Summary
हम (ई) 9.5 और बाद के चरणों भ्रूण दिन पर माउस भ्रूण भीतर भ्रूण या pluripotent कोशिकाओं से व्युत्पन्न अंतर्जात और grafted कोशिकाओं के सेल भाग्य और phenotype दोनों पर नजर रखने के क्रम में, रंग इंजेक्षन करने के लिए डीएनए वैक्टर, वायरस, और कोशिकाओं के तरीकों की एक श्रृंखला का वर्णन विकास की.
Abstract
इन विट्रो प्रोटोकॉल में भ्रूण या pluripotent स्टेम सेल डेरिवेटिव के भाग्य का परीक्षण जरूरी उनके vivo क्षमता को प्रतिबिंबित नहीं करते कि विवादास्पद परिणामों के लिए प्रेरित किया. अधिमानतः, इन कोशिकाओं को अपनी निश्चित phenotype के अधिग्रहण के क्रम में एक उचित भ्रूण वातावरण में रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, रंग या रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ कोशिकाओं लेबलिंग के बाद माउस में पढ़ाई अनुरेखण सेल वंश अभी भी खराब विकसित अंगों के साथ प्रारंभिक चरण माउस भ्रूण ज्यादातर सीमित रह गया है. इन सीमाओं को पार करने के लिए, हम E9.5 और विकास के बाद के चरणों में माउस भ्रूण में हृदय की लक्षित क्षेत्रों में विभिन्न एजेंटों इंजेक्षन मानक और अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता microinjection प्रोटोकॉल बनाया गया. भ्रूण explant या भ्रूण तो सुसंस्कृत या आगे गर्भ में विकसित करने के लिए रह गए हैं. इन एजेंटों फ्लोरोसेंट रंजक, वायरस, shRNAs, या सेल व्युत्पन्न पूर्वज स्टेम सेल शामिल हैं. हमारे दृष्टिकोण फू के संरक्षण के लिए अनुमतिअंग की nction प्रवास और लेबल और / या इंजेक्शन कोशिकाओं के भाग्य की निगरानी करते हुए. इन प्रौद्योगिकियों अन्य अंगों के लिए बढ़ाया जा सकता है और विकास के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण जैविक सवालों का पता करने के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा.
Introduction
एक दशक से अधिक पहले, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (HuESCs) मानव ब्लास्टोसिस्ट्स 1 से प्राप्त किया गया है. तब से इन कोशिकाओं को मानव विकास जीव विज्ञान में unmet सवालों के पते जो अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का विषय बन गए हैं. HuESCs इसके अलावा पुनर्योजी चिकित्सा में आशाओं की व्यवस्था की है. हाल के वर्षों में, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) आनुवंशिक रोग 2 के मॉडल उपलब्ध कराने, रोगी विशेष दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न किया गया है. दिल प्रजातियों 3 सहित विभिन्न सेल प्रजातियों, की ओर से भ्रूण या प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल में कई, सूचित किया गया है. विभेदित कोशिकाओं अक्सर आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति, immunostaining, और / या इन विट्रो कार्यात्मक परीक्षण में के विश्लेषण से phenotyped कर रहे हैं. हालांकि, pluripotent स्टेम सेल डेरिवेटिव वे पूरी तरह से सीईएल अधिग्रहण परीक्षण है कि क्या क्रम में एक उचित भ्रूण वातावरण में रखा जाना हैएल उनके भ्रूण समकक्ष के भाग्य और वे क्षेत्रीय संकेत के जवाब में वास्तविक vivo समारोह पुनरावृत्ति या नहीं. ऊतक इंजीनियरिंग होनहार है, यह अभी तक भ्रूण ऊतक 4,5 विकासशील विवो में उचित के सभी ज्ञात और अज्ञात cues प्रदान नहीं करता है.
माउस भ्रूण सहित भ्रूण में रंगों या रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ सेल लेबलिंग, हृदय विकास 6 के दौरान सेल प्रजातियों के भ्रूण मूल के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी लाया है. उदाहरण के लिए, अलग दिलों की इन विट्रो संस्कृति द्वारा पीछा पूर्व vivo माउस भ्रूण की पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में इंजेक्शन डाई, epicardial कोशिकाओं और उनके वंश 7 लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, डाई और रेट्रोवायरल सेल लेबलिंग ज्यादातर 8 अधिक आसानी से उपलब्ध हैं, जो अभी भी खराब विकसित अंगों, या चिकन भ्रूण, साथ जल्दी माउस भ्रूण को लागू किया गया है. एक अपवाद ई में लक्षित करने के लिए आसान है, जो मस्तिष्क है,mbryos 9,10. इस तरह के एक दृष्टिकोण अभी तक पिटाई भ्रूण माउस दिल के लिए लागू नहीं किया गया है.
रंगों या वायरस के साथ सीधे लेबलिंग के पूरक हैं और अधिक उन्नत चरण माउस भ्रूण और वयस्क चूहों में अनुरेखण वंश प्रदर्शन करने के लिए, सेल लेबलिंग दृष्टिकोण Cre / Lox प्रौद्योगिकी का उपयोग कर ट्रांसजेनिक चूहों के विश्लेषण के साथ संयुक्त कर दिया गया है. Cre / Lox दृष्टिकोण 11 तथापि recombinase की अभिव्यक्ति ड्राइव किया जीनोमिक विनियामक क्षेत्रों के spatiotemporal विशिष्टता, और रचनात्मक / Lox पुनर्संयोजन 12 की दक्षता की वजह से कुछ सीमाएं सुविधाएँ. यह केवल Cre अभिव्यक्ति ड्राइव किया विनियामक क्षेत्र की सक्रियता के बाद एक अग्रदूत लेबल कर सकते हैं इसके अलावा, इस दृष्टिकोण पूरी तरह से सेल भाग्य की सेल प्रवास संचालित अधिग्रहण की विशिष्ट सवालों का पता नहीं है. यह भी स्पष्ट नैतिक मुद्दों के लिए मानव भ्रूण को लागू नहीं कर सकते.
इन सीमाओं को देखते हुए, हम पी की एक श्रृंखला तैयारके लक्षित क्षेत्रों में जैसे फ्लोरोसेंट रंजक, वायरस, ऐसे shRNAs और डीएनए आधारित सेल लेबलिंग वैक्टर के रूप में जीन अभिव्यक्ति modulators, या E9.5 और विकास के बाद के चरणों में माउस भ्रूण में कोशिकाओं के रूप में सेल लेबलिंग एजेंटों की एक किस्म इंजेक्षन rotocols दिल.
डीएनए / सेल इंजेक्शन एक stereomicroscope और 48 घंटा, या 48-72 घंटे के लिए पृथक दिल या भ्रूण explant संस्कृति अप करने के लिए पूर्व vivo भ्रूण संस्कृति के साथ संयुक्त एक सरल microinjection डिवाइस का उपयोग करें. हम भी गर्भ में भ्रूण माउस दिलों में एक अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता microinjection प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. इस तकनीक भ्रूण 13 के विकास की निगरानी की अनुमति देता है और injectates और / या लेबल कोशिकाओं की लंबी अवधि अनुवर्ती के लिए अनुमति देता है.
हम इन तरीकों अंग के समारोह के संरक्षण और स्टेम सेल की क्षमता के इन विट्रो में परीक्षण की तुलना में एक अधिक प्रतिनिधि वातावरण प्रदान करते पाया. यह भी माइग्रेशन का पालन करने का अवसर प्रदान करता हैके अपने भाग्य पर नजर रखने के लिए कोशिकाओं लेबल और / या इंजेक्शन. अंत में, यह क्षेत्रीय ऊतक patterning और महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ उपज चाहिए.
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Protocol
1. तैयारी
पशु प्रक्रियाओं
एक पशु नैतिक समिति से अनुमोदन प्राप्त और वायरस के साथ काम करने के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें, HuESC और / या iPSC (जब लागू हो), और साथ ही माउस हैंडलिंग, माउस भ्रूण प्राप्त करने, और माउस सर्जरी प्रदर्शन. समय पर matings के लिए, प्लग के दिन भ्रूण दिन (ई) 0.5 / 0.5 दिनों के बाद coitum माना जाता है.
- Microinjection सुई:
पूर्व utero microinjection के लिए, एक 1 या 10 माइक्रोन आंतरिक टिप व्यास और क्रमशः, डीएनए या कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए एक तेज और शांकव टिप आकार पाने के लिए एक विंदुक खींचने / beveller का उपयोग कांच pipettes (1.2 मिमी बाहरी व्यास borosilicate केशिका ट्यूब) पुल. अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता इंजेक्शन के लिए, उपयोग एक 50/35 माइक्रोन आयुध डिपो / आईडी टिप के साथ 1.14 mm/0.53 मिमी की एक आंतरिक / बाहरी व्यास (आयुध डिपो / आईडी) है, जो बाँझ सुई, अनुकूलित. - सिलिकॉन से भरे पेट्री डिश:
पुस्तिका में वर्णित के रूप में सिलिकॉन तैयार करें. भरना~ 1 सेमी की एक elastomer परत के साथ एक साफ ग्लास 60 मिमी व्यास पेट्री डिश. हवाई बुलबुले से बचें. - उपकरण:
प्रक्रिया के दौरान पहले और बाँझ सभी शल्य चिकित्सा उपकरण रखें. - डीएनए तैयारी:
एक ट्यूब में 3 ग्राम डीएनए और 12 μl Opti-सदस्य जोड़ें. एक और ट्यूब में 3 μl 2000 Lipofectamine और 12 μl Opti-सदस्य जोड़ें. आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं और दोनों के समाधान मिश्रण. तुरंत प्रयोग करें. - सेल तैयार:
10 6 कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी / मिलीलीटर DMEM (Dulbecco ईगल मध्यम, उच्च ग्लूकोज और 50% चूहा सीरम). अंतिम सेल निलंबन के 50 μl 8-10 भ्रूण के लिए पर्याप्त है. - तैयारी डाई:
25 मिलीग्राम / मिलीलीटर DMSO में हरी फ्लोरोसेंट CDCFDA-एसई का प्रयोग करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 μl aliquots और दुकान की तैयारी बाँझ खारा या पीबीएस उपयोग करने से पहले में 1:100 / 1:200 पतला. - वायरस तैयारी:
~ 10 9 -10 10 टीआरए की एक अनुमापांक के साथ एक वाणिज्यिक 3 पीढ़ी PGK GFP-व्यक्त lentivirus का प्रयोग करेंइकाइयों / मिलीलीटर DMEM nsducing. Lentivirus की तैयारी के लिए, Tiscornia एट अल. 14 व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और सुरक्षित रूप से इस्तेमाल करते हैं और वायरस के निपटान को देखते हैं.
पूर्व vivo इंजेक्शन के लिए E9.5 और E10.5 भ्रूण की 2. संग्रह
- भ्रूण दिन 9.5 या 10.5 पर एक गर्भवती माउस euthanize.
- 70% इथेनॉल के साथ माउस की छाती और पेट जीवाणुरहित.
- पेट खोलने और पीबीएस में आरटी पर गर्भाशय सींग पुनः प्राप्त करने और M16 माध्यम के साथ एक सिलिकॉन से भरे पेट्री डिश के लिए दो पीबीएस washes के बाद यह हस्तांतरण करने के लिए एक उदर midline चीरा बनाओ.
- गर्भाशय के vascularized पक्ष तल पर है कि इतना सिलिकॉन परत करने के लिए कीट पिन के साथ गर्भाशय सींग पिन.
- सतह के नीचे 1 मिमी पर ठीक संदंश के साथ गर्भाशय की सतह, और पतनिका की एक टोपी कट.
- धीरे पतनिका की दीवारों से बाहर फैल द्वारा जर्दी थैली में भ्रूण निकालते हैं.
- 37 पर भ्रूण स्टोर; सेल इंजेक्शन से पहले सी M16 में मध्यम. इंजेक्शन के लिए, प्रत्येक भ्रूण पूर्व गरम 37 डिग्री सेल्सियस M16 मध्यम से भरा सिलिकॉन डिश को सौंप दिया है
एक stereomicroscope के तहत 3. डीएनए या सेल इंजेक्शन
- एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ पीछे से कांच विंदुक भरें और नोक पर बुलबुले को दूर करने के लिए पिपेट हिला.
- Microinjection धारक पर पिपेट सेट; 50 को पकड़े दबाव (डीएनए) या 30 (कोशिकाओं) एचपीए, और 300 (सेल) को 150 करने के लिए इंजेक्शन दबाव (डीएनए) एचपीए सेट. 0.2 सेकंड (डीएनए) या 0.5 सेकंड (सेल) को इंजेक्शन समय निर्धारित करें. ये सेटिंग्स थोड़ा microinjector और विंदुक के प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकता है.
- उचित भ्रूण को छूने के बिना जर्दी थैली के माध्यम से सिलिकॉन नीचे करने के लिए भ्रूण पिन. दिल का क्षेत्र देखने के लिए और इस क्षेत्र से ऊपर थैली खुला.
- सेल इंजेक्शन के दौरान किसी भी प्रस्ताव को रोकने के लिए भ्रूण के चारों ओर 4 पिंस जोड़ें.
- (मार्गदर्शन करने के लिए सेट) micromanipulator का उपयोग, Slowlबस चित्रा (1) इंजेक्ट किया जा रहा है कि दिल के क्षेत्र से ऊपर पेरीकार्डियम ऊपर 45 डिग्री के कोण पर y स्थिति पिपेट टिप,.
- ब्याज के क्षेत्र में पिपेट ले जाएँ और इंजेक्शन ट्रिगर. जितना ज्यादा हो सके पिपेट बाहर ले जाओ. यकीन दिल ठीक से डीएनए / सेल इंजेक्शन के बाद से धड़क रहा है बनाओ.
4. भ्रूण, पृथक दिल, और explant संस्कृति
- पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म और 40% 2 हे के साथ ऑक्सीजन के साथ पूरक 25% M2 मध्यम और 75% चूहा सीरम में संस्कृति E9.5 भ्रूण,.
- , एक 25 एमएल ग्लास ट्यूब में 2 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम जोड़ें धीरे भ्रूण जोड़ने, और ट्यूब पर टोपी पंगा लेना से पहले 40% 2 हे के साथ आक्सीजन के साथ मिलना. घूर्णन या (30 घुमाव / मिनट) मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर 36 घंटे तक का समय सेते हैं.
- वांछित समय बिंदु (उदाहरण के लिए 24 घंटे) में पहला डे से, दिलों को छूने के बिना, ठीक संदंश के साथ सावधानी से दिल काटनाभ्रूण capitating; दिल बाहर का बहिर्वाह पथ का उपयोग कर बाहर खींच कर आबकारी करने के लिए आसान है.
- संस्कृति एक 12 अच्छी तरह से थाली में सेट एक Matrigel लेपित डालने पर 50% FCS साथ DMEM में एक और 36-48 घंटे के लिए दिल पृथक. दिल संस्कृति 15 के एक उन्नत प्रोटोकॉल के लिए डायर और पैटरसन (2013) देखें.
- हित के क्षेत्र के किसी भी explant बनाओ. एक उदाहरण के रूप में, कोलेजन टाइप 1 जेल में 16 पर 48 घंटे के लिए एट्रीयो निलय नहर (एवीसी) और संस्कृति इसे काटना.
हार्ट मैं n utero में 5. अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन
- अल्ट्रासाउंड मशीन और microinjector का सेटअप:
- एक रेल पर एक 40 मेगाहर्ट्ज ट्रांसड्यूसर और microinjection स्थापना के साथ उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड प्रणाली का प्रयोग करें.
- इंजेक्शन प्रति 69 NL में microinjector पर इंजेक्शन की मात्रा निर्धारित करें. Microinjector प्रोग्रामिंग के लिए निर्माता की microinjection मैन्युअल देखें.
- Microi की तैयारीnjection सेटअप और इंजेक्शन:
- Microinjector में एक गिलास micropipette रखें. अधिकतम मात्रा को aspirating द्वारा कुशल इंजेक्शन, पहली कोट खनिज तेल के साथ विंदुक के भीतर की ओर सुनिश्चित करने के लिए. तो सुई के अंदर तेल के 1-2 मिमी छोड़ रहा है, फिर से तेल बाहर निकालें.
- अधिकतम मात्रा तक पहुँच जाता है injectate aspirate. इस टिप कुंद और इंजेक्शन अधिक मुश्किल कर देगा के रूप में सुई की नोक के साथ किसी भी सतहों को छूने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
- इंजेक्शन के दौरान भ्रूण युक्त गर्भाशय सींग को स्थिर करने के लिए, केंद्र में कटौती एक छोटा सा छेद के साथ एक पतली सिलिकॉन झिल्ली द्वारा कवर बीच में एक छेद के साथ एक संशोधित पेट्री डिश (2.5 सेमी व्यास), उपयोग, और चीरा साइट के ऊपर यह स्थिति . पकवान के किनारों के तहत मिट्टी की 3-4 clumps स्थिति से माउस से निपटने मेज पर पेट्री डिश को स्थिर.
- इंजेक्शन प्रक्रिया:
- पूर्व anesthe लिए (वांछित भ्रूण अवस्था में) एक गर्भवती माउस के पेट दाढ़ीSIA बालों को हटा दें. अवशिष्ट बालों को हटाने और 70% इथेनॉल के साथ बाँझ एक रसायन के बालों को हटाने के एजेंट के साथ पेट समझो.
- एक चेहरे नकाब के माध्यम से ऑक्सीजन / isoflurane के साथ एक गर्भवती माउस anesthetize. प्रक्रिया के बाकी के दौरान 1-1.5% द्वारा पीछा प्रारंभिक संज्ञाहरण, के लिए 100% ऑक्सीजन में 3-5 isoflurane% का उपयोग करें. माउस पर्याप्त रूप से धीरे अपने पंजे और / या पूंछ pinching द्वारा anesthetized है कि सुनिश्चित करें.
- (37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के लिए सेट) माउस से निपटने मेज पर माउस लापरवाह प्लेस और कॉर्निया की निर्जलीकरण को रोकने के लिए स्नेहक के साथ आंखों को कवर किया.
- इलेक्ट्रोड पर इलेक्ट्रोड जेल लागू करें और हृदय गति, श्वसन दर, और ईसीजी की निगरानी के लिए इलेक्ट्रोड के पंजे टेप. शरीर के तापमान पर नजर रखने के लिए एक गुदा थर्मामीटर स्थिति.
- पहले माउस दृश्यमान करने और अल्ट्रासाउंड से भ्रूण की गणना के द्वारा गर्भवती है कि जाँच करें. पेट पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें और मूत्राशय ऊपर स्कैन सिर स्थिति. स्थिरता के लिए, पहली मूत्राशय कल्पनाऔर मूत्राशय की स्थिति से शुरू, बाएँ में भ्रूण और सही गर्भाशय सींग गिनती. भ्रूण दिल सामान्य रूप से पिटाई कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- माउस गर्भवती है, मिट्टी के साथ भविष्य चीरा साइट ऊपर पेट्री डिश की स्थिति. डिश सीधे संपर्क में है कि थोड़ा बहुत पेट पर पकवान दबाएँ.
- डिश निकालें और फिर पेट बाँझ. पेट और पेरिटोनियम खोलने के लिए, लगभग 0.75-1 सेमी योनि से ऊपर, एक 1.5-2 सेमी उदर midline चीरा बनाओ. आंतरिक अंगों को चोट से बचें.
- संदंश के साथ छोड़ दिया है या सही गर्भाशय सींग अमल में लाना, धीरे पकवान की सिलिकॉन झिल्ली के माध्यम से यह पुल, और फिर मिट्टी पर पकवान स्थिर. रोकने के व्यापक यह गर्भाशय वाहिकाओं और महिला और / या भ्रूण की अकाल मृत्यु का खून बह रहा हो सकता है, के बाद से खींच या हेरफेर.
- भ्रूण इंजेक्शन थे जिनमें से पर्याप्त रिकॉर्ड रखने को सुनिश्चित करने के लिए फिर से भ्रूण गणना.
- यू पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करेंछवि को Terine सींग दिल और निर्जलीकरण को रोकने के लिए.
- छवि पहले भ्रूण इंजेक्ट किया. भ्रूण दिल की सामान्य पिटाई की जाँच करें और भ्रूण की दुम कपाल और बाएँ सही अभिविन्यास का रिकॉर्ड रखें. यदि आवश्यक हो, उचित उन्मुखीकरण सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा गर्भाशय सींग रखते हैं. इस मुश्किल साबित होता है, तो अगले भ्रूण पर चलते हैं.
- थोड़ा (चित्रा 3) पेरीकार्डियम के बाहर, भ्रूण के ऊपर एक 45 डिग्री के कोण में सुई की स्थिति को microinjection सुई के साथ सावधानी से गर्भाशय पंचर. यह एट्रीयो निलय नाली (चित्रा 3) की ओर इंगित करता है ताकि epicardial कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए, छवि एक चार कक्ष में रखते हुए दिल और सुई की स्थिति. कोण समायोजित करने की जरूरत है, सुई को बाहर खींच, और रखते हैं. इस सुई टूट सकता है, के बाद से गर्भाशय के अंदर सुई के साथ कोण समायोजित न करें. इस तरह के अंग या नाल के रूप में अन्य ऊतकों, puncturing से बचें.
- सुई ले जाएँपेरिकार्डियल दीवार पर और एक सौम्य, लेकिन तेज गति के साथ यह पंचर. सामान्य में, वहाँ कुछ प्रतिरोध किया जाएगा, लेकिन बहुत तेजी से सुई आगे बढ़ सुई टिप दिल ही पंचर करने के लिए कारण हो सकता है. टिप एट्रीयो निलय नाली की पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में समाप्त होना चाहिए. पेरिकार्डियल रक्तस्राव के मामले में, रक्त कोशिकाओं को एक सफेद बर्फ की तरह पैटर्न के रूप में दिखाई देगा. यदि यह मामला है, भ्रूण इंजेक्शन लगाने और रोकने के लिए एक और भ्रूण पर चलते हैं.
- Injectate इंजेक्षन. दिलों विकास पर प्रतिकूल प्रभाव को रोकने के लिए pericardial अंतरिक्ष में ज़्यादा से ज़्यादा 700 NL इंजेक्षन. Pericardial थैली की मामूली, अस्थायी सूजन द्वारा उचित इंजेक्शन मॉनिटर.
- इंजेक्शन के बाद, बाहर सुई खींच और injectate अभी भी सुई ऊतक टुकड़े से भरा हुआ नहीं था कि यह सुनिश्चित करने के लिए अलग हो सकता है कि इस बात की पुष्टि.
- छवि को निपटने तालिका का स्थान बदलें और अगले भ्रूण इंजेक्षन. रोकने के लिए (एक गर्भाशय सींग में) 3-4 ज़्यादा से ज़्यादा के लिए इंजेक्शन भ्रूण की संख्या रखेंविरोध गर्भाशय सींग में नियंत्रण भ्रूण के लिए अनुमति देने के लिए, और प्रक्रिया भ्रूण के विकास को परेशान नहीं किया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, संज्ञाहरण बढ़ाया.
- भ्रूण की वांछित संख्या इंजेक्शन लगाने के बाद, अतिरिक्त अल्ट्रासाउंड जेल निकालें और धीरे अपनी सही स्थिति में पेट में वापस गर्भाशय सींग जगह है.
- एक पेरिटोनियम और पेट की मांसपेशियों के लिए सीवन की परत, और त्वचा के लिए सिवनी की एक दूसरी परत का उपयोग करके मातृ पेट को बंद करें.
- दर्द की दवा की पहली खुराक के साथ माउस इंजेक्षन. पिछले 12 घंटे के अंतराल के साथ संज्ञाहरण और तीन अतिरिक्त इंजेक्शन समाप्त होने तक 0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा Buprenorphine 15 मिनट का एक इंजेक्शन का प्रयोग करें.
- संज्ञाहरण बंद करने और प्रक्रिया से पर्याप्त वसूली के लिए माउस की निगरानी. हाउस अनुवर्ती की यात्रा की अवधि के लिए एक व्यक्ति को पिंजरे में गर्भवती माउस.
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Representative Results
ऊपर वर्णित इंजेक्शन प्रोटोकॉल का प्रयोग, कोशिकाओं लेबल और / या भ्रूण माउस दिल में इंजेक्ट किया जा सकता है. अवधारणा का सबूत के रूप में, कई उदाहरण इंजेक्शन प्रोटोकॉल और पूर्व vivo एवीसी explant, पृथक दिल, या पूरे भ्रूण संस्कृति (चित्रा 1) के संयुक्त थे जिसमें दिखाया गया है.
चित्रा 1 सेल इंजेक्शन से पहले भ्रूण की तैयारी से पता चलता है. जर्दी थैली (चित्रा 1 ए) की अखंडता को बनाए रखते हुए E9.5 भ्रूण इसके पतनिका से निकाल दिया जाता है. जर्दी थैली सिर्फ दिल (चित्रा 1 बी) ऊपर खोला है. पिपेट (चित्रा 1C) से संपर्क किया और कोशिकाओं इंजेक्ट किया जाता है. दिल अपने आकार (चित्रा -1) को बरकरार रखे हुए है और धड़कन बनी हुई है.
इस तरह के संक्रमण (EMT) mesenchyme उपकला के रूप में विकास जीव विज्ञान में एक अधिक विशिष्ट जैविक सवाल का पता करने के लिए, एक E9.5 एवीसी explant एक श इंजेक्शन के साथ किया गया थाEndocardial कोशिकाओं के endothelial-mesenchymal संक्रमण (2A चित्रा) के लिए आवश्यक एक प्रोटीन नीचे नियंत्रित करता है कि शाही सेना. नियंत्रण भ्रूण एक खाली रीढ़ वेक्टर इंजेक्शन के साथ किया गया था. इसी तरह, Sox9 प्रमोटर के नियंत्रण में GFP व्यक्त रंग सेल प्राप्त endothelial पूर्व वाल्वुलर कोशिकाओं 48 घंटा explanted दिल संस्कृति द्वारा पीछा किया, E10.5 पर एवीसी में इंजेक्ट किया गया. इन कोशिकाओं को इस तरह के (आंकड़े 2 बी और 2 सी) अंतर्जात endocardial कोशिकाओं को periostin समान रूप EMT के मार्कर के अधिग्रहण.
ये पूर्व vivo दृष्टिकोण अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं, लेकिन छोटी अवधि के अनुवर्ती (ज़्यादा से ज़्यादा 48-72 घंटे) तक ही सीमित. अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन प्रक्रिया एक तकनीकी रूप से और अधिक चुनौतीपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है, लेकिन गर्भ अनुवर्ती में लंबी अवधि के विकल्प, यहां तक कि प्रसवोत्तर, साथ. डाई या विशिष्ट हृदय क्षेत्रों में कोशिकाओं लेबल वायरल वैक्टर में utero इंजेक्शन आंकड़े 3A-3 में दिखाया गया है सी. इस विधि के साथ, epicardial कोशिकाओं के विशिष्ट लेबलिंग फ्लोरोसेंट रंजक (आंकड़े 3 डी और 3E) या वायरस (चित्रा 3F) के साथ प्राप्त किया जा सकता है, और विधि कोशिकाओं या वैकल्पिक injectates साथ पर विस्तार किया जा सकता है.
. दिल में चित्रा 1 सेल इंजेक्शन एक:.. जर्दी थैली में E9.5 भ्रूण बी: बस दिल से ऊपर की जर्दी थैली खोलने के बाद दिल का दृश्य. नीचे इनसेट दिल की बढ़ाई पता चलता है और ए.वी. नहर सी बताते हैं:.. एवीसी विकास की दिशा में पिपेट का दृष्टिकोण: 48 घंटा संस्कृति (एच = दिल) के बाद भ्रूण इंजेक्शन.
. एक हृदय explant में endocardial कोशिकाओं के पूर्व vivo EMT रोकता है कि एक E9.5 भ्रूण की एवीसी में एक shRNA की चित्रा 2 इंजेक्शन एक:. नियंत्रण रीढ़ वेक्टर या एक shRNA एक E9.5 की एवीसी में lipotectamine साथ एक साथ इंजेक्ट किया गया था माउस भ्रूण; 3 घंटा बाद, एवीसी endocardial कोशिकाओं की EMT ट्रिगर करने के क्रम में बाहर विच्छेदित और एक कोलेजन जेल पर हो गया था. . shRNA EMT ई.पू. के लिए आवश्यक है कि एक प्रोटीन downregulated: Sox9 प्रमोटर के नियंत्रण में GFP व्यक्त इंजीनियर रंग सेल व्युत्पन्न वाल्वुलर कोशिकाओं E10.5 भ्रूण की एवीसी में इंजेक्ट किया गया. दिल 2 दिन (बी) के लिए सभ्य था, और बाद में तय की और एक विरोधी periostin एंटीबॉडी (सी) के साथ दाग. इनसेट एवीसी क्षेत्र के एक बढ़ाई पता चलता है.
.. चित्रा 3 utero इंजेक्शन में एक: प्रयोगात्मक सेटअप चित्रण योजना. गर्भवती माउस लापरवाह तैनात है और सिलिकॉन झिल्ली के साथ एक पेट्री डिश चीरा साइट के ऊपर स्थिर है. . 1 = microinjector, 2 = ट्रांसड्यूसर, सिलिकॉन झिल्ली के साथ 3 = पेट्री डिश, 4 = अल्ट्रासाउंड जेल, गर्भाशय सींग (लाल) के साथ 5 = माउस, = 6 प्ले-Doh मिट्टी, 7 = माउस हैंडलिंग तालिका बी: एक की अभी भी फ्रेम इंजेक्शन के लिए पहले सुई और भ्रूण दिल की स्थिति दिखा अल्ट्रासाउंड फिल्म (एम मोड). महिला ईसीजी नीचे (हरा), और कम सही (पीला) में हृदय और श्वसन दर पर दिखाया गया है. एच = दिल सी:. इंजेक्शन के दौरान सुई और भ्रूण दिल की स्थिति दिखा अल्ट्रासाउंड छवि. इनसेट: टिप पेरीकार्डियम बीत चुका है, लेकिन मायोकार्डियम स्पर्श नहीं करता है, तो यह है कि सुईखाया एट्रीयो निलय नाली की पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया जा सकता है. काले बिंदीदार रेखा आलिंद (ए) और वेंट्रिकल (वी) की सीमाओं मार्क डी:. पूरे पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में डाई की मजबूत प्रतिदीप्ति दिखा एक E11.5 माउस भ्रूण की छवि माउंट ई:. एक E11.5 के प्रतिनिधि अनुभाग एक फ्लोरोसेंट डाई (CDCFDA-एसई, हरा) इंजेक्शन के बाद 4 घंटे साथ pericardial और epicardial सेल लेबलिंग दिखा भ्रूण माउस दिल. नाभिक DAPI (नीला) के साथ लेबल रहे हैं. ला = बाएं आलिंद, एल.वी. = बाएं वेंट्रिकल, आरए = सही आलिंद, आर.वी. = सही वेंट्रिकल एफ:. 3 दिनों के इंजेक्शन के बाद GFP-व्यक्त lentivirus के साथ मोज़ेक epicardial सेल लेबलिंग दिखा एक E14.5 भ्रूण माउस दिल के प्रतिनिधि अनुभाग. GFP विशिष्टता की पुष्टि, GFP प्रोटीन भी एक GFP एंटीबॉडी (लाल) के साथ सना हुआ था. नाभिक DAPI (नीला) के साथ लेबल रहे हैं.
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Discussion
ऊपर वर्णित अंतर हृदय पूर्व vivo इंजेक्शन प्रोटोकॉल मध्य मंच (E9.5-E11.5) माउस भ्रूण में कम से कम 48 घंटे के लिए दौरे समारोह संरक्षित करने के लिए तैयार कर रहे हैं. ये इंजेक्शन दृष्टिकोण डीएनए या कोशिकाओं के स्थानिक लक्षित इंजेक्शन के लिए अनुमति देते हैं. आंकड़े 1-3 में दिखाया कुछ उदाहरण पूर्व vivo और ऐसे endocardial या epicardial कोशिकाओं की EMT के रूप में प्रतिबंधित हृदय क्षेत्रों में जगह ले कि विकास की प्रक्रिया के विवो आणविक तंत्र में delineating के लिए अवधारणा के सबूत प्रदान करते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, इन प्रोटोकॉल ऐसे एक उचित भ्रूण वातावरण, एक अब तक unmet की चुनौती में मानव भ्रूण कोशिकाओं या huESC डेरिवेटिव के रूप में इंजेक्शन कोशिकाओं के प्रवास और भाग्य का पालन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं. में saturating के साथ (चित्रा 3 में epicardial कोशिकाओं की तरह) विवो लेबलिंग या डाई या वायरस के dilutions सीमित कम करने के साथ ही लंबी अवधि के बी पर सेल (उप) आबादी का वंश पता लगाने के लिए अनुमति देता हैCre / lox प्रौद्योगिकी के लिए आवश्यकता के बिना ASIS, (इन तकनीकों के संयोजन के रूप में अच्छी तरह से उपयोगी हो सकता है).
इन प्रोटोकॉल लागू करते समय कई महत्वपूर्ण कदम मनाया गया. सबसे पहले, भ्रूण प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए यह प्रक्रिया भ्रूण प्रति 15 मिनट के भीतर उच्च reproducibility और दक्षता के साथ किया जा सकता है ताकि एक stereomicroscope के तहत इंजेक्शन प्रोटोकॉल अभ्यास करने के लिए सिफारिश की है. एक ही पंक्ति में, पूरे अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता इंजेक्शन प्रक्रिया भ्रूण का एक अच्छा व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए और उनके में utero विकास से समझौता नहीं करने के लिए 30 मिनट के भीतर किया जाना चाहिए. गर्भाशय के हेरफेर एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, यह गर्भवती चूहों पर सर्जरी (1-2 दिन पहले ही सामान्य से अधिक) समय से पहले प्रसव में परिणाम जाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. हालांकि, नवजात शिशुओं को आम तौर पर स्वस्थ होना चाहिए और सामान्य रूप से विकसित करना. इसके अलावा, गर्भाशय की दीवार, जर्दी थैली और भ्रूण के माध्यम से पिपेट की पैठपेरीकार्डियम तक पहुँचने और अंत में मायोकार्डियम एक नाजुक प्रक्रिया (कदम 5.3.13) है. यह कदम सावधानी से और धीरे से किया जाना चाहिए. अनुकूलन के लिए, यह reproducibility निर्धारित और गैर लक्षित क्षेत्रों में इंजेक्शन बाहर करने के लिए कई अल्पकालिक डाई इंजेक्शन प्रदर्शन करने की सिफारिश की है. अंत में, हम ऊपर दिए गए उदाहरण के लिए इंजेक्शन प्रक्रियाओं से संबंधित विकासात्मक हृदय दोष नहीं मिला है. हालांकि, एक अधिक विस्तृत, चरण दर चरण, रूपात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण पूरी तरह से ब्याज के चरणों के दौरान सामान्य विकास और समारोह का पता लगाने के लिए किया जाना चाहिए.
इन प्रौद्योगिकियों की सीमाओं कई हैं. (मैं) stereomicroscope के तहत इंजेक्शन माउस भ्रूण का प्रकाश और तापमान संवेदनशीलता द्वारा सीमित है. यह नियमित रूप से जगह या मध्यम वार्मिंग, और एक अंधेरे कमरे में काम कर के रूप में संभव के रूप में तेजी से होना क्रम में microinjection प्रक्रिया का अभ्यास करके दूर किया जा सकता है. (Ii) पूर्व Vभ्रूण या explants के इवो संस्कृति लंबी अवधि अनुवर्ती के लिए अनुमति देता है जिसमें गर्भ अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन के विपरीत, समय में सीमित है. महत्वपूर्ण रंगों लगभग तुरंत कोशिकाओं लेबल के लिए जाते हैं और तीन से चार दिनों के बाद इंजेक्शन के लिए ऊपर दिखाई रहेगा. हालांकि, डाई की तीव्रता लगातार कोशिका विभाजन से पतला हो जाएगा. Lentivirus के साथ कोशिकाओं लेबल इस समस्या को दूर कर सकते हैं. हालांकि, वायरस के तेज कई घंटे लगते हैं और अभिव्यक्ति अल्पकालिक विश्लेषण रोकता है जो 24-48 घंटे के बाद हो सकता है. (Iii) अल्ट्रासाउंड की मध्यस्थता इंजेक्शन उपकरणों की लागत से सीमित है. 40 मेगाहर्ट्ज transducer के संकल्प के मध्य और देर चरण भ्रूण के लिए पर्याप्त है, लेकिन अधिक से पहले E11.5 करने के स्तरों के लिए सीमित.
संक्षेप में, हम ऊपर वर्णित हृदय इंजेक्शन प्रोटोकॉल के मध्य चरण माउस भ्रूण में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि प्रस्ताव. पूर्व vivo तकनीक भ्रूण की संस्कृति, पृथक दिल, या explant के साथ संगत हैएस. vivo में प्रक्रिया प्रसवोत्तर विकास सहित दीर्घकालिक अनुवर्ती, के लिए अनुमति देता है. इन तकनीकों में एक उचित वातावरण में मानव स्टेम सेल डेरिवेटिव के भेदभाव की क्षमता का परीक्षण करने के साथ ही में इस तरह के सेल प्रवास और एक कार्यात्मक दिल को आकार देने की ओर सड़क में महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं जो क्षेत्रीय संकेत के रूप में विकास जीव विज्ञान की विशिष्ट प्रश्न के समाधान में काफी सहायता करेगा . इसके अलावा, हमारे तरीके और दूसरों को 10 की उन भविष्य में उपलब्ध पूर्व vivo संस्कृति प्रोटोकॉल और / या vivo में विकास के चरण पर निर्भर दिल से अन्य अंगों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों फाउंडेशन Leducq (mitral) और एजेंस नेशनल इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए ला Recherche (ANR Specistem अनुदान) डालना स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
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