Summary
Vi beskriver en række metoder til at injicere farvestoffer, DNA-vektorer, virus og celler for at overvåge både celleskæbnen og fænotype af endogene og podede celler afledt fra embryonale eller pluripotente celler i musefostre på embryonisk dag (E) 9,5 og senere stadier udvikling.
Abstract
Test skæbne embryonale eller pluripotente stamceller-derivater i in vitro-protokoller har ført til kontroversielle resultater, som ikke nødvendigvis afspejler deres in vivo potentiale. Helst bør disse celler placeres i en ordentlig embryonale miljø med henblik på at erhverve deres bestemt fænotype. Desuden har celleafstamning opsporing studier i mus efter mærkning af celler med farvestoffer eller retrovirusvektorer forblev det meste begrænset til tidlige fase museembryoer med stadig dårligt udviklede organer. For at overvinde disse begrænsninger, vi har designet standard og ultralyd-medieret mikroinjektion protokoller til at injicere forskellige agenter i målrettede områder af hjertet i museembryoer på E9.5 og senere stadier af udvikling. Embryonale eksplantat eller embryoner dyrkes derefter eller venstre for at videreudvikle i livmoderen. Disse midler indbefatter fluorescerende farvestoffer, virus, shRNAs eller stamceller progenitorceller. Vores tilgang giver mulighed for bevarelse af den fulnction af orglet under overvågning migration og skæbne af mærkede og / eller injicerede celler. Disse teknologier kan udvides til andre organer, og vil være meget nyttigt at tage fat på centrale biologiske spørgsmål i biologi udvikling.
Introduction
Mere end et årti siden, har menneskelige embryonale stamceller (HuESCs) stammer fra humane blastocyster 1. Siden da har disse celler bliver genstand for en vigtig forskningsområde, som omhandler uopfyldte spørgsmål i menneskets udviklingsmæssige biologi. HuESCs har desuden forudsat håb i regenerativ medicin. I de senere år har menneskelige induceret pluripotente stamceller (iPSCs) blevet genereret fra patient-specifikke somatiske celler, der giver modeller af genetiske sygdomme 2. Mange in vitro-protokoller til differentiering af embryonale eller induceret pluripotente stamceller i retning af forskellige cellelinier, herunder hjerte slægter 3, er blevet rapporteret. De differentierede celler er ofte fænotypebestemmes ved analyse af RNA-ekspression og proteinekspression, immunfarvning, og / eller in vitro-funktionelle tests. Men pluripotente stamceller derivater har, skal placeres i en ordentlig embryonale miljø med henblik på at teste, om de fuldt erhverve cell skæbne deres embryonale modpart og om de rekapitulere den ægte in vivo funktion som reaktion på de regionale signaler. Mens tissue engineering er lovende, betyder det endnu ikke give alle de kendte og ukendte tidskoder af den rette in vivo udviklingslande embryonale væv 4,5.
Cell mærkning med farvestoffer eller retrovirusvektorer i embryoner, herunder museembryoer har bragt vigtige oplysninger om den embryonale oprindelse celleafstamninger under hjerte-udvikling 6. For eksempel farvestof injektion i perikardial rum musefostre ex vivo, efterfulgt af in vitro dyrkning af isolerede hjerter, blev anvendt til at mærke epikardielle celler og deres efterkommere 7. Imidlertid har farvestof og retroviral cellemærkning været det meste anvendt på tidlig museembryoer med stadig dårligt udviklede organer eller kyllingefostre, som er mere let tilgængelige 8.. En undtagelse er i hjernen, som er lettere at målrette i embryos 9,10. En sådan fremgangsmåde er endnu ikke blevet anvendt på at slå embryonale mus hjerte.
Som supplement til direkte mærkning med farvestoffer eller virus og til at udføre afstamning opsporing i mere fremskredne stadie museembryoer og voksne mus, har den tilgang cellemærkning blevet kombineret med en analyse af transgene mus ved hjælp af Cre / Lox teknologi. Cre / Lox tilgang 11 dog har visse begrænsninger på grund af Spatiotemporal specificiteten af de genomiske regulatoriske regioner anvendes til at drive ekspression af rekombinasen, og effektiviteten af Cre / Lox rekombination 12. Hertil kommer, at denne tilgang ikke fuldt ud løse de konkrete spørgsmål om migration drevet erhvervelse af celle skæbne celle, da det kun kan mærke en forløber efter aktivering af de lovgivningsmæssige område bruges til at drive Cre udtryk. Det kan heller ikke anvendes på menneskelige embryoner af indlysende etiske spørgsmål.
På baggrund af disse begrænsninger, har vi designet en række nye protocols at indsprøjte en række celle mærkningsordninger, såsom fluorescerende farvestoffer, virus, genekspression modulatorer såsom shRNAs og DNA-baserede celle mærkning af vektorer eller celler i mus embryo på E9.5 og senere stadier af udvikling i målrettede områder af hjerte.
DNA / celle injektioner bruge et stereomikroskop og en enkel mikroinjektion enhed kombineret med ex vivo embryo kultur op til 48 timer, eller isolerede hjerte eller embryonale explant kultur for 48-72 timer. Vi rapporterer også en ultralyd-medieret mikroinjektion protokollen i mus embryonale hjerter i livmoderen. Denne teknik gør det muligt at overvåge udviklingen af embryoner 13 og giver mulighed for langsigtet opfølgning af injectates og / eller mærkede celler.
Vi fandt, at disse tilgange bevare funktionen af organet og give en mere repræsentativ miljøet end in vitro-test af stamceller potentiale. Det giver også mulighed for at følge migrationmærket og / eller injiceres celler til at overvåge deres skæbne. I sidste ende bør det give en bedre forståelse af den regionale væv mønster og vigtige biologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse
Dyreforsøg
Indhente godkendelse fra et dyr etisk udvalg og følg de institutionelle retningslinjer for arbejdet med virus, HuESC og / eller IPSC (hvis relevant) samt mus håndtering, opnå museembryoer og udføre mus kirurgi. For timede parringer er dagen for proppen betragtes embryonisk dag (E) 0,5 / 0,5 dage post coitum.
- Mikroinjektionsteknikker nåle:
For ex utero mikroinjektion trække glaspipetter (1,2 mm ydre diameter borsilicat kapillære rør) ved hjælp af en pipette aftrækker / beveller at få en 1 eller 10 um indre spids diameter og en skarp og konisk spids form at injicere DNA eller celler. For ultralyd-medierede injektioner, brug tilpassede sterile nåle, som har en ydre / indre diameter (OD / ID) på 1,14 mm/0.53 mm med en 50/35 um OD / ID-tip. - Silicium-fyldte petriskåle:
Forbered silicium som beskrevet i vejledningen. Fylden diameter rent glas 60 mm petriskål med et elastomerlag på ~ 1 cm. Undgå luftbobler. - Instrumenter:
Hold alle kirurgiske instrumenter sterile før og under proceduren. - DNA forberedelse:
Tilsæt 3 ug DNA og 12 pi Opti-MEM i et rør. Tilsæt 3 pi Lipofectamine 2000 og 12 pi Opti-MEM i et andet rør. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur og blandes begge opløsninger. Anvendes straks. - Cell forberedelse:
Forbered en suspension af 10 6 celler / ml DMEM (Dulbeccos Eagle medium, høj glucose og 50% rotte serum). 50 pi af den endelige cellesuspension er nok til 8-10 embryoner. - Dye forberedelse:
Brug grønt fluorescerende CDCFDA-SE på 25 mg / ml DMSO. Forbered 20 portioner og butik gl ved -20 ° C. Fortyndes 1:100 / 1:200 i steril saltopløsning eller PBS før brug. - Virus forberedelse:
Brug en kommerciel 3. generation PGK-GFP-udtrykkende lentivirus med en titer på ~ 10 9 -10 10 transducing enheder / ml DMEM. Til fremstilling af lentivirus, se Tiscornia et al. 14. Bær personlige værnemidler og sikkert bruge og disponere over virus.
2.. Indsamling af E9.5 og E10.5 Embryoner til Ex vivo Injektion
- Aflive en gravid mus på embryonal dag 9.5 eller 10.5.
- Sterilisere brystet og maven af musen med 70% ethanol.
- Lav en ventral midtlinjeincision at åbne maven og hente uterushornet ved RT i PBS og overføre det efter to gange vask med PBS til en silikone-fyldte petriskål med M16 medium.
- Nål uterushornet med insektnet nedenfor til silicone lag, således at den vaskulariserede side af livmoderen er i bunden.
- Skær overfladen af uterus med fin pincet og en hætte af decidua på 1 mm under overfladen.
- Forsigtigt hente foster i blommesækken ved at sprede ud væggene af decidua.
- Opbevar embryoner ved 37 °; C i M16 medium før celleinjektion. Til injektion hver embryon overføres til silikone fad fyldt med M16 medium forvarmet ved 37 ° C.
3.. DNA eller celle injektion under et stereomikroskop
- Fyld glaspipette fra bagsiden med en Hamilton-sprøjte og ryst pipetten til at fjerne bobler på spidsen.
- Sæt pipetten på mikroinjektionen indehaveren; indstille bedriften tryk til 50 (DNA) eller 30 (celler) hPa og indsprøjtningstryk til 150 (DNA) til 300 (celler) hPa. Indstil injektion tid til 0,2 sekunder (DNA) eller 0,5 sek (celler). Disse indstillinger kan variere lidt alt efter typen af mikroinjektor og pipette.
- Pin embryonet til silikone bunden gennem blommesækken uden at røre embryo korrekt. Se området af hjertet og åbne sækken lige over denne region.
- Tilføj 4 ben rundt embryonet til at forhindre enhver bevægelse under celle injektion.
- Brug af mikromanipulator (indstillet til manuel), slowly position pipettespidsen i en vinkel på 45 ° over hjertesækken, lige over det område af hjertet, der skal injiceres (figur 1).
- Flyt pipetten ind i regionen af interesse og udløse injektionen. Tag pipetten så hurtigt som muligt. Sørg for, at hjertet er korrekt at slå efter DNA / celle injektion.
4.. Embryo, isolerede hjerte, og Eksplantat Kultur
- Kultur E9.5 embryoner i 25% M2 medium og 75% rotte serum, suppleret med penicillin / streptomycin, forvarmet ved 37 ° C og iltet med 40% O 2.
- Tilsæt 2 ml dyrkningsmedium i en 25 ml glas, forsigtigt tilføje embryonet, og oxygenat med 40% O 2, før skrue hætten på røret. Inkuber op til 36 timer ved 37 ° C under rotation eller omrystning (30 omdrejninger / min.)
- På det ønskede tidspunkt (fx 24 timer), dissekere hjerter omhyggeligt med fine pincet, uden at røre hjerter ved første decapitating embryonerne; hjertet er let at punktafgifter ved at trække det ud ved hjælp af distale udstrømning tarmkanalen.
- Kultur det isolerede hjerte for en anden 36-48 hr i DMEM med 50% FCS på en Matrigelcoatede insert i en plade med 12 brønde. Se Dyer & Patterson (2013) for en forbedret protokol hjerte kultur 15.
- Foretag explant af regionen af interesse. Som et eksempel, dissekere atrioventrikulær kanalen (AVC) og kultur er det for 48 timer på kollagen type 1 gel 16.
5.. Ultralyd-vejledt injektion i hjertet I n utero
- Opsætning af ultralyd maskine og mikroinjektor:
- Brug høj opløsning ultralyd-system med en 40 MHz transducer og mikroinjektion setup på en skinne.
- Indstil injektionsvolumen på mikroinjektor på 69 nl per injektion. Se producentens mikroinjektion manual for programmering af mikroinjektor.
- Forberedelse af microinjection opsætning og injektion:
- Placer en glasmikropipette i mikroinjektor. For at sikre effektiv injektion første belægge indersiden af pipetten med mineralolie ved at suge op til den maksimale volumen. Derefter skubbe olien igen forlader 1-2 mm olien i nålen.
- Aspirer injektatet indtil maksimale lydstyrke er nået. Vær omhyggelig med ikke at berøre nogen overflader med nålespidsen, da dette vil sløve spidsen og gøre injektionen mere vanskeligt.
- For at stabilisere livmoderhorn indeholder embryoner under injektion, skal du bruge en modificeret petriskål med et hul i midten (2,5 cm i diameter), dækket af et tyndt silicone membran med en lille slids skåret i midten, og placer det over incisionssted . Stabiliser petriskålen om håndtering musen tabellen ved at placere 3-4 klumper af ler under kanterne af fadet.
- Injektion procedure:
- Barbere maven af en gravid mus (ved den ønskede fosterstadiet) før anesthesia til at fjerne hår. Behandl maven med et kemisk hårfjerning middel for at fjerne tilbageværende hår og steriliseres med 70% ethanol.
- Bedøver en gravid mus med ilt / isofluran via en ansigtsmaske. Brug 3-5% isofluran i 100% oxygen til indledende anæstesi, efterfulgt af 1-1,5% under resten af proceduren. Sørg for, at musen er tilstrækkeligt bedøvet ved forsigtigt at klemme sine poter og / eller hale.
- Anbring musen liggende om håndtering mus tabel (indstillet til varme ved 37 ° C) og dække øjnene med smøremiddel for at forhindre udtørring af hornhinden.
- Påfør elektrode gel på elektroderne og tape poterne til elektroderne for at overvåge puls, respirationsfrekvens og EKG. Placer en rektal termometer til at overvåge kropstemperaturen.
- Kontroller først, at musen er gravid ved at visualisere og tælle embryoner ved ultralyd. Påfør ultralyd gel på maven og placer scanningen hovedet over blæren. For konsistens, visualisere blæren først,og tælle embryoner i venstre og højre uterine horn, begyndende fra den position af blæren. Sørg for, at embryonale hjerte slå normalt.
- Hvis musen er gravid, skal du placere petriskål over den fremtidige incisionssted med ler. Tryk på fadet lidt på maven, så fadet er i direkte kontakt.
- Tag fadet og sterilisere maven igen. Lav en 1,5-2 cm ventralt midtlinjeincision ca 0.75-1 cm over skeden, for at åbne maven og bughinden. Undgå skader på indre organer.
- Eksteriorisere venstre eller højre livmoderhorn med en pincet, forsigtigt trække det gennem silicium membran af fadet, og stabilisere fadet på ler igen. Forhindre omfattende trække eller manipulation, da dette kan medføre blødning i livmoderens skibe og for tidlig død af den kvindelige og / eller embryoner.
- Tæl embryoner igen for at sikre tilstrækkelig journalføring af hvilke embryoner blev injiceret.
- Påfør ultralyd gel på uterine horn til billedet hjertet og for at undgå dehydrering.
- Billede første embryo skal injiceres. Tjek normal slå af embryonale hjerte og føre optegnelser over kranie-caudale og venstre-højre orientering af embryoet. Hvis det er nødvendigt, repositionere uterushornet anelse for at sikre korrekt orientering. Hvis dette viser sig vanskeligt, gå videre til den næste foster.
- Punktere livmoderen forsigtigt med mikroinjektion nålen til at placere nålen i en 45 ° vinkel over embryonet, lidt uden for hjertesækken (figur 3). Ved mærkning af epikardielle celler, billede hjertet i en fire-kammer udsigt og placer nålen, så den peger mod atrioventrikulær rille (Figur 3). Hvis vinklen skal justeres, træk nålen ud og flytte. Må ikke justere vinklen med nålen inde i livmoderen, da dette kan knække nålen. Undgå at punktere andre væv, såsom lemmer eller placenta.
- Flyt nålenpå pericardial væg og punktere den med en blid, men hurtig bevægelse. I almindelighed vil der være en vis modstand, men bevæger nålen for hurtigt kan forårsage nål til at punktere selve hjertet. Spidsen skal ende op i perikardiel rum atrioventrikulær rille. I tilfælde af perikardial blødning vil blodlegemer være synligt som et hvidt, sne-lignende mønster. Hvis dette er tilfældet, stop injicere embryoet og gå videre til en anden foster.
- Sprøjt injektatet. Sprøjt maximalt 700 nl ind perikardiel plads til at forhindre negativ effekt på hjerter udvikling. Overvåg ordentlig indsprøjtning med mindre, tidsmæssig hævelse af hjertesaek.
- Efter injektion, træk nålen ud og bekræfte, at injektat stadig kan skubbes ud for at sikre, at nålen ikke var tilstoppet af væv fragmenter.
- Flyt håndtering tabellen til billede og injicere den næste foster. Holde antallet af injicerede embryoner til maximalt 3-4 (i et livmoderhorn) for at forhindreforlænget anæstesi, for at muliggøre kontrol embryoner i den modsatte livmoderhorn, og for at sikre, at proceduren ikke forstyrrede embryonale udvikling.
- Efter injektion af det ønskede antal embryoner, fjerne overskydende ultralyd gel og forsigtigt placere livmoderhorn tilbage i maven i sin korrekte position.
- Luk maternal maven ved hjælp af et lag af sutur til peritoneum og abdominale muskler, og et andet lag af sutur til huden.
- Sprøjt mus med den første dosis af smertestillende medicin. Brug en injektion af 0,05-0,1 mg / kg Buprenorphin 15 minutter før slutter anæstesi og yderligere tre injektioner med 12 timers mellemrum.
- Afbryd anæstesi og overvåge musen tilstrækkelig genopretning fra proceduren. Hus den gravide mus i en individuel bur til den ønskede varighed af opfølgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af injektionsprotokoller beskrevet ovenfor kan celler mærkes og / eller injiceres i den embryoniske mus hjerte. Som bevis for konceptet, er vist flere eksempler, hvor injektionen protokollen og ex vivo AVC eksplantat, isolerede hjerte eller hele embryokultur blev kombineret (figur 1).
Figur 1 viser fremstillingen af embryoet før celleinjektion. Den E9.5 embryoer fjernes fra sin decidua og samtidig bevare integriteten af blommesækken (figur 1A). Blommesækken åbnes lige over hjertet (figur 1B). Pipetten er kontaktet (figur 1C), og cellerne injiceres. Hjertet bevarer sin form (figur 1D) og forbliver slå.
For at imødegå en mere specifik biologisk spørgsmål i udviklingsmæssige biologi, såsom epitel at mesenkymet overgang (EMT), blev en E9.5 AVC explant injiceres med en shRNA, som nedregulerer et protein nødvendigt for endotel-mesenchymale overgang endokardiale celler (figur 2A). Styringen embryo blev injiceret med en tom rygrad vektor. Ligeledes var nuancer celleafledte endotel præ-valvulær celler, der udtrykker GFP under kontrol af Sox9 promotoren injiceres i AVC ved E10.5, efterfulgt af 48 timer eksplanterede hjerte kultur. Disse celler erhverver markører for EMT såsom periostin svarer til de endogene endokardiale celler (figur 2B og 2C).
Disse ex vivo metoder er forholdsvis let, men er begrænset til kortvarige opfølgning (maksimalt 48-72 timer). Injektion Proceduren for ultralyd-vejledt giver en teknisk mere udfordrende tilgang, men med mulighed for på længere sigt, selv efter fødslen, i livmoderen opfølgning. In utero-injektion af farvestof eller virale vektorer til at mærke cellerne i specifikke hjerte regioner er vist i figur 3A-3 C. Med denne metode kan der opnås særlig mærkning af epikardielle celler med fluorescerende farvestoffer (figur 3D og 3E) eller virus (figur 3F), og metoden kan udvides, med celler eller alternative injectates.
. Figur 1. Cell injektion i hjertet A:.. E9.5 foster i blommesækken B: visualisering af hjertet efter åbning blommesækken lige over hjertet. Det indsatte nedenfor viser en forstørrelse af hjertet og peger AV kanalen C:. Tilgang af pipetten mod AVC D:. Injiceret embryo efter 48 timers kultur (H = hjertet).
. Figur 2. Injektion af en shRNA i AVC af E9.5 embryoer, der forhindrer ex vivo EMT af endokardiale celler i en hjerte eksplantat A:. Kontrol rygraden vektor eller en shRNA blev injiceret sammen med lipotectamine i AVC af E9.5 mus foster; 3 timer senere blev AVC dissekeret og dyrket på en kollagengel for at udløse EMT af endokardiale celler. ShRNA nedreguleret et protein, der er nødvendig for EMT BC:. Nuancer celleafledte valvulær celler gensplejset til at udtrykke GFP under kontrol af Sox9 promotoren blev injiceret i AVC af E10.5 embryoer. Hjertet blev dyrket i 2 dage (B), og derefter fikseret og farvet med et anti-periostin antistof (C). Det indsatte viser en forstørrelse af AVC-regionen.
.. Figur 3. In Utero indsprøjtning A: ordning skildrer forsøgsopstillingen. Den gravide mus er placeret liggende og en petriskål med silikone membran er stabiliseret over incisionssted. . 1 = mikroinjektor, 2 = transducer 3 = petriskål med silikone membran, 4 = ultralyd gel, 5 = mus med Uterushornene (rød), 6 = Play-Doh ler, 7 = mus håndtering tabel B: stillbillede af en ultralyd filmen (M-tilstand), der viser placeringen af nålen og embryonale hjerte før injektion. Den kvindelige EKG vises nederst (grøn) og hjerte og åndedræt sats i nederste højre (gul). H = hjerte C:. Ultralydsbilledet viser placeringen af nålen og embryonale hjertet under injektion. Indsat: spidsen har passeret hjertesækken, men ikke rører myokardiet, således at injicerespiste kan injiceres perikardial rum atrioventrikulære fordybning. Sorte stiplede linjer markerer grænser atrium (A) og hjertekammer (V) D:. Hele mount billede af en E11.5 mus foster viser stærk fluorescens af farvestoffet i perikardiel rum E:. Repræsentativt udsnit af en E11.5 embryonale mus hjerte viser pericardial og epikardielle celle mærkning med et fluorescerende farvestof (CDCFDA-SE, grøn) 4 timer efter injektion. Kerner mærket med DAPI (blå). LA = venstre atrium, LV = venstre ventrikel, RA = højre atrium, RV = højre hjertekammer F:. Repræsentativt udsnit af en E14.5 embryonale mus hjerte viser mosaik epikardielle celle mærkning med GFP-udtrykkende lentivirus 3 dage efter injektion. For at bekræfte GFP specificitet blev GFP-proteinet også farves med et GFP-antistof (rød). Kerner mærket med DAPI (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intra-kardiale ex vivo injektion protokoller, der er beskrevet ovenfor, er beregnet til at bevare myokardie funktion i mindst 48 timer i midten af scenen (E9.5-E11.5) museembryoer. Disse injektion fremgangsmåder giver mulighed for rumligt målrettet injektion af DNA eller celler. De få eksempler er vist i figur 1-3 giver proof of concept for afgrænsning ex vivo og in vivo molekylære mekanismer for udviklingsmæssige processer, der finder sted i begrænsede hjerte regioner, såsom EMT af endokardiale eller epikardielle celler. Vigtigst er det, disse protokoller giver en mulighed for at følge migration og skæbne injicerede celler såsom menneskelige embryonale celler eller huESC derivater i en ordentlig embryonale miljø, et hidtil udækket udfordring. In vivo mærkning (ligesom epikardielle celler i figur 3) med mættende eller begrænse fortyndinger af farvestof eller virus muliggør afstamning sporing af celle (under) populationer på kort såvel som på lang sigt basis, uden behov for Cre / lox-teknologi (selvom kombinere disse teknikker kan være nyttig såvel).
Flere kritiske trin, mens anvendelsen af disse protokoller blev observeret. Først embryoner er meget følsomme over for lys. Det anbefales derfor at praktisere injektionen protokol under et stereomikroskop, således at proceduren kan udføres med høj reproducerbarhed og effektivitet inden for 15 minutter per embryo. I samme linje, skal hele ultralyd-medierede indsprøjtning procedure skal udføres inden for 30 minutter for at bevare en god levedygtighed embryoner og ikke på kompromis deres in utero udvikling. Manipulation af livmoderen bør holdes på et minimum. Derudover skal det bemærkes, at kirurgi på gravide mus tendens til at resultere i for tidlig fødsel (1-2 dage tidligere end normalt). Imidlertid bør nyfødte generelt være sund og udvikle sig normalt. Yderligere indtrængningen af pipetten gennem livmodervæggen, blommesækken og embryoetat nå hjertesækken og endelig myokardiet er en delikat procedure (trin 5.3.13). Dette trin skal udføres omhyggeligt og forsigtigt. For optimering, anbefales det at udføre flere kortvarige farvestof injektioner til at bestemme reproducerbarhed og udelukke injektion i ikke-målrettede områder. Endelig har vi ikke fundet udviklingsmæssige hjertedefekter relation til procedurerne for de ovenfor givne eksempler injektion. Men en mere detaljeret, trin-for-trin, morfologisk og funktionel analyse bør udføres helt konstatere normal udvikling og funktion i de faser af interesse.
Begrænsningerne i disse teknologier er flere. (I) injektion under stereomikroskop er begrænset af lys og temperatur følsomhed musefostre. Dette kan overvindes ved praksis af mikroinjektion procedure for at være så hurtig som muligt, der regelmæssigt udskiftning eller opvarmning af mediet, og arbejder i et mørkt rum. (Ii) ex vivo kultur embryoer eller eksplantater er begrænset i tid, i modsætning til i livmoderen ultralyd-vejledt injektion, som giver mulighed for langvarig opfølgning. Vital farvestoffer tendens til at mærke celler næsten øjeblikkeligt og stadig være synlig op til tre til fire dage efter injektion. Dog vil intensiteten af farvestoffet fortyndes ved successive celledelinger. Mærkning celler med lentivirus kan løse dette problem. Men optagelse af virus tager flere timer og udtryk er optimal efter 24-48 timer, hvilket forhindrer kortsigtet analyse. (Iii) ultralyd-medieret injektion er begrænset af omkostningerne til udstyr. Opløsningen af 40 MHz transducer er tilstrækkelig til mellem-og sen-fase embryoner, men mere begrænsende for etaper forud for E11.5.
Sammenfattende foreslår vi, at de kardielle injektionsprotokoller ovenfor beskrevne bør anvendes i mid-stage musefostre. Den ex vivo teknik er foreneligt med den kultur af embryoner, isolerede hjerter, eller explantsek. In vivo procedure giver mulighed for langsigtet opfølgning, herunder post-natal udvikling. Disse teknikker vil hjælpe betydeligt i at teste differentiering potentiale menneskelige stamceller derivater i en ordentlig miljø, samt i håndteringen specifikke spørgsmål af udviklingsmæssige biologi, såsom celle migration og regionale signaler, som er centrale begivenheder i vejen mod at forme en funktionel hjerte . Derudover kan vores metoder og andres 10 i fremtiden vil blive anvendt til undersøgelse af andre organer end hjertet, afhængig tilgængelige ex vivo kultur protokoller og / eller udviklingsstadiet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkender Foundation Leducq (mitral) og Agence Nationale pour la Recherche (indrømme ANR Specistem) for at finansiere denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
