارجي البورسليكات الشعرية) باستخدام مجتذب ماصة / beveller للحصول على 1 أو 10 ميكرون قطر الحافة الداخلية وحادة ومخروطي الشكل تلميح لحقن الحمض النووي أو الخلايا، على التوالي. لحقن بوساطة الموجات فوق الصوتية، واستخدام الإبر المعقمة المخصصة، والتي يبلغ قطرها الخارجي / الداخلي (OD / ID) من 1.14 مم mm/0.53، مع تلميح 50/35 ميكرون OD / ID. - السيليكون مملوءة أطباق بتري:
إعداد السيليكون كما هو موضح في الدليل. شغلطبق بتري زجاجي نظيف 60 مم مع طبقة من المطاط الصناعي ~ 1 سم. تجنب فقاعات الهواء. - الأدوات:
إبقاء جميع الأدوات الجراحية المعقمة قبل وأثناء العملية. - إعداد الحمض النووي:
إضافة 3 ميكروغرام DNA و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب واحد. إضافة 3 ميكرولتر Lipofectamine 2000 و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب آخر. احتضان لمدة 5 دقائق على RT وتخلط كل من الحلول. استخدامها على الفور. - إعداد الخلايا:
إعداد تعليق 10 6 خلية / مل DMEM (Dulbecco والنسر متوسطة، ارتفاع نسبة الجلوكوز و 50٪ مصل الفئران). 50 ميكرولتر من تعليق خلية النهائية يكفي لمدة 8-10 الأجنة. - صبغ إعداد:
استخدام الفلورية الخضراء CDCFDA-SE بنسبة 25 ملغ / مل DMSO. إعداد 20 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية. تمييع 1:100 / 1:200 في ملحي معقم أو برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. - إعداد الفيروس:
استخدام الجيل الثالث 3-PGK التجارية، معربا عن GFP الفيروسة البطيئة مع عيار 9 ~ 10 -10 10 هيئة تنظيم الاتصالاتnsducing وحدة / مل DMEM. لإعداد الفيروسة البطيئة، انظر Tiscornia وآخرون 14 ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام بأمان والتخلص من الفيروس.
2. جمع E9.5 E10.5 الأجنة وللخارج الحي حقن
- الموت ببطء ماوس حاملا في اليوم الجنينية 9.5 أو 10.5.
- تعقيم الصدر والبطن من الفأر مع الايثانول 70٪.
- جعل شق خط الوسط بطني لفتح البطن واسترداد قرن الرحم في RT في برنامج تلفزيوني وتحويلها بعد سنتين يغسل PBS إلى طبق بتري مليئة سيليكون مع M16 المتوسط.
- دبوس قرن الرحم مع دبابيس الحشرات إلى طبقة السيليكون بحيث الجانب أوعية دموية الرحم في الجزء السفلي.
- قطع سطح الرحم مع ملقط غرامة، وقبعة من الساقط في 1 ملم تحت سطح الأرض.
- بلطف استرداد الجنين في الكيس المحي من خلال نشر خارج جدران الساقط.
- تخزين الأجنة عند 37 درجة؛ مئوية في المتوسط M16 قبل حقن الخلايا. للحقن، يتم نقل كل جنين إلى الطبق سيليكون مليئة M16 المتوسطة في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية.
3. الحمض النووي أو حقن الخلايا تحت Stereomicroscope
- ملء ماصة الزجاج من الخلف مع حقنة هاميلتون وتهز ماصة لإزالة فقاعات في الطرف.
- تعيين ماصة على حامل حقن مكروي؛ ضبط ضغط عقد إلى 50 (DNA) أو 30 (خلايا) HPA، وضغط الحقن إلى 150 (DNA) إلى 300 (خلايا) HPA. ضبط الوقت الحقن إلى 0.2 ثانية (DNA) أو 0.5 ثانية (الخلايا). قد تختلف هذه الإعدادات قليلا وفقا لنوع microinjector وماصة.
- دبوس الجنين إلى أسفل سيليكون من خلال الكيس المحي دون لمس الجنين السليم. مشاهدة منطقة القلب وفتح الكيس فقط فوق هذه المنطقة.
- إضافة 4 دبابيس حول الجنين لمنع أي حركة أثناء حقن الخلايا.
- باستخدام مياداة مجهرية (تعيين إلى دليل)، ببموقف ذ غيض ماصة في زاوية من 45 درجة فوق التأمور، وذلك فوق منطقة القلب التي سيتم حقن (الشكل 1).
- نقل ماصة في المنطقة من اهتمام ويؤدي الحقن. إخراج ماصة في أسرع وقت ممكن. تأكد من أن القلب ينبض بشكل صحيح بعد حقن الحمض النووي / خلية.
4. الأجنة، القلب معزولة، ويزدرع الثقافة
- ثقافة الأجنة E9.5 في 25٪ M2 المتوسطة و 75٪ مصل الفئران، على أن تستكمل مع البنسلين / الستربتوميسين، قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية والاوكسيجين مع 40٪ O 2.
- إضافة 2 مل مستنبت في أنبوب زجاجي 25 مل، إضافة بلطف الجنين، والأوكسجين مع 40٪ O 2 قبل الشد الغطاء على أنبوب. احتضان تصل إلى 36 ساعة عند 37 درجة مئوية في حين تناوب أو الهز (30 تناوب / دقيقة).
- في نقطة الوقت المطلوب (على سبيل المثال 24 ساعة)، تشريح قلوب بعناية مع ملقط غرامة، دون لمس قلوب، من خلال أول ديcapitating الأجنة؛ قلب من السهل أن المكوس عن طريق سحبها خارج باستخدام تدفق المسالك البعيدة.
- الثقافة قلب معزولة لساعة أخرى 36-48 في DMEM مع FCS 50٪ على إدراج Matrigel المغلفة مجموعة في 12 لوحة جيدا. انظر داير وباترسون (2013) لبروتوكول تحسين الثقافة القلب 15.
- جعل أي ازدراع المنطقة من الفائدة. كمثال على ذلك، تشريح القناة الأذين البطين (AVC) والثقافة لمدة 48 ساعة على نوع الكولاجين 1 هلام 16.
5. حقن الموجات فوق الصوتية الموجهة في القلب أنا ن الرحم
- الإعداد من جهاز الموجات فوق الصوتية وmicroinjector:
- استخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة مع محول 40 ميغاهيرتز والإعداد حقن مكروي على السكك الحديدية.
- تعيين حجم الحقن على microinjector في 69 NL في الحقن. راجع كتيب حقن مكروي الشركة المصنعة لبرمجة microinjector.
- إعداد microiالإعداد njection وحقن:
- وضع micropipette الزجاج في microinjector. لضمان كفاءة الحقن، ومعطف الأولى الجانب الداخلي من ماصة مع الزيوت المعدنية بواسطة الشفط يصل إلى أقصى حجم. ثم إخراج النفط مرة أخرى، وترك 1-2 ملم من النفط داخل إبرة.
- نضح injectate حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى لحجم. يجب الحرص على عدم لمس أي الأسطح مع طرف الإبرة لأن هذا سوف تخفف من حدة غيض وجعل حقن أكثر صعوبة.
- لتحقيق الاستقرار في قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة خلال الحقن، واستخدام طبق بتري تعديل مع وجود ثقب في منتصف (2.5 سم القطر)، عن طريق غشاء السيليكون رقيقة مع شق صغير في وسط قطع تغطيتها، ووضعه فوق موقع شق . تحقيق الاستقرار في طبق بيتري على الطاولة التعامل مع الماوس عن طريق وضع كتل من الطين 3-4 تحت حواف الطبق.
- إجراء الحقن:
- حلق البطن من ماوس الحوامل (في المرحلة الجنينية المطلوب) قبل تخديرسيا لإزالة الشعر. علاج البطن مع وكيل إزالة الشعر الكيميائية لإزالة الشعر المتبقي وتعقيم مع الايثانول 70٪.
- تخدير ماوس الحوامل مع الأكسجين / isoflurane وعبر قناع الوجه. استخدام 3-5٪ isoflurane والأكسجين في 100٪ للتخدير الأولي، تليها 1-1.5٪ خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء. ضمان أن الفأر هو تخدير كاف عن طريق معسر بلطف الكفوف و / أو الذيل.
- ضع الماوس مستلق على الطاولة التعامل مع الماوس (تعيين لتسخين عند 37 درجة مئوية) وتغطية العينين مع زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية.
- تطبيق هلام الكهربائي على الأقطاب والشريط الكفوف إلى الأقطاب لرصد معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس، وتخطيط القلب. ضع ميزان حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم.
- تحقق أولا من أن الفأر هو الحامل من خلال وضع تصور والفرز الأجنة بواسطة الموجات فوق الصوتية. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على البطن ووضع مسح الرأس فوق المثانة. من أجل التناسق، تصور المثانة الأولى،وتعول الأجنة في اليسار وقرون الرحم اليمنى، بدءا من موقف المثانة. ضمان قلوب الجنينية والضرب بشكل طبيعي.
- إذا كان الماوس الحوامل، ضع طبق بيتري فوق موقع شق المستقبل مع الطين. اضغط الطبق قليلا على البطن بحيث الطبق هو في اتصال مباشر.
- إزالة الطبق وتعقيم البطن مرة أخرى. جعل 1.5-2 سم خط الوسط بطني شق، ما يقرب من 0،75 حتي 1 سم فوق المهبل، لفتح البطن والصفاق. تجنب إصابة الأعضاء الداخلية.
- من الداخل للظاهر اليسار أو اليمين الرحم القرن بالملقط، وسحب بلطف من خلال غشاء السيليكون من الطبق، وتحقيق الاستقرار في طبق على الطين مرة أخرى. منع اسعة سحب أو التلاعب، لأن هذا قد يسبب النزيف في الأوعية الرحم والوفاة المبكرة من الإناث و / أو الأجنة.
- عد الأجنة مرة أخرى للتأكد كافية حفظ السجلات التي تم حقن الاجنة.
- تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على شأبواق terine لصورة القلب ومنع الجفاف.
- صورة الجنين الأولى ليتم حقنه. تحقق الضرب العادي القلب الجنينية والاحتفاظ بسجلات للتوجه الجمجمة، الذيلية واليسار واليمين من الجنين. إذا لزم الأمر، إعادة قرن الرحم قليلا لضمان التوجه السليم. إذا هذا يثبت صعبة، والانتقال إلى الجنين القادم.
- ثقب الرحم بعناية مع إبرة حقن مكروي لوضع إبرة في زاوية 45 درجة فوق الجنين، قليلا خارج التامور (الشكل 3). لوصفها الخلايا النخابية، صورة قلب في طريقة عرض أربعة الغرفة ووضع الإبرة بحيث يشير نحو الأخدود الأذين البطين (الشكل 3). إذا يحتاج إلى أن يتم ضبط زاوية، وسحب الإبرة، وإعادة. لا ضبط زاوية مع إبرة داخل الرحم، لأن هذا قد كسر الإبرة. تجنب ثقب الأنسجة الأخرى، مثل أطرافه أو المشيمة.
- تحريك الإبرةعلى الجدار التامور وثقب ذلك مع اقتراح لطيف، ولكن سريع. بشكل عام، وسوف يكون هناك بعض المقاومة، ولكن تتحرك الإبرة سريع جدا قد يتسبب في طرف الإبرة لثقب القلب نفسه. يجب أن ينتهي الطرف حتى في الفضاء التامور الأخدود الأذين البطين. في حالة النزيف التامور، سوف خلايا الدم تكون مرئية كنمط مثل الثلج الأبيض. إذا كان هذا هو الحال، والتوقف عن حقن الجنين والانتقال إلى الجنين آخر.
- حقن injectate. ضخ الحد الأقصى 700 NL في الفضاء التامور لمنع التأثير السلبي على التنمية القلوب. رصد الحقن بواسطة طفيف، وتورم الزمني للكيس التامور.
- بعد الحقن، وسحب الإبرة خارج وتأكيد أن injectate لا يزال من الممكن إخراجه للتأكد من أن الإبرة لم انسداد بواسطة شظايا الأنسجة.
- إعادة الجدول مناولة لصورة وحقن الجنين القادم. الحفاظ على عدد من الأجنة حقن ل3-4 الحد الأقصى (في واحدة قرن الرحم) لمنعتمديد التخدير، للسماح للأجنة التحكم في قرن الرحم معارضة، وضمان أن الإجراء لم تخل التطور الجنيني.
- بعد حقن العدد المطلوب من الأجنة، وإزالة هلام الموجات فوق الصوتية الزائدة ووضع بلطف قرن الرحم مرة أخرى في البطن في موقعها الصحيح.
- إغلاق البطن الأمهات باستخدام طبقة واحدة من خياطة لالصفاق والعضلات في منطقة البطن، وطبقة ثانية من خياطة للبشرة.
- حقن الفأر مع الجرعة الأولى من الدواء الألم. استخدام حقنة واحدة من 0.05-0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين 15 دقيقة قبل إنهاء التخدير وثلاث حقن إضافية مع 12 فترات ساعة.
- وقف التخدير ومراقبة الماوس لاسترداد كافية من الإجراء. منزل الماوس الحوامل في قفص الفردية لمدة المرجوة من المتابعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بروتوكولات الحقن المذكورة أعلاه، وخلايا يمكن أن توصف و / أو حقنها في قلب الفأر الجنينية. كدليل على المفهوم، وتظهر العديد من الأمثلة التي بروتوكول الحقن وفيفو السابقين AVC ازدراع والقلب معزولة، أو ثقافة الجنين كلها كانت مجتمعة (الشكل 1).
ويبين الشكل 1 إعداد الجنين قبل حقن الخلايا. تتم إزالة الجنين من E9.5 الساقط، بينما الحفاظ على سلامة (1A الشكل) الكيس المحي. يتم فتح الكيس المحي فقط فوق القلب (الشكل 1B). اقترب ماصة (الشكل 1C) وحقن الخلايا. يحتفظ القلب شكله (الشكل 1D) ويبقى الضرب.
لمعالجة مسألة بيولوجية أكثر تحديدا في البيولوجيا التطورية مثل الظهارية للانتقال اللحمة المتوسطة (EMT)، تم حقن ازدراع E9.5 AVC مع ركلات الترجيحالحمض النووي الريبي التي أسفل ينظم بروتين المطلوبة للانتقال البطانية الوسيطة من الخلايا الشغاف (الشكل 2A). تم حقن الجنين التحكم مع العمود الفقري ناقلات الفارغة. وبالمثل، تم حقن الأشكال المستمدة من الخلايا خلايا ما قبل صمامي البطانية معربا عن GFP تحت سيطرة المروج Sox9 في AVC في E10.5، تليها 48 ساعة explanted الثقافة القلب. هذه الخلايا الحصول على علامات EMT مثل periostin مماثلة لخلايا الشغاف الذاتية (أرقام 2B و 2C).
هذه فيفو السابقين النهج هي سهلة نسبيا، ولكن تقتصر على المدى القصير المتابعة (الحد الأقصى 48-72 ساعة). يوفر الإجراء حقن الموجهة بالأمواج فوق الصوتية لنهج أكثر تحديا من الناحية التقنية، ولكن مع خيار على المدى الطويل، حتى ما بعد الولادة، في الرحم المتابعة. يظهر حقن الصبغة في الرحم أو من النواقل الفيروسية لتسمية الخلايا في مناطق محددة في القلب أرقام 3A-3 C. مع هذا الأسلوب، لا يمكن تحقيق وضع العلامات المحددة للخلايا النخابية مع الأصباغ الفلورية (أرقام 3D و 3E) أو الفيروس (الشكل 3F)، وطريقة يمكن توسيعها مع الخلايا أو injectates البديلة.
. الرقم 1 حقن الخلايا في القلب A:. E9.5 الجنين في الكيس المحي B: التصور للقلب بعد فتح الكيس المحي فقط فوق القلب. أقحم أدناه يظهر التكبير من القلب وتشير القناة AV C: نهج ماصة نحو AVC D:. حقن الجنين بعد 48 ساعة الثقافة (H = القلب).
محتوى العرض = "6in" FO: SRC = "/ files/ftp_upload/51356/51356fig2highres.jpg" سرك = "/ files/ftp_upload/51356/51356fig2.jpg" />
. الشكل 2 حقن من shRNA في AVC الجنين E9.5 يمنع فيفو السابقين EMT الخلايا الشغاف في القلب يزدرع ج: تم حقن العمود الفقري السيطرة ناقلات أو shRNA جنبا إلى جنب مع lipotectamine في AVC من E9.5 جنين فأر؛ في وقت لاحق 3 ساعة، تم تشريح AVC بها ونمت على هلام الكولاجين من أجل تحريك EMT الخلايا الشغاف. وshRNA downregulated البروتين ما هو مطلوب لEMT قبل الميلاد: تم حقن الخلايا صمامي الأشكال المستمدة من الخلايا المهندسة في التعبير عن GFP تحت سيطرة المروج Sox9 في AVC الأجنة E10.5. كان قلب تربيتها لمدة 2 يوم (B)، والثابتة في وقت لاحق وملطخة الأضداد المضادة للperiostin (C). يظهر أقحم التكبير من المنطقة AVC.
ه = "دائما"> 
. الرقم 3 في حقن الرحم ج: مخطط تصور الإعداد التجريبية. يتم وضع الماوس الحوامل مستلق وطبق بتري مع غشاء السيليكون يستقر فوق موقع شق. 1 = microinjector، 2 = محول، 3 = طبق بتري مع غشاء السيليكون، 4 = هلام الموجات فوق الصوتية، 5 = الفأر مع أبواق الرحم (الأحمر)، 6 = اللعب دوه الطين، 7 = الجدول التعامل مع الماوس ب: لا يزال الإطار ل الموجات فوق الصوتية الفيلم (وضع M) تبين الموقف من الإبرة والقلب الجنينية قبل الحقن. يظهر تخطيط القلب الإناث في أسفل (الأخضر)، والقلب ومعدل التنفس في أسفل اليمين (الصفراء). H = القلب C: صورة الموجات فوق الصوتية التي تبين موقف الإبرة والقلب الجنينية أثناء الحقن. أقحم: غيض اجتاز التأمور، ولكن لا تلمس عضلة القلب، حتى أن حقنأكلت يمكن حقنها في الفضاء التامور الأخدود الأذين البطين. الخطوط المنقطة السوداء بمناسبة حدود الأذين (A) والبطين (V) D: جبل بأكمله صورة الجنين E11.5 الماوس تظهر مضان قوية للصباغة في الفضاء التامور E:. القسم ممثل لE11.5 الجنينية القلب الماوس تظهر وسم الخلية التامور والنخابية مع صبغة الفلورسنت (CDCFDA-SE والأخضر) 4 ساعة بعد الحقن. وصفت نوى مع دابي (الأزرق). LA = الأذين الأيسر، LV = البطين الأيسر، RA = الأذين الأيمن، RV = البطين الأيمن F:. القسم ممثل لE14.5 الجنينية القلب الماوس تظهر وسم الخلية النخابية الفسيفساء مع الفيروسة البطيئة معربا عن GFP بعد 3 أيام الحقن. لتأكيد خصوصية GFP، كانت ملطخة البروتين GFP أيضا مع الأضداد GFP (أحمر). وصفت نوى مع دابي (الأزرق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تصميم السابقين بروتوكولات حقن الجسم الحي داخل القلب المذكورة أعلاه للحفاظ على وظيفة عضلة القلب لمدة 48 ساعة على الأقل في منتصف مرحلة (E9.5-E11.5) أجنة الفئران. هذه الأساليب تسمح للحقن حقن استهدفت مكانيا من الحمض النووي أو الخلايا. وبعض الأمثلة هو مبين في الأرقام 1-3 يقدم دليلا على مفهوم لترسيم فيفو السابقين والآليات الجزيئية في الجسم الحي من العمليات التنموية التي تجري في مناطق القلب المقيدة، مثل EMT الخلايا الشغاف أو النخابية. الأهم من ذلك، توفر هذه البروتوكولات فرصة لمتابعة الهجرة ومصير حقن الخلايا مثل الخلايا الجنينية البشرية أو المشتقات huESC في بيئة الجنينية المناسبة، تحديا لذلك لم تلب حتى الآن. في الجسم الحي وضع العلامات (مثل الخلايا النخابية في الشكل 3) مع تشبع أو الحد من التخفيفات من صبغ أو فيروس يسمح لتتبع النسب من الخلية (جنوب) على السكان القصير وكذلك على المدى الطويل بأسيس، دون الحاجة إلى التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن (وإن كان الجمع بين هذه التقنيات قد يكون من المفيد أيضا).
وقد لوحظت العديد من الخطوات الحاسمة أثناء تطبيق هذه البروتوكولات. الأولى، الأجنة هي حساسة جدا للضوء. لذا فمن المستحسن لممارسة بروتوكول الحقن تحت stereomicroscope بحيث يمكن تنفيذ الإجراء مع استنساخ عالية وكفاءة في غضون 15 دقيقة في الجنين. في نفس السطر، يجب أن يتم تنفيذ كامل إجراء الحقن بوساطة الموجات فوق الصوتية في غضون 30 دقيقة للحفاظ على استمرارية جيدة من الأجنة وعدم تقديم تنازلات في الرحم التنمية. يجب أن تبقى التلاعب في الرحم إلى الحد الأدنى. بالإضافة إلى ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الجراحة التي أجريت على الفئران الحوامل يميل إلى نتيجة في الولادة المبكرة (1-2 أيام في وقت سابق من المعتاد). ومع ذلك، ينبغي أن يكون حديثي الولادة صحي عموما وتتطور بشكل طبيعي. علاوة على ذلك، تغلغل ماصة من خلال جدار الرحم، كيس المح والجنينللوصول إلى التأمور وأخيرا عضلة القلب هو إجراء حساسة (الخطوة 5.3.13). وينبغي أن يتم هذه الخطوة بعناية وبلطف. لالأمثل، فمن المستحسن لأداء عدة حقن الصبغة على المدى القصير لتحديد استنساخ واستبعاد الحقن في المناطق غير المستهدفة. أخيرا، لم نجد عيوب القلب التنموية ذات الصلة إجراءات حقن للالأمثلة الواردة أعلاه. ومع ذلك، فإن أكثر تفصيلا، مرحلة تلو المرحلة، يجب أن يتم تنفيذ التحليل الصرفي وظيفية للتأكد تماما التطور الطبيعي وظيفة خلال مراحل الفائدة.
القيود المفروضة على هذه التقنيات عدة. (ط) الحقن تحت stereomicroscope محدودة بسبب الضوء والحرارة حساسية أجنة الفئران. هذا يمكن التغلب عليها عن طريق ممارسة إجراء حقن مكروي من أجل أن تكون أسرع وقت ممكن، لتحل محل بانتظام أو ارتفاع درجة حرارة متوسطة، والعمل في غرفة مظلمة. (ب) والسابقين الخامسثقافة ايفو الأجنة أو إإكسبلنتس يقتصر في الوقت المناسب، وعلى النقيض من حقن الموجهة بالأمواج فوق الصوتية في الرحم، والذي يسمح على المدى الطويل المتابعة. الأصباغ الحيوية تميل إلى تسمية الخلايا على الفور تقريبا، وتبقى مرئية تصل إلى ثلاثة أو أربعة أيام بعد الحقن. ومع ذلك، سوف تضعف شدة الصبغة عن طريق الانقسامات الخلوية المتتالية. وصفها الخلايا مع الفيروسة البطيئة قد تغلب على هذه المشكلة. ومع ذلك، امتصاص الفيروس يستغرق عدة ساعات والتعبير هو الأمثل بعد 24-48 ساعة، والذي يمنع التحليل على المدى القصير. (ج) يتم حقن بوساطة الموجات فوق الصوتية محدودة بسبب تكلفة المعدات. القرار من 40 ميغاهيرتز محول غير كافية في منتصف وأواخر مرحلة الأجنة، ولكن أكثر يحد من المراحل قبل E11.5.
وباختصار، فإننا نقترح أن البروتوكولات حقن القلب المذكورة أعلاه ينبغي أن تستخدم في أجنة الفئران مرحلة منتصف. في الجسم الحي السابقين تقنية متوافق مع ثقافة الأجنة، وقلوب معزولة، أو ازدراعق. يسمح للفي الجسم الحي الإجراء على المدى الطويل المتابعة، بما في ذلك التنمية في مرحلة ما بعد الولادة. وسوف تساعد هذه التقنيات بشكل كبير في اختبار إمكانية التفريق بين مشتقات الخلايا الجذعية البشرية في بيئة سليمة، وكذلك في معالجة مسائل محددة من البيولوجيا التطورية مثل الهجرة الخلية والعظة الإقليمية، والتي هي الأحداث الرئيسية في الطريق نحو تشكيل القلب وظيفية . بالإضافة إلى ذلك، قد تكون في المستقبل أن تستخدم أساليب عملنا ومصالح الآخرين 10 للتحقيق من الأجهزة الأخرى من القلب، تعتمد على بروتوكولات المتوفرة السابقين الثقافة فيفو و / أو المرحلة التنموية في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يعترف واضعو Leducq مؤسسة (التاجي) والوكالة الوطنية صب لا بحوث (منح وكالة الاستخبارات الوطنية Specistem) لتمويل هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
