Summary
Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.
Abstract
Testen das Schicksal der embryonalen oder pluripotenten Stammzellen-Derivate in in-vitro-Protokolle hat zu kontroversen Ergebnissen, die nicht ihre in vivo Potential nicht unbedingt geführt. Vorzugsweise sollten diese Zellen in einer geeigneten Umgebung embryonalen um ihre definitive Phänotyp erwerben platziert werden. Zudem hat Zelllinie Tracing Studien in der Maus nach der Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren meist auf frühzeitig Maus-Embryonen mit noch schwach entwickelten Organe geblieben. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir Standard-und Ultraschall-vermittelten Mikroinjektion Protokolle verschiedener Mittel in den Zielregionen des Herzens in Maus-Embryonen an E9.5 und späteren Entwicklungsstadien zu injizieren. Embryonale Explantat oder Embryonen werden dann kultiviert oder links, um in utero weiter zu entwickeln. Diese Mittel umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Virus, shRNA oder Stammzellen abgeleiteten Vorläuferzellen. Unsere Ansätze ermöglichen die Erhaltung der funktion der Orgel während der Überwachung der Migration und das Schicksal von markierten und / oder injizierten Zellen. Diese Technologien können auf andere Organe ausgedehnt werden und wird sehr hilfreich sein, wichtige biologische Fragestellungen in der Biologie der Entwicklung zu befassen.
Introduction
Vor mehr als einem Jahrzehnt haben menschliche embryonale Stammzellen (HuESCs) aus menschlichen Blastozysten 1 abgeleitet. Seitdem haben sich diese Zellen zum Gegenstand einer wichtigen Forschungsgebiet, das unerfüllte Fragen in der menschlichen Entwicklungsbiologie befasst. HuESCs haben ferner vorgesehen Hoffnungen in der regenerativen Medizin. In den letzten Jahren wurden menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) aus patientenspezifische Körperzellen erzeugt worden ist, die Bereitstellung von Modellen Erbkrankheit 2. Viele Protokolle für die In-vitro-Differenzierung von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen zu verschiedenen Zelllinien, einschließlich Herz-Abstammungslinien 3, wurden berichtet. Die differenzierten Zellen werden oft durch Analyse von RNA und Protein-Expression, Immunfärbung und / oder in-vitro-Funktionstests phänotypisiert. Allerdings haben pluripotente Stammzelle Derivate in einem richtigen embryonalen Umgebung, um zu testen, ob sie die cel vollständig erwerben platziert werdenl Schicksal ihrer embryonalen Gegenstück, und ob sie den echten in vivo Funktion als Reaktion auf regionale Hinweise zu rekapitulieren. Während Tissue Engineering ist vielversprechend, ist es noch nicht bieten alle bekannten und unbekannten Signale der richtigen In-vivo-Entwicklung embryonalem Gewebe 4,5.
Markierung von Zellen mit Farbstoffen oder retroviralen Vektoren in Embryos, einschließlich Maus-Embryonen wurden wichtige Informationen über die Herkunft der embryonalen Zelllinien während der Herzentwicklung 6 gebracht. Beispielsweise Farbstoffinjektion in die Perikardhöhle von Maus-Embryonen ex vivo, gefolgt von in vitro-Kultur von isolierten Herzen, wurde zur epikardialen Zellen und deren Nachkommen 7 beschriftet. Allerdings Farbstoff und retroviralen Zell Kennzeichnung wurden meist auf frühe Mausembryonen mit noch schwach entwickelten Organen oder Hühnerembryonen, die leichter zugänglich sind 8 angewendet. Eine Ausnahme ist das Gehirn, die einfacher in E zum Ziel istmbryos 9,10. Ein solcher Ansatz ist noch nicht zu der embryonalen Mäuseherzen schlagen angewendet.
Um mit Farbstoffen oder Virus ergänzen direkte Markierung und Linienverfolgung in weiter fortgeschrittenen Stadium Maus-Embryonen und erwachsenen Mäusen durchzuführen, hat sich die Zellmarkierung Ansatz mit der Analyse von transgenen Mäusen mit Hilfe des Cre / lox-Technologie kombiniert. Das Cre / Lox-Ansatz jedoch 11 verfügt über einige Einschränkungen aufgrund der räumlich-zeitlichen Spezifität der genomischen regulatorischen Regionen verwendet, um die Expression der Rekombinase zu fahren, und die Effizienz des Cre / Lox Rekombination 12. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht vollständig die spezifischen Fragen der Zellmigration gesteuert erfasst Zellschicksal ehen, da es nur eine Vorstufe zu kennzeichnen nach der Aktivierung der regulatorischen Region zur Cre-Expression zu fahren. Es kann auch nicht an menschlichen Embryonen zu offensichtlichen ethischen Probleme gelten.
Angesichts dieser Einschränkungen, haben wir eine Reihe von neuen protocols, um eine Vielzahl von Zellmarkierungsmittel, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Viren, Modulatoren der Genexpression wie shRNA und DNA-basierte Zellmarkierung Vektoren oder Zellen der Maus Embryo E9.5 und späteren Stadien der Entwicklung in den Zielregionen der injizieren Herz.
Die DNA / Zellinjektionen mit einem Stereomikroskop und eine einfache Mikroinjektionsvorrichtung kombiniert mit ex vivo Embryokultur bis zu 48 h, oder isolierte Herz-oder embryonale Explantatkultur für 48-72 Std. Wir haben auch ein Ultraschall-vermittelte Mikroinjektion Protokoll in embryonalen Maus-Herzen in utero zu melden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Entwicklung von Embryonen 13 und ermöglicht Langzeit-Follow-up der Injektate und / oder markierten Zellen.
Wir fanden, dass diese Ansätze die Erhaltung der Funktion des Organs und liefern eine repräsentative Umgebung als in-vitro-Tests der Stammzellpotential. Es bietet auch die Möglichkeit, Migration folgenvon markierten und / oder injizierten Zellen, ihr Schicksal zu überwachen. Letztendlich sollten diese ein besseres Verständnis der regionalen Gewebemusterbildung und biologische Schlüsselprozesse ergeben.
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Protocol
1. Vorbereitung
Tierverfahren
Holen Sie die Genehmigung aus einem Tierethikkommission und folgen den Richtlinien des Instituts für die Arbeit mit dem Virus, HuESC und / oder iPSC (wenn zutreffend), sowie Maus Handhabung, den Erhalt Maus-Embryonen und die Durchführung Maus Chirurgie. Für den Zeit Paarungen, wird der Tag des Steckers als embryonalen Tag (E) 0,5 / 0,5 Tage post-coitum.
- Mikroinjektion Nadeln:
Für ex utero Mikroinjektion, mit einer Pipette Puller / Schweißkantenformer, um eine 1 oder 10 um interne Spitzendurchmesser und eine scharfe und Kegelspitzenform, DNA oder Zellen injizieren bzw. bekommen ziehen Glaspipetten (1,2 mm Außendurchmesser Borosilikat-Kapillaren). Für Ultraschall-vermittelte Injektionen, Nutzung angepasst sterile Nadeln, die eine Außen / Innendurchmesser (OD / ID) von 1,14 mm/0.53 mm, mit einer 50/35 um OD / ID-Spitze haben. - Silicon-gefüllten Petrischalen:
Bereiten Silizium, wie in der Anleitung beschrieben. Füllenein sauberes Glas 60 mm Durchmesser Petrischale mit einer Elastomerschicht von ca. 1 cm. Luftblasen vermeiden. - Instrumente:
Halten Sie alle chirurgischen Instrumente steril vor und während des Verfahrens. - DNA-Präparation:
In 3 ug DNA und 12 ul Opti-MEM in einem Rohr. In 3 ul Lipofectamine 2000 und 12 ul Opti-MEM in einem anderen Rohr. Inkubation für 5 min bei RT und beide Lösungen. Verwenden Sie sofort. - Zellpräparation:
Eine Suspension von 10 6 Zellen / ml DMEM (Dulbecco-Eagle Medium, High Glucose und 50% Rattenserum). 50 ul Zellsuspension ist genug für 8-10 Embryonen. - Dye Zubereitung:
Verwenden Sie das grün fluoreszierende CDCFDA-SE bei 25 mg / ml DMSO. Es werden 20 ul Aliquots und bei -20 ° C Verdünnt 1:100 / 1:200 in steriler Kochsalzlösung oder PBS vor dem Gebrauch. - Virus Zubereitung:
Einen kommerziellen 3. Generation PGK-GFP-exprimierenden Lentiviren mit einem Titer von ~ 10 9 -10 10 transducing Einheiten / ml DMEM. Für die Herstellung von Lentiviren finden Tiscornia et al. 14. Persönliche Schutzausrüstung tragen und sicher zu verwenden und zu entsorgen Virus.
2. Sammlung von E9.5 und E10.5 Embryonen für Ex-vivo-Injection
- Euthanize eine schwangere Maus an embryonalen Tag 9,5 bzw. 10,5.
- Sterilisieren der Brust und Bauch der Maus mit 70% Ethanol.
- Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt, um den Bauch zu öffnen und rufen Sie die Uterushorn bei RT in PBS und übertragen sie nach zwei Waschungen mit PBS auf eine silikongefüllte Petrischale mit M16-Medium.
- Pin das Uterushorn mit Insektenstifte auf die Silikonschicht, so dass die vaskularisierte Seite des Uterus ist an der Unterseite.
- Schneiden Sie die Oberfläche des Uterus mit einer feinen Pinzette, und eine Kappe der Decidua bei 1 mm unter der Oberfläche.
- Abrufen vorsichtig das Embryo im Dottersack von Ausbreiten die Wände der Decidua.
- Bewahren Sie die Embryonen bei 37 °, C in M16 Medium vor der Zellinjektion. Für die Injektion wird jedem Embryo auf der Siliconschale mit M16-Medium gefüllt, auf 37 ° C vorgewärmt über
3. DNA oder Zellinjektion unter einem Stereomikroskop
- Füllen Sie die Glaspipette von der Rückseite mit einer Hamilton-Spritze und schütteln Sie die Pipette, um Blasen an der Spitze zu entfernen.
- Stellen Sie die Pipette auf die Mikroinjektion Halter; stellen Sie den Haltedruck bis 50 (DNA) oder 30 (Zellen) hPa, und der Einspritzdruck auf 150 (DNA) bis 300 (Zellen) hPa. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,2 sec (DNA) oder 0.5 (Zellen). Diese Einstellungen kann sich je nach Art der Mikroinjektor und Pipetten variieren.
- Pin der Embryo auf die Silikon unten durch den Dottersack, ohne den Embryo richtig. Beobachten Sie die Region des Herzens, und öffnen Sie den Sack gerade über diese Region.
- In 4 Pins um den Embryo, jede Bewegung während der Zellinjektion zu verhindern.
- Mit dem Mikromanipulator (auf manuell eingestellt), slowly-Position der Pipettenspitze in einem Winkel von 45 ° über dem Herzbeutel, nur über dem Bereich des Herzens, die injiziert werden soll (Fig. 1).
- Bewegen der Pipette in der Region von Interesse und die Injektion auslösen. Nehmen Sie die Pipette so schnell wie möglich. Stellen Sie sicher, das Herz richtig nach DNA / Zellinjektion zu schlagen.
4. Embryo, Isoliert Herz und Explantation Kultur
- Kultur die E9.5-Embryonen in 25% M2 Medium und 75% Rattenserum, Penicillin / Streptomycin, bei 37 ° C vorgewärmt und mit 40% O 2 sauerstoffhaltigen ergänzt.
- 2 ml Kulturmedium in einem 25 ml Glasrohr, sanft fügen Sie den Embryo, und sauerstoff mit 40% O 2 vor dem Aufschrauben der Kappe auf dem Rohr. Inkubieren bis zu 36 Stunden bei 37 ° C unter Rotieren oder Schütteln (30 U / min).
- Bei der gewünschten Zeitpunkt (zB 24 Std.), sezieren die Herzen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, ohne sie zu berühren die Herzen, indem Sie zuerst decapitating die Embryonen; das Herz ist einfach zu Verbrauch durch Herausziehen mit der distalen Ausflusstrakt.
- Kultur der isolierten Herzen für einen anderen 36-48 h in DMEM mit 50% FCS auf einer Matrigel-beschichteten Einsatz in einer 12-Well-Platte gesetzt. Siehe Dyer & Patterson (2013) für ein verbessertes Protokoll von Herz Kultur 15.
- Machen Sie keine Explantation der Region von Interesse. Als ein Beispiel, sezieren die atrioventrikuläre Kanal (AVC) und Kultur, die sie für 48 Stunden auf Kollagen Typ-1-Gel-16.
5. Ultraschall-gesteuerte Injektion in der Herz-I n utero
- Aufbau der Ultraschallgerät und Mikroinjektor:
- Verwenden Sie die hochauflösenden Ultraschallsystem mit einem 40-MHz-Wandler und die Mikroinjektion Setup auf einer Schiene.
- Stellen Sie das Injektionsvolumen auf der Mikroinjektor bei 69 nl pro Injektion. Siehe Mikroinjektion im Handbuch des Herstellers für die Programmierung der Mikroinjektor.
- Herstellung des microinjection Einrichtung und Injektion:
- Stellen Sie ein Glas in der Mikropipette Mikroinjektor. Um eine effiziente Injektion erste Schicht durch Ansaugen bis zum Maximalvolumen gewährleisten die Innenseite der Pipette mit Mineralöl. Dann wieder auswerfen das Öl, so dass 1-2 mm von Öl in der Nadel.
- Saugen Sie den Injektions, bis die maximale Lautstärke erreicht ist. Achten Sie darauf, dass die Oberflächen mit der Nadelspitze zu berühren, da dies die Spitze stumpf und machen Injektion schwieriger.
- Zur Stabilisierung des Uterushorns, die die Embryonen während der Injektion mit einem modifizierten Petri-Schale mit einem Loch in der Mitte (2,5 cm Durchmesser), die durch eine dünne Silikonmembran mit einem kleinen Spalt in der Mitte geschnitten bedeckt, und positionieren sie über der Inzisionsstelle . Stabilisierung der Petrischale auf der Maus Handhabungstabelle durch Positionieren 3-4 Klumpen von Ton unter den Rändern der Schale.
- Injektionsverfahren:
- Rasieren Sie den Bauch einer schwangeren Maus (an der gewünschten embryonalen Stadium) vor anesthesia um Haare zu entfernen. Behandeln Sie den Bauch mit einem chemischen Haarentfernungsmittel, um restliche Haare zu entfernen und zu sterilisieren mit 70% Ethanol.
- Anesthetize eine schwangere Maus mit Sauerstoff / Isofluran über eine Gesichtsmaske. Verwenden 3-5% Isofluran in 100% Sauerstoff für die anfängliche Anästhesie, während der Rest des Verfahrens, gefolgt von 1-1,5%. Stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend sanft kneifen die Pfoten und / oder Schwanz betäubt.
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Maus Handhabung Tabelle (eingestellt auf 37 ° C erwärmen) und decken die Augen mit Schmierstoff zu Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
- Bewerben Elektroden-Gel auf den Elektroden und kleben Sie die Pfoten an den Elektroden, die Herzfrequenz, Atemfrequenz und EKG-Monitor. Positionieren Sie eine rektale Thermometer auf Körpertemperatur zu überwachen.
- Überprüfen Sie zunächst, dass die Maus schwanger durch die Visualisierung und das Zählen der Embryonen durch Ultraschall ist. Bewerben Ultraschall-Gel auf den Bauch und positionieren Sie den Scankopf über der Blase. Für Konsistenz, visualisieren die erste Blase,und zählen Embryonen in der linken und rechten Uterushörner, ausgehend von der Position der Blase. Stellen Sie sicher, dass embryonale Herzen sind normalerweise schlagen.
- Wenn die Maus schwanger ist, positionieren Sie den Petrischale über der Zukunft Einschnittstelle mit Ton. Drücken Sie die Schale leicht auf den Bauch, so dass das Gericht ist in direktem Kontakt.
- Entfernen Sie die Schale und den Bauch wieder zu sterilisieren. Machen Sie eine 1,5-2 cm ventralen Mittellinie Schnitt von etwa 0,75 bis 1 cm über der Vagina, um den Bauch und Bauchfell zu öffnen. Verletzung innerer Organe zu vermeiden.
- Exteriorisieren den linken oder rechten Uterushorn mit einer Pinzette, ziehen sanft es durch die Silizium-Membran der Schale, und stabilisieren das Gericht auf der Ton wieder. Verhindern umfangreichen Ziehen oder Manipulation, da dies Blutungen Uteringefäße und vorzeitigen Tod des weiblichen und / oder Embryonen führen.
- Zählen Sie die Embryonen wieder angemessene Aufzeichnungen, von denen Embryonen injiziert zu gewährleisten.
- Bewerben Ultraschall-Gel auf der uterine Hörner auf Bild, um das Herz und die Austrocknung zu verhindern.
- Bild die erste Embryo injiziert werden. Überprüfen normalen Schlagen des embryonalen Herzens und Aufzeichnungen der Schädel-Schwanz-und Links-Rechts-Orientierung des Embryos. Falls erforderlich, die Position des Uterushorn leicht auf die richtige Ausrichtung zu gewährleisten. Wenn dies erweist sich als schwierig, fahren Sie mit der nächsten Embryo.
- Punktion des Uterus sorgfältig mit dem Mikroinjektionsnadel, die Nadel in einem Winkel von 45 ° über dem Embryo zu positionieren, leicht außerhalb des Herzbeutels (3). Für die Kennzeichnung von epikardialen Zellen, Bild das Herz im Vierkammerblick und die Position der Nadel, so dass es auf die atrioventrikuläre Nut (Abbildung 3) zeigt. Wenn der Winkel eingestellt werden muss, ziehen Sie die Nadel und neu zu positionieren. Sie den Winkel mit der Nadel in die Gebärmutter nicht einstellen, da sich hierdurch die Nadel brechen. Vermeiden Stechen anderen Geweben, wie Gliedmaßen oder Plazenta.
- Bewegen Sie die Nadelauf den Herzwand und durchstechen Sie es mit einem sanften, aber schnellen Bewegung. In der Regel wird es einigen Widerstand, aber bewegt die Nadel zu schnell kann sich der Nadelspitze, um das Herz selbst punktieren. Die Spitze sollte in die Perikardhöhle der atrioventrikulären Furche beenden. Im Fall von perikardialen Blutungen, Blutzellen wird als weißer schneeartige Muster sichtbar. Wenn dies der Fall ist, beenden Sie das Einspritzen des Embryos und nun zu einem anderen Embryo.
- Injizieren Sie die Injektions. Spritzen Sie maximal 700 nl in den Herzraum, um nachteilige Auswirkungen auf die Herzen Entwicklung zu verhindern. Überwachen Sie den richtigen Einspritz durch leichte zeitliche Schwellung der Herzbeutel.
- Nach der Injektion, ziehen Sie die Nadel heraus und bestätigen, dass Injektions noch ausgeworfen wird, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht durch Gewebefragmente verstopft sein.
- Positionieren Sie den Umgang Tabelle für Bild und injizieren das nächste Embryo. Halten Sie die Anzahl der injizierten Embryonen auf maximal 3-4 (in einem Gebärmutterhorn) zu verhindernAnästhesie verlängert, um die Kontrolle Embryonen in der gegenüberliegenden Uterushorn zu ermöglichen und um sicherzustellen, dass das Verfahren nicht stören Embryonalentwicklung.
- Nach der Injektion die gewünschte Anzahl der Embryonen, überschüssige Ultraschall-Gel und sanft legen Sie das Uterushorn zurück in den Unterleib in die richtige Position.
- Schließen des mütterlichen Bauch unter Verwendung einer Schicht des Fadens für das Bauchfell-und Bauchmuskulatur, und eine zweite Schicht des Fadens für die Haut.
- Spritzen Sie die Maus mit der ersten Dosis von Schmerzmitteln. Verwenden Sie eine Injektion von 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin 15 min vor Ende der Anästhesie und drei weitere Injektionen mit 12-Stunden-Intervallen.
- Brechen Anästhesie und überwachen die Maus für ausreichende Erholung von dem Eingriff. Haus die schwangere Maus im Einzelkäfig für die gewünschte Dauer des Follow-up.
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Representative Results
Unter Verwendung der oben beschriebenen Injektionsprotokolle können Zellen markiert und / oder in die embryonalen Maus-Herz injiziert werden. Als Proof of Concept, werden mehrere Beispiele gezeigt, in dem die Injektionsprotokoll und die Ex-vivo-AVC Explantation, isoliert Herz, oder ganze Embryokultur wurden kombiniert (Abbildung 1).
Figur 1 zeigt die Herstellung des Embryos vor der Zellinjektion. Die E9.5 Embryo aus seiner Dezidua entfernt, während die Integrität des Dottersacks (Fig. 1A). Der Dottersack befindet sich direkt über dem Herzen (1B) eröffnet. Die Pipette angefahren (Fig. 1C), und die Zellen injiziert. Das Herz behält seine Form (1D) und bleibt schlagen.
Um eine spezifische biologische Frage in der Entwicklungsbiologie, wie die Epithelzellen des Übergangs (EMT) Mesenchym adressieren, wurde ein E9.5 AVC Explantat mit einer SH spritztRNA, die herunterreguliert ein Protein für Endothelzellen-mesenchymale Transition von endokardialen Zellen (Fig. 2A) erforderlich. Das Steuer Embryo wurde mit einer leeren Rückgrat Vektor injiziert. Ebenso wurden Farbtönen Zellen abgeleiteten endothelialen Vor-Klappen Zellen, die GFP unter der Kontrolle des Promotors in der Sox9 AVC an E10.5 injiziert, gefolgt von 48 h explantierten Herzen Kultur. Diese Zellen erwerben Marker der EMT wie Periostin ähnlich den endogenen endokardialen Zellen (Fig. 2B und 2C).
Diese Ex-vivo-Ansätze sind relativ einfach, aber die kurzfristigen Follow-up (maximal 48-72 h) begrenzt. Die Ultraschall-gesteuerte Injektionsverfahren bietet ein technisch anspruchsvoller Ansatz, aber mit der Möglichkeit, langfristige, auch nach der Geburt, in utero Follow-up. Die in utero Injektion von Farbstoff oder viralen Vektoren an spezifische Zellen in Herzbereiche zu kennzeichnen, ist in den 3A-3 gezeigt C. Mit diesem Verfahren können spezifische Markierung von epikardialen Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen (Fig. 3D und 3E) oder Virus (Abbildung 3F) erreicht werden, und das Verfahren kann auf die mit Zellen oder alternative Injektate erweitert werden.
. 1 Zellinjektion in das Herz A:.. E9.5 Embryo im Dottersack B: Visualisierung des Herzens nach dem Öffnen der Dottersack unmittelbar über dem Herzen. Die folgende Einschub zeigt eine Vergrößerung des Herzens und weist den AV-Kanal C:. Ansatz der Pipette auf die AVC D:. Embryo nach 48 Stunden Kultur (H = Herz) injiziert.
. Abbildung 2 Injektion eines shRNA in der AVC eines E9.5 Embryo, der Ex-vivo-EMT endokardialer Zellen in einem Herz Explantation verhindert, dass A:. Kontrolle Backbone-Vektor oder ein shRNA wurde zusammen mit lipotectamine in der AVC eines E9.5 eingespritzt Maus-Embryo; 3 Stunden später wurde das AVC geführt, um EMT der endokardialen Zellen auslösen präpariert und auf einem Kollagengel gezüchtet. Die shRNA herunterreguliert ein Protein, das für EMT BC erforderlich ist:. Farbtöne Zellen abgeleiteten Zellen Klappen entworfen um GFP unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Sox9 wurden in der AVC von E10.5 Embryonen injiziert. Das Herz wurde kultiviert für 2 Tage (B) und anschließend fixiert und mit einem Anti-Antikörper Periostin (C) gefärbt. Der Einschub zeigt eine Vergrößerung der Region AVC.
.. Abbildung 3 In utero Injektion A: Schema der Darstellung der Versuchsanordnung. Die schwangere Maus in Rückenlage positioniert und eine Petrischale mit Silikonmembran über der Einschnittstelle stabilisiert. . 1 = Mikroinjektor, 2 = Wandler, 3 = Petrischale mit Silikonmembran, 4 = Ultraschall-Gel, 5 = Maus mit Uterushörner (rot), 6 = Play-Doh Ton, 7 = Maus Handhabung Tabelle B: Standbild eines Ultraschall-Film (M-Modus), die die Position der Nadel und embryonalen Herzens vor der Injektion. Die weibliche EKG am Boden (grün), Herz-und Atemfrequenz in der unteren rechten (gelb) gezeigt. H = Herz C:. Ultraschallbild, das die Position der Nadel und embryonalen Herzens während der Injektion. Einschub: die Spitze hat den Herzbeutel vergangen, aber das Myokard nicht berührt, so dass die Einspritzaß in den perikardialen Raum des atrioventrikulären Nut eingespritzt werden. Schwarz gepunkteten Linien markieren die Grenzen der Vorhof (A) und Ventrikel (V) D:. Whole mount Bild eines E11.5 Maus-Embryonen, die starke Fluoreszenz des Farbstoffs in die Perikardhöhle E:. Repräsentativen Abschnitt eines E11.5 embryonalen Maus Herzens, Herzbeutel und epikardialen Zellmarkierung mit einem fluoreszierenden Farbstoff (CDCFDA-SE, grün) 4 h nach der Injektion. Die Zellkerne sind mit DAPI (blau) markiert. LA = linker Vorhof, LV = linker Ventrikel, RA = rechter Vorhof, RV = rechter Ventrikel F:. Vertreter Schnitt eines E14.5 embryonale Maus-Herzen, die Mosaik epikardialen Zellmarkierung mit GFP-exprimierenden Lentiviren 3 Tage nach der Injektion. GFP Spezifität zu bestätigen, wurde das GFP-Protein auch mit einem GFP-Antikörper (rot) gefärbt. Die Zellkerne sind mit DAPI (blau) markiert.
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Discussion
Die oben beschriebenen intrakardialen Injektion ex vivo-Protokolle sind für die myokardiale Funktion für mindestens 48 h im mittleren Stadium (E9.5-E11.5) Maus-Embryonen erhalten. Diese Injektions Ansätze ermöglichen räumlich gezielte Injektion von DNA oder Zellen. Die wenigen Beispiele in den Figuren 1-3 gezeigt nachweisen Konzept für die Abgrenzung ex vivo und in vivo molekularen Mechanismen der Entwicklungsprozesse, die in eingeschränkter Herz Regionen, wie EMT der endokardialen oder epikardialen Zellen stattfinden. Am wichtigsten ist, bieten diese Protokolle die Möglichkeit, Migration und das Schicksal der injizierten Zellen, wie menschlichen embryonalen Zellen oder huESC Derivate in einem geeigneten embryonale Umgebung eine bisher unerfüllte Aufgabe folgen. In vivo-Markierung (wie die epikardiale Zellen in Fig. 3) mit sättigenden oder Begrenzung Verdünnungen von Farbstoff oder Virus die Linie Verfolgung von Zelle (Unter-) Bevölkerung kurz-als auch langfristige bASIS, ohne die Notwendigkeit für Cre / lox-Technologie (obwohl die Kombination dieser Techniken können ebenso nützlich sein).
Mehrere wichtige Schritte während der Anwendung dieser Protokolle wurden beobachtet. Zuerst werden die Embryonen sind sehr lichtempfindlich. Es wird daher empfohlen, das Injektionsprotokoll unter einem Stereomikroskop üben so dass das Verfahren mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz innerhalb von 15 min pro Embryo durchgeführt werden. In der gleichen Zeile, sollte die gesamte Ultraschall-vermittelte Injektionsverfahren innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden, um eine gute Lebensfähigkeit von Embryonen zu erhalten und ihre Entwicklung in der Gebärmutter nicht zu gefährden. Manipulation des Uterus auf einem Minimum gehalten werden. Zusätzlich ist zu beachten, dass die Operation auf schwangeren Mäusen dazu neigt, in einer Frühgeburt führen (1-2 Tage früher als normal) ist. Jedoch sollten Neugeborene in der Regel gesund und normal entwickeln. Ferner ist die Penetration der Pipette durch die Gebärmutterwand, Dottersack und der Embryoum den Herzbeutel zu erreichen und schließlich die Herzmuskel ist eine heikle Prozedur (Schritt 5.3.13). Dieser Schritt sollte sorgfältig und vorsichtig erfolgen. Für die Optimierung ist es empfehlenswert, mehrere kurzfristige Farbstoff Injektionen durchführen, um die Reproduzierbarkeit zu bestimmen und auszuschließen Injektion in Nicht-Zielgebieten. Schließlich haben wir keine Entwicklungsherzfehlern zu den Einspritzverfahren für den oben angegebenen Beispielen gefunden. Doch eine genauere, Schritt-für-Bühne, morphologische und funktionelle Analyse durchgeführt werden sollte, um eine normale Entwicklung und Funktion vollständig zu ermitteln während der Phasen von Interesse.
Die Grenzen dieser Technologien sind mehrere. (I) Die Injektion unter dem Stereomikroskop wird durch die Licht-und Temperaturempfindlichkeit der Maus-Embryonen beschränkt. Dies kann durch die Anwendung der Mikroinjektionsverfahrens, um so schnell wie möglich beseitigt werden, regelmäßig zu ersetzen oder Erwärmung des Mediums und die in einem dunklen Raum. (Ii) Die Ex-vivo Kultur der Embryonen oder Explantate ist zeitlich begrenzt, im Gegensatz zu der in utero Ultraschall-gesteuerte Einspritzung, die für Langzeit-Follow-up ermöglicht. Vitalfarbstoffe neigen Zellen fast sofort beschriften und bis zu drei bis vier Tage nach der Injektion sichtbar bleiben. Jedoch wird die Intensität des Farbstoffs durch aufeinanderfolgende Zellteilungen verdünnt werden. Markierung von Zellen mit Lentiviren kann dieses Problem zu überwinden. , Aufnahme des Virus dauert jedoch mehrere Stunden und Ausdruck ist optimal nach 24-48 Stunden, die kurzfristige Analyse verhindert. (Iii) Die Ultraschall-vermittelten Injektion wird durch die Kosten der Ausrüstung beschränkt ist. Die Auflösung des 40-MHz-Wandler ist ausreichend für Mittel-und Spätstadium der Embryonen, aber vor E11.5 mehr Begrenzung für die Stufen.
Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die oben beschriebenen Herzinjektionsprotokolle sollten in Mid-Stage-Maus-Embryonen verwendet werden. Die Ex-vivo-Technik ist mit der Kultur der Embryonen isolierten Herzen oder Explantation kompatibels. Die in vivo-Verfahren ermöglicht Langzeit-Follow-up, einschließlich postnatale Entwicklung. Diese Techniken werden deutlich in der Prüfung der Differenzierungspotenzial von menschlichen Stammzellen Derivate in einer geeigneten Umgebung, sowie im Umgang mit spezifischen Fragen der Entwicklungsbiologie wie Zellmigration und regionale Cues, die wichtigsten Ereignisse in der Straße in Richtung Gestaltung eines funktionellen Herz sind zu unterstützen . Zusätzlich kann unser Verfahren und die der anderen 10 in der Zukunft für die Untersuchung anderer Organe als das Herz, abhängig vom verfügbaren ex vivo-Kulturprotokolle und / oder Entwicklungsstadium in vivo verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Stiftung Leducq (Mitralklappe) und die Agence Nationale pour la Recherche (ANR gewähren Specistem) für die Finanzierung dieser Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
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