Summary
We beschrijven een aantal methoden om kleurstoffen injecteren van DNA vectoren, virussen en cellen om zowel cellot en fenotype van endogene en geënte cellen uit embryonale of pluripotente cellen in muizenembryo's op embryonale dag (E) 9,5 en latere stadia bewaken ontwikkeling.
Abstract
Testen het lot van embryonale of pluripotente stamcel-derivaten in vitro protocollen tot controversiële resultaten die niet noodzakelijkerwijs hun in vivo potentie weerspiegelen. Bij voorkeur moet deze cellen in een geschikte embryonale omgeving geplaatst teneinde de definitieve fenotype te verkrijgen. Bovendien heeft cell lineage tracing studies in de muis na het labelen van cellen met kleurstoffen of retrovirale vectoren meestal beperkt tot vroeg stadium muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen gebleven. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we standaard en ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocollen aan verschillende agenten te injecteren in gerichte gebieden van het hart in muizenembryo's op E9.5 en latere stadia van ontwikkeling. Embryonale explant of embryo's worden vervolgens gekweekt of links om verder te ontwikkelen in de baarmoeder. Deze middelen omvatten fluorescerende kleurstoffen, virus, shRNAs of stamcel-afgeleide stamcellen. Onze aanpak kan voor het behoud van de functies van het orgel terwijl het toezicht op de migratie en het lot van gelabelde en / of geïnjecteerde cellen. Deze technologieën kunnen worden uitgebreid naar andere organen en zal zeer nuttig zijn om de belangrijkste biologische vragen te beantwoorden in de biologie van ontwikkeling.
Introduction
Meer dan een decennium geleden, hebben menselijke embryonale stamcellen (HuESCs) is afgeleid van menselijk blastocysts 1. Sindsdien hebben deze cellen het onderwerp van een belangrijk gebied van onderzoek dat onvervulde vragen in ontwikkelingsbiologie mens behandelt te worden. HuESCs zijn verder voorzien van hoop in de regeneratieve geneeskunde. De laatste jaren zijn menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd van patiënt-specifieke somatische cellen, die modellen van genetische ziekte 2. Vele in vitro protocollen voor differentiatie van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen naar verschillende cellijnen, waaronder hart-lijnen 3, zijn gemeld. De gedifferentieerde cellen worden vaak fenotype door analyse van RNA en eiwit expressie, immunokleuring en / of in vitro functionele testen. Echter, pluripotente stamcellen derivaten in een embryonale juiste omgeving worden geplaatst om te testen of ze de cel volledig verwervenl lot van hun embryonale tegenhanger en of ze recapituleren de echte in vivo functie in reactie op de regionale cues. Terwijl de tissue engineering is veelbelovend, maar nog niet voorzien van alle bekende en onbekende signalen van de echte in vivo ontwikkeling van embryonaal weefsel 4,5.
Cel labeling met kleurstoffen of retrovirale vectoren in embryo, waaronder muizenembryo's hebben belangrijke informatie gebracht over de embryonale oorsprong van cellijnen gedurende cardiale ontwikkeling 6. Bijvoorbeeld, kleurstof injectie in de pericardiale ruimte van muizenembryo's ex vivo, gevolgd door in vitro kweek van geïsoleerde harten, gebruikt om epicardiale cellen en hun nakomelingen 7 etiketteren. Echter, kleurstof en retrovirale cel etikettering zijn meestal toegepast op vroege muizenembryo's met nog slecht ontwikkelde organen, of kip embryo's, die beter bereikbaar 8 zijn. Een uitzondering is de hersenen, die gemakkelijker te richten in embryos 9,10. Een dergelijke aanpak is nog niet toegepast op het kloppend embryonale muis hart.
Om direct merken vullen met kleurstoffen of virus en lineage tracing in verder gevorderd stadium muizenembryo's en volwassen muizen uit te voeren, heeft de cel etikettering aanpak gecombineerd met de analyse van transgene muizen met behulp van het Cre / Lox technologie. De Cre / Lox benadering 11 heeft echter een aantal beperkingen in verband met de spatiotemporal specificiteit van de genomische regulatoire gebieden die de expressie van het recombinase drijven, en de efficiëntie van het Cre / Lox recombinatie 12. Bovendien is deze aanpak niet volledig in op de specifieke vragen van de cel-migratie gedreven overname van cel lot als het slechts een voorloper kan labelen na activering van de regulerende gebied gebruikt om Cre expressie rijden. Het kan ook niet van toepassing op menselijke embryo's voor de hand liggende ethische kwesties.
Gezien deze beperkingen we een reeks nieuwe p ontworpenrotocols van verschillende cel merkmiddelen, zoals fluorescerende kleurstoffen, virus, genexpressie modulatoren zoals shRNAs en DNA-gebaseerde mobiele etikettering vectoren of cellen in het muizenembryo op E9.5 en latere ontwikkelingsstadia injecteren in gerichte gebieden van de hart.
Het DNA / cel injecties een stereomicroscoop en een eenvoudige micro-injectie toestel gecombineerd met ex vivo embryo cultuur tot 48 uur, of geïsoleerde hart of embryonale explantaatkweek voor 48-72 uur. We een ultrasoon gemedieerde micro-injectie protocol in muis embryonale harten in de baarmoeder ook verslag. Deze techniek maakt het toezicht op de ontwikkeling van embryo's 13 en zorgt voor lange termijn follow-up van de injectates en / of gelabelde cellen.
We vonden dat deze benaderingen behouden de functie van het orgaan en een meer representatieve omgeving dan in vitro testen stamcellen potentieel. Het biedt ook de mogelijkheid om migratie te volgengelabelde en / of geïnjecteerde cellen aan hun lot controleren. Uiteindelijk zou dit een beter begrip van regionale weefsel patronen en belangrijke biologische processen leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding
Animal procedures
Verkrijgen goedkeuring van een dier ethische commissie en volg institutionele richtlijnen voor het werk met het virus, huESC en / of IPSC (indien van toepassing), evenals muis hanteren, het verkrijgen van muizenembryo's, en het uitvoeren van de muis chirurgie. Voor getimede paringen, wordt de dag van de plug als embryonale dag (E) 0,5 / 0,5 dagen na de coïtus.
- Micro-injectie naalden:
Voor ex utero micro-injectie, trek glazen pipetten (1,2 mm buitendiameter borosilicaat capillaire buizen) met een pipet trekker / beveller een 1 of 10 micrometer interne tip diameter en een scherpe en conische tip shape om DNA of cellen te injecteren, respectievelijk te krijgen. Voor ultrasoon gemedieerde injecties, gebruik aangepaste steriele naalden, die een buitendiameter / binnendiameter (OD / ID) van 1,14 mm/0.53 mm, met een 50/35 um OD / ID tip hebben. - Silicon gevulde petrischaaltjes:
Bereid silicium als beschreven in de handleiding. Vulleneen mm diameter schoon glas 60 petrischaal met een elastomeerlaag van ~ 1 cm. Vermijd luchtbellen. - Instrumenten:
Houd alle chirurgische instrumenten steriel voorafgaand aan en tijdens de procedure. - DNA voorbereiding:
Voeg 3 pg DNA en 12 pi Opti-MEM in een buis. Voeg 3 ul Lipofectamine 2000 en 12 pl Opti-MEM in een andere buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en meng beide oplossingen. Onmiddellijk gebruiken. - Celpreparaat:
Maak een suspensie van 10 6 cellen / ml DMEM (Dulbecco's Eagle Medium, hoge glucose en 50% serum rat). 50 pl uiteindelijke celsuspensie voldoende voor 8-10 embryo. - Kleurstofpreparaat:
Gebruik de groene fluorescerende CDCFDA-SE met 25 mg / ml DMSO. Bereid 20 pi aliquots en bewaar bij -20 ° C. Verdun 1:100 / 1:200 in steriele zoutoplossing of PBS voor gebruik. - Viruspreparaat:
Gebruik een commerciële 3e generatie PGK-GFP-expressie lentivirus met een titer van ~ 10 9 -10 10 transducing eenheden / ml DMEM. Voor de bereiding van lentivirus, zie Tiscornia et al.. 14 Persoonlijke beschermingsmiddelen dragen en veilig te gebruiken en te vervreemden van het virus.
2. Verzameling van E9.5 en E10.5 embryo's voor Ex vivo injectie
- Euthanaseren een zwangere muis op embryonale dag 9.5 of 10.5.
- Steriliseer de borst en de buik van de muis met 70% ethanol.
- Voeg een ventrale middellijn incisie de buik geopend en de uterushoorn ophalen bij kamertemperatuur in PBS en overgebracht na twee wasbeurten PBS een siliconen gevulde petrischaal met M16 medium.
- Pin de baarmoeder hoorn met insecten kunnen de siliconenlaag zodat de gevasculariseerde zijde van de baarmoeder onderaan.
- Snijd het oppervlak van de baarmoeder met fijne pincet en een kap van de decidua 1 mm onder het oppervlak.
- Voorzichtig ophalen van de embryo in de dooierzak door het verspreiden van de wanden van de decidua.
- Bewaar de embryo's bij 37 °; C in M16 medium voor celinjectie. Voor injectie wordt elk embryo overgedragen aan de siliconen schaal gevuld met M16 medium voorverwarmd bij 37 ° C.
3. DNA of celinjectie Onder een Stereomicroscope
- Vul het glas pipet uit de rug met een Hamilton spuit en schud de pipet om luchtbellen te verwijderen aan het uiteinde.
- Zet de tube op de micro-injectie houder; stellen het bedrijf druk tot 50 (DNA) of 30 (cellen) hPa, en de inspuitdruk tot 150 (DNA) naar 300 (cellen) hPa. Stel de injectietijd 0,2 sec (DNA) of 0,5 sec (cellen). Deze instellingen kan enigszins variëren afhankelijk van het type microinjector en pipet.
- Speld het embryo naar de siliconen onderkant door de dooierzak zonder het embryo. Bekijk de regio van het hart en de zak open net boven deze regio.
- Voeg 4 pins rond het embryo tot een beweging tijdens cel injectie te voorkomen.
- Met behulp van de micromanipulator (ingesteld op handmatig), slowly-positie de pipetpunt onder een hoek van 45 ° boven het hartzakje, net boven het gebied van het hart dat wordt geïnjecteerd (figuur 1).
- Beweeg de pipet in het gebied van belang en leiden tot de injectie. Haal de pipet zo snel mogelijk. Zorg ervoor dat het hart goed kloppen na DNA / cel injectie.
4. Embryo, geïsoleerde hart, en explantaatkweek
- Cultuur de E9.5 embryo 25% M2 medium en 75% rattenserum, aangevuld met penicilline / streptomycine, voorverwarmd bij 37 ° C en zuurstof met 40% O2.
- Voeg 2 ml kweekmedium in een 25 ml glazen buis, voeg zachtjes het embryo, en zuurstofhoudende verbindingen met 40% O 2 voor vastschroeven van de dop op de tube. Incubeer tot 36 uur bij 37 ° C onder roteren of schudden (30 rotaties / min).
- Op het gewenste tijdstip (bijvoorbeeld 24 uur), ontleden de harten zorgvuldig met fijne tang, zonder het aanraken van de harten, door eerst decapitating de embryo; het hart is makkelijk te accijns door deze uit te trekken met behulp van de distale uitstroom-darmkanaal.
- Cultuur het geïsoleerde hart voor een ander 36-48 uur in DMEM met 50% FCS op een Matrigel-gecoate insert in een 12-well plaat. Zie Dyer & Patterson (2013) voor een verbeterde protocol van hart cultuur 15.
- Maak elke explant van de regio van belang. Als voorbeeld, ontleden de atrioventriculaire kanaal (AVC) en cultuur voor 48 uur op collageen type 1 gel 16.
5. Echogeleide Injectie in het Hart I n de baarmoeder
- Setup van ultrasound machine en microinjector:
- Gebruik de hoge-resolutie echografie systeem met een 40 MHz transducer en micro-injectie setup op een rail.
- Stel de injectie volume op de microinjector op 69 nl per injectie. Zie micro-injectie handleiding van de fabrikant voor het programmeren van de microinjector.
- Voorbereiding van de microinjection setup en injectie:
- Plaats een glas micropipet in de microinjector. Om efficiënte injectie eerste laag de binnenkant van de pipet met minerale olie door afzuigen tot het maximale volume. Dan verwijder je de olie weer, waardoor 1-2 mm van olie in de naald.
- Zuig het injectaat totdat maximale volume is bereikt. Wees voorzichtig en laat geen oppervlakken niet aanraakt met de naald als deze de tip zal bot en maak injectie moeilijker.
- De baarmoeder hoorn met de embryo tijdens de injectie te stabiliseren, gebruikt een gemodificeerd petrischaal met een gat in het midden (2,5 cm diameter), bedekt met een dunne silicone membraan met een kleine spleet gesneden in het midden, en plaats het boven de incisie . Stabiliseer de petrischaal op muiswerkzaamheden tabel door het plaatsen 3-4 klompen klei onder de randen van de schaal.
- Injectie procedure:
- Scheer de buik van een zwangere muis (op de gewenste embryonale stadium) voor anesthesia om haar te verwijderen. Behandel de buik met een chemische ontharing middel om de resterende haren te verwijderen en te steriliseren met 70% ethanol.
- Verdoven van een zwangere muis met zuurstof / isofluraan via een gezichtsmasker. Gebruik 3-5% isofluraan in 100% zuurstof initiële verdoving, gevolgd door 1-1,5% gedurende de rest van de procedure. Zorg ervoor dat de muis voldoende is verdoofd door zachtjes te knijpen haar poten en / of staart.
- Plaats de muis liggende op muiswerkzaamheden tabel (ingesteld verwarmen bij 37 ° C) en bedekken de ogen met smeermiddel om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
- Solliciteer elektrode gel op de elektroden en tape de poten aan de elektroden om de hartslag, ademfrequentie, en ECG-monitor. Plaats een rectale thermometer om de lichaamstemperatuur te controleren.
- Controleer eerst of de muis zwanger is van het visualiseren en het tellen van de embryo's door middel van ultrageluid is. Solliciteer ultrasound gel op de buik en de positie van de scan hoofd boven de blaas. Voor de consistentie, visualiseren de blaas eerste,en tel embryo in de linker en rechter baarmoederhoorns vanaf de positie van de blaas. Zorg ervoor dat embryonale harten normaal kloppen.
- Als de muis zwanger is, plaatst de petrischaal boven de toekomst incisie site met klei. Druk de schotel enigszins op de buik zodat de schotel in direct contact.
- Verwijder de schaal en steriliseer de buik weer. Wordt 1,5-2 cm ventrale middellijn incisie, ongeveer 0,75-1 cm boven de vagina, de buik en buikvlies openen. Voorkom schade aan inwendige organen.
- Exterioriseren links of rechts baarmoedertak met een pincet en trek het voorzichtig door het silicium membraan van de schotel, en het stabiliseren van de schotel op de klei weer. Voorkom uitgebreide trekken of manipulatie, aangezien dit bloeden van de baarmoeder schepen en vroegtijdige dood van de vrouwelijke en / of embryo's kunnen veroorzaken.
- Tel weer de embryo's om een adequate registratie van die embryo's werden ingespoten garanderen.
- Solliciteer ultrasound gel op de uTerine hoorns op de foto om het hart en om uitdroging te voorkomen.
- Afbeelding eerste embryo te injecteren. Controleer normale kloppen van het embryonale hart en een register bijhouden van de craniale-caudale en links-rechts oriëntatie van het embryo. Indien nodig, de positie van de baarmoeder hoorn licht om de juiste oriëntatie te garanderen. Als dit moeilijk is, ga dan naar de volgende embryo.
- Prik de baarmoeder voorzichtig met de micro-injectie naald om de naald te positioneren in een hoek van 45 ° boven het embryo, iets buiten het hartzakje (figuur 3). Voor de etikettering van epicardial cellen, beeld het hart in een vier-kamer uitzicht en de positie van de naald zodat het wijst naar de atrioventriculaire groef (figuur 3). Als de hoek moet worden aangepast, trek de naald, en herpositioneren. Stel de hoek niet aanpassen met de naald in de baarmoeder, aangezien dit de naald kan breken. Te beschadigen andere weefsels, zoals ledematen of placenta.
- Verplaats de naaldop de pericardiale muur en prik er met een zachte, maar snelle beweging. In het algemeen zal er enige weerstand, maar beweegt de naald te snel kan de naald naar het hart zelf te prikken. De tip moet eindigen in de pericardiale ruimte van de atrioventriculaire groef. Bij pericardiale bloeden, zal bloedcellen zichtbaar als een witte sneeuw-achtig patroon zijn. Als dit het geval stopt het injecteren van de embryo en gaan naar een andere embryo.
- Spuit de injectaat. Injecteren maximaal 700 nl in de pericardiale ruimte te nadelig effect hebben op hart ontwikkeling te voorkomen. Toezicht houden op de juiste injectie door kleine, tijdelijke zwelling van de hartzak.
- Na injectie, trek de naald eruit en bevestig dat injectaat nog kan worden uitgeworpen om ervoor te zorgen dat de naald niet is verstopt door weefsel fragmenten.
- Verplaats de behandeling tafel op de foto en injecteer de volgende embryo. Houd het aantal geïnjecteerde embryo maximaal 3-4 (in een uterushoorn) ter voorkominguitgebreid anesthesie, zodat de controle embryo's in de baarmoeder hoorn tegenover en dat de procedure embryonale ontwikkeling niet verstoord.
- Na de injectie het gewenste aantal embryo, overtollig echogel en plaats voorzichtig de baarmoeder hoorn terug in de buik op de juiste plaats.
- Sluit de moederlijke buik met behulp van een laag van hechtdraad voor het peritoneum en buikspieren, en een tweede laag van hechtdraad voor de huid.
- Injecteer de muis met de eerste dosis pijnmedicatie. Met een injectie van 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine 15 min voorafgaand aan het beëindigen van de anesthesie en drie extra injecties met 12 uur interval.
- Staak anesthesie en het toezicht op de muis voor adequaat herstel van de procedure. Huis zwangere muis in een individuele kooi de gewenste duur van de follow-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De injectie protocollen hierboven beschreven, kunnen cellen worden gemerkt en / of geïnjecteerd in de muis embryonale hart. Als proof of concept, zijn verschillende voorbeelden getoond waarin de injectieprotocol en ex vivo AVC explantaat, geïsoleerde hart of geheel embryokweek werden gecombineerd (Figuur 1).
Figuur 1 toont de bereiding van het embryo voor celinjectie. De E9.5 embryo wordt verwijderd uit zijn decidua met behoud van de integriteit van de dooierzak (Figuur 1A). De dooierzak is geopend net boven het hart (Figuur 1B). De pipet wordt benaderd (figuur 1C) en de cellen geïnjecteerd. Het hart behoudt zijn vorm (figuur 1D) en blijft kloppen.
Om een meer specifieke biologische vraag in ontwikkelingsbiologie zoals de epitheliale naar transitie (EMT) mesenchym aan te pakken, werd een E9.5 AVC explant ingespoten met een shRNA dat down-reguleert een proteïne noodzakelijk voor endotheel-mesenchymale overgang endocardiale cellen (Figuur 2A). De controle embryo werd geïnjecteerd met een lege vector backbone. Evenzo TINTEN cel afkomstige endotheel pre-valvulaire cellen die GFP onder de controle van de promotor Sox9 werden geïnjecteerd in de AVC op E10.5, gevolgd door 48 uur geëxplanteerd hart cultuur. Deze cellen verwerven merkers van EMT zoals periostin vergelijkbaar met het endogene endocardiale cellen (Figuren 2B en 2C).
Deze ex vivo technieken zijn relatief makkelijk, maar alleen op de korte-termijn follow-up (maximaal 48-72 uur). De echogeleide injectie procedure voorziet in een technisch uitdagende aanpak, maar met de mogelijkheid om op lange termijn, zelfs postnatale, in utero follow-up. De in utero injectie van kleurstof of virale vectoren aan cellen in specifieke cardiale gebieden label wordt getoond in figuren 3A-3 C. Met deze methode kunnen specifieke kenmerken van epicardiale cellen bereikt met fluorescente kleurstoffen (figuren 3D en 3E) of virus (Figuur 3F), en de methode kan worden opgevoerd met cellen of alternatieve injectates.
. Figuur 1 Cell injectie in het hart A:.. E9.5 embryo in de dooierzak B: visualisatie van het hart na het openen van de dooierzak net boven het hart. De inzet hieronder toont een vergroting van het hart en wijst de AV-kanaal C:. Aanpak van de pipet in de richting van de AVC D:. Geïnjecteerd embryo na 48 uur cultuur (H = hart).
. Figuur 2 Injectie van een shRNA in de AVC een E9.5 embryo dat ex vivo EMT endocardiale cellen in een hart explantaat voorkomt A:. Control vector backbone of shRNA werd samen geïnjecteerd met lipotectamine in de AVC een E9.5 muis embryo; 3 uur later, de AVC werd ontleed uit en geteeld op een collageen gel om EMT van endocardiale cellen activeren. De shRNA neergereguleerde een eiwit dat nodig is voor EMT BC:. TINTEN-cel afgeleide valvulaire cellen ontworpen om GFP expressie onder de controle van de promotor Sox9 werden geïnjecteerd in de AVC van E10.5 embryo. Het hart werd gekweekt gedurende 2 dagen (B), en vervolgens gefixeerd en gekleurd met een anti-periostin antilichaam (C). De inzet toont een vergroting van de regio AVC.
.. Figuur 3 in de baarmoeder injectie A: regeling die de experimentele opstelling. De zwangere muis is rugligging gepositioneerd en een petrischaal met siliconen membraan boven de incisie gestabiliseerd. . 1 = microinjector, 2 = transducer, 3 = petrischaal met siliconen membraan, 4 = ultrasound gel, 5 = muis met baarmoederhoorns (rood), 6 = Play-Doh klei, 7 = muiswerkzaamheden tabel B: stilstaand beeld van een echografie film (M-stand) die de positie van de naald en embryonale hart voorafgaand aan de injectie. Het vrouwtje ECG wordt getoond aan de onderkant (groen), en hart-en ademhalingsfrequentie in de rechter (geel). H = hart C:. Ultrasoon beeld die de positie van de naald en embryonale hart tijdens injectie. Inzet: de punt is gepasseerd het hartzakje, maar niet het myocard te raken, zodat het injecterenat kan worden geïnjecteerd in de pericardiale ruimte van de atrio-ventriculaire groef. Zwarte stippellijnen markeren de grenzen van het atrium (A) en ventrikel (V) D:. Ganse berg beeld van een E11.5 muis embryo vertoont een sterke fluorescentie van de kleurstof in de pericardiale ruimte E:. Representatief deel van een E11.5 embryonale muis hart en toont pericardiale en epicardial cel labeling met een fluorescerende kleurstof (CDCFDA-SE, groen) 4 uur na de injectie. Kernen zijn gelabeld met DAPI (blauw). LA = linkerboezem, LV = linker ventrikel, RA = rechter atrium, RV = rechterkamer F:. Representatief deel van een E14.5 embryonale muis hart en toont mozaïek epicardial cel labeling met GFP-expressie lentivirus 3 dagen na de injectie. Om GFP specificiteit te bevestigen, werd het GFP-eiwit ook gekleurd met een GFP antilichaam (rood). Kernen zijn gelabeld met DAPI (blauw).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intra-cardiale ex vivo injectie protocollen hierboven beschreven zijn ontworpen om hartfunctie gedurende minstens 48 uur in mid-stage (E9.5-E11.5) muizenembryo's te behouden. Deze injectie aanpak kan voor ruimtelijk gerichte injectie van DNA of cellen. De weinige voorbeelden in figuren 1-3 bieden proof of concept voor de afbakening ex vivo en in vivo moleculaire mechanismen van ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden in beperkte cardiale regio's, zoals EMT van endocard of epicardiale cellen. Belangrijker nog, deze protocollen bieden een kans om de migratie en het lot van de geïnjecteerde cellen zoals menselijke embryonale cellen of huESC derivaten op een juiste embryonale omgeving, een tot nu toe onvervulde uitdaging volgen. In vivo etikettering (zoals de epicardial cellen in figuur 3) met verzadigende of beperken van verdunningen van kleurstof of virus zorgt voor lineage tracing van cel (sub) populaties op korte als lange termijn basis, zonder dat Cre / lox techniek (hoewel deze technieken te combineren kan nuttig zijn ook).
Een aantal cruciale stappen terwijl de toepassing van deze protocollen werden waargenomen. Ten eerste, de embryo's zeer gevoelig voor licht. Het wordt daarom aanbevolen om de injectie protocol oefenen onder een stereomicroscoop, zodat de procedure met een hoge reproduceerbaarheid en efficiëntie binnen 15 min per embryo kan worden uitgevoerd. In dezelfde lijn, moet het hele ultrasoon gemedieerde injectie procedure binnen 30 minuten worden uitgevoerd om een goede levensvatbaarheid van embryo's te bewaren en om hun ontwikkeling in de baarmoeder niet in gevaar brengen. Manipulatie van de baarmoeder tot een minimum worden beperkt. Bovendien moet worden opgemerkt dat een operatie aan zwangere muizen neiging te leiden tot vroegtijdige bevalling (1-2 dagen eerder dan normaal). Toch moet pasgeborenen algemeen gezond en normaal te ontwikkelen. Verder is de penetratie van de pipet door de baarmoederwand, de dooierzak en embryoaan het hartzakje te bereiken en tot slot het myocard is een delicate procedure (stap 5.3.13). Deze stap moet zorgvuldig en voorzichtig gebeuren. Voor optimalisatie, is het raadzaam om een aantal korte-termijn kleurstof injecties uit te voeren om de reproduceerbaarheid te bepalen en uit te sluiten injectie in niet-gerichte gebieden. Tenslotte hebben wij gevonden ontwikkelingsstoornissen hartafwijkingen over de injectieprocedures voor de voorbeelden hierboven gegeven. Echter, een meer gedetailleerde, stap-voor-stap, morfologische en functionele analyse moet worden uitgevoerd om na te gaan volkomen normale ontwikkeling en functie tijdens de fasen van belang.
De beperkingen van deze technologieën zijn meerdere. (I) de injectie onder de stereomicroscoop wordt beperkt door het licht en temperatuurgevoeligheid van de muizenembryo's. Dit kan worden ondervangen door de praktijk van de micro-injectie procedure om zo snel mogelijk te zijn, regelmatig vervangen of opwarmen het medium, en werken in een donkere kamer. (Ii) De ex vivo cultuur van embryo's of explantaten is beperkt in de tijd, in tegenstelling tot de in de baarmoeder echogeleide injectie, die het mogelijk maakt voor de lange-termijn follow-up. Vital kleurstoffen meestal cellen bijna onmiddellijk labelen en zichtbaar tot drie tot vier dagen na injectie blijven. Echter, de intensiteit van de kleurstof worden verdund door opeenvolgende celdelingen. Het labelen van cellen met lentivirus kan dit probleem te verhelpen. Echter, de opname van het virus duurt enkele uren en expressie is optimaal na 24-48 uur, die op korte termijn analyse voorkomt. (Iii) De ultrasoon gemedieerde injectie wordt beperkt door de kosten van de apparatuur. De resolutie van het 40 MHz transducer is voldoende voor midden-en late-stadium embryo's, maar meer beperkend voor fasen voorafgaand aan E11.5.
Samenvattend stellen wij voor dat de cardiale injectie protocollen hierboven beschreven moeten worden gebruikt in het midden-stadium muizenembryo's. De ex vivo techniek is compatibel met de cultuur van embryo's, geïsoleerde harten, of explants. De in vivo procedure zorgt voor lange-termijn follow-up, met inbegrip van post-natale ontwikkeling. Deze technieken zullen aanzienlijk helpen bij het testen van de differentiatie potentieel van menselijke stamcellen derivaten in een geschikte omgeving, evenals van enkele specifieke vragen ontwikkelingsbiologie zoals celmigratie en regionale signalen, die belangrijke gebeurtenissen in de weg zijn naar vormen een functionele hart . Bovendien, onze methoden en die van anderen 10 kunnen de toekomst worden gebruikt voor onderzoek naar andere organen dan het hart, afhankelijk van het beschikbare ex vivo kweken protocollen en / of ontwikkelingsstadium in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de Foundation Leducq (mitralisklep) en het Agence Nationale pour la Recherche (ANR verlenen Specistem) voor de financiering van dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
