Summary
Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.
Abstract
Testare il destino di cellule staminali derivati embrionali o pluripotenti nei protocolli in vitro ha portato a risultati controversi che non riflettono necessariamente la loro potenziale vivo. Preferibilmente, queste cellule devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato al fine di acquisire il loro fenotipo definito. Inoltre, linea cellulare tracciando studi nel topo dopo etichettatura cellule con coloranti o vettori retrovirali è rimasto per lo più limitato alle fasi iniziali embrioni di topo con gli organi ancora poco sviluppati. Per superare queste limitazioni, abbiamo progettato i protocolli microiniezione standard e ultrasuoni-mediata per iniettare vari agenti in regioni mirate di cuore in embrioni di topo a E9.5 e fasi successive di sviluppo. Espianto embrionale o gli embrioni vengono poi coltivate o da sinistra a sviluppare ulteriormente in utero. Questi farmaci comprendono coloranti fluorescenti, virus, shRNAs, o cellule staminali progenitrici di cellule di derivazione. I nostri metodi permettono la conservazione del function dell'organo durante il monitoraggio della migrazione e il destino delle cellule marcate e / o iniettati. Queste tecnologie possono essere estesi ad altri organi e sarà molto utile per affrontare le questioni biologiche fondamentali in biologia dello sviluppo.
Introduction
Più di un decennio fa, le cellule staminali embrionali umane (HuESCs) sono state derivate da blastocisti umane 1. Da allora, queste cellule sono diventati oggetto di un importante campo di ricerca che affronta le domande insoddisfatte in biologia dello sviluppo umano. HuESCs hanno inoltre fornito speranze nella medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) sono stati generati da cellule somatiche paziente-specifiche, fornendo modelli di malattia genetica 2. Molti protocolli in vitro per la differenziazione delle cellule staminali embrionali pluripotenti indotte o verso varie linee cellulari, comprese le linee del cuore 3, sono stati segnalati. Le cellule differenziate sono spesso caratterizzati fenotipicamente mediante analisi di RNA e proteina espressione, immunostaining, e / o nei test funzionali in vitro. Tuttavia, i derivati di cellule staminali pluripotenti devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato per verificare se essi acquisiscono pienamente il cell destino della loro controparte embrionale e se ricapitolano la vera funzione in vivo in risposta alle indicazioni regionali. Mentre l'ingegneria dei tessuti è promettente, ma non fornisce ancora tutti i segnali noti e sconosciuti di una corretta in vivo di sviluppo tessuto embrionale 4,5.
Etichettatura delle cellule con coloranti o vettori retrovirali in embrioni, compresi embrioni di topo, hanno portato importanti informazioni circa l'origine embrionale delle linee cellulari durante lo sviluppo cardiaco 6. Ad esempio, tingere iniezione nello spazio pericardico di embrioni di topo ex vivo, seguita da coltura in vitro di cuori isolati, è stato utilizzato per marcare cellule epicardici ed i loro discendenti 7. Tuttavia, tintura e l'etichettatura delle cellule retrovirali sono stati per lo più applicate agli embrioni precoci di topo con gli organi ancora poco sviluppate, o embrioni di pollo, che sono più facilmente accessibili 8. Un'eccezione è il cervello, che è più facile bersaglio in embryos 9,10. Tale approccio non è stato ancora applicato al battere del cuore embrionale del mouse.
Per completare l'etichettatura diretta con coloranti o virus e di effettuare lineage tracing in embrioni di topo fase più avanzata e topi adulti, l'approccio di etichettatura delle cellule è stato combinato con l'analisi di topi transgenici che utilizzano la tecnologia Cre / Lox. L'approccio Cre / Lox 11 presenta tuttavia alcune limitazioni dovute alla specificità spazio-temporale delle regioni regolatorie genomiche utilizzate per guidare l'espressione della ricombinasi, e l'efficienza della ricombinazione Cre / Lox 12. Inoltre, questo approccio non risolve appieno le domande specifiche della cella migrazione guidata acquisizione del destino delle cellule in quanto si può etichettare solo un precursore dopo l'attivazione della regione regolatoria utilizzato per guidare l'espressione Cre. Inoltre, non può applicarsi agli embrioni umani per ovvie questioni etiche.
Date queste limitazioni, abbiamo progettato una serie di nuovi protocols per iniettare una varietà di agenti di etichettatura cella come coloranti fluorescenti, virus, modulatori dell'espressione genica come shRNAs e vettori etichettatura cella basate sul DNA, o cellule nell'embrione mouse sul E9.5 e stadi di sviluppo in regioni oggetto della cuore.
Le iniezioni di DNA / cellulari utilizzano uno stereomicroscopio e un semplice dispositivo di microiniezione combinato con ex vivo coltura degli embrioni fino a 48 ore, o di cuore isolato o di cultura espianto embrionale per 48-72 ore. Segnaliamo anche un protocollo microiniezione ecografia-mediata in topo cuori embrionali in utero. Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo degli embrioni 13 e consente a lungo termine di follow-up dei injectates e / o cellule marcate.
Abbiamo trovato che questi approcci conservazione della funzione dell'organo e forniscono un ambiente più rappresentativo di test in vitro di cellule staminali potenziale. Esso prevede inoltre la possibilità di seguire la migrazionedi etichettatura e / o iniettato cellule per monitorare il loro destino. In definitiva, questo dovrebbe garantire una migliore comprensione di patterning tessuto regionale e processi biologici chiave.
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Protocol
1. Preparazione
Procedure sugli animali
Ottenere l'approvazione di un comitato etico animale e seguire le linee guida istituzionali per il lavoro con il virus, HuESC e / o iPSC (se applicabile), così come la gestione del mouse, l'ottenimento di embrioni di topo, ed eseguire un intervento chirurgico mouse. Per accoppiamenti temporizzati, il giorno della spina è considerato giorno embrionale (E) 0,5 / 0,5 giorni dopo coitum.
- Aghi microiniezione:
Per gli ex utero microiniezione, tirare pipette di vetro (tubi di diametro borosilicato capillari esterni 1,2 millimetri) con un estrattore pipetta / beveller per ottenere un micron di diametro punta interno 1 o 10 e una forma punta acuminata e conica per iniettare il DNA o le celle, rispettivamente. Per le iniezioni ultrasuoni-mediata, l'uso personalizzato aghi sterili, che hanno un diametro esterno / interno (OD / ID) di 1,14 mm/0.53 mm, con una punta di 50/35 micron OD / ID. - Piatti Silicon-riempite Petri:
Preparare silicio come descritto nel manuale. Riempireuna capsula di Petri del diametro di vetro pulito 60 con uno strato di elastomero ~ 1 cm. Evitare bolle d'aria. - Strumenti:
Tenere tutti gli strumenti chirurgici sterili, prima e durante la procedura. - Preparazione del DNA:
Aggiungere 3 g DNA e 12 microlitri Opti-MEM in un tubo. Aggiungere 3 ml Lipofectamine 2000 e 12 microlitri Opti-MEM in un altro tubo. Incubare per 5 min a temperatura ambiente e mescolare entrambe le soluzioni. Utilizzare immediatamente. - Preparazione cellulare:
Preparare una sospensione di 10 6 cellule / ml DMEM (Dulbecco Eagle Medium, alte concentrazioni di glucosio e siero di ratto 50%). 50 microlitri di sospensione cellulare finale è sufficiente per 8-10 embrioni. - Dye preparazione:
Utilizzare il verde fluorescente CDCFDA-SE a 25 mg / ml di DMSO. Preparare 20 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C. Diluire 1:100 / 1:200 in soluzione fisiologica sterile o PBS prima dell'uso. - Preparazione di virus:
Utilizzare uno spot generazione 3 ° PGK-GFP che esprimono lentivirus con un titolo di ~ 10 9 -10 10 TRAnsducing unità / ml DMEM. Per la preparazione dei lentivirus, vedere Tiscornia et al. 14 Indossare indumenti protettivi ed utilizzare in modo sicuro e smaltire virus.
2. Insieme di E9.5 e E10.5 embrioni per Ex vivo iniezione
- Euthanize un topo gravide al giorno embrionale 9.5 o 10.5.
- Sterilizzare il torace e l'addome del mouse con il 70% di etanolo.
- Effettuare una incisione mediana ventrale per aprire l'addome e recuperare il corno uterino a temperatura ambiente in PBS e trasferirlo dopo due lavaggi PBS ad un piatto di silicone riempito di Petri con M16 medie.
- Pin il corno uterino con perni insetti allo strato di silicone in modo che il lato vascolarizzata dell'utero è in basso.
- Tagliare la superficie dell'utero con una pinza sottile, e un tappo del decidua a 1 mm sotto la superficie.
- Richiamare delicatamente l'embrione nel sacco vitellino, diffondendo le pareti della decidua.
- Conservare gli embrioni a 37 °; C in M16 mezzo prima iniezione di cellule. Per l'iniezione, ogni embrione viene trasferito al piatto di silicone riempito con M16 medio pre-riscaldato a 37 ° C.
3. DNA o l'iniezione di cellule allo stereomicroscopio
- Riempire la pipetta di vetro dal retro con una siringa Hamilton e scuotere la pipetta per rimuovere le bolle sulla punta.
- Impostare la pipetta sul supporto microiniezione; impostare la pressione di mantenimento di 50 (DNA) o 30 (celle) hPa, e la pressione di iniezione di 150 (DNA) a 300 (cellule) hPa. Impostare il tempo di iniezione di 0,2 sec (DNA) o 0,5 sec (celle). Queste impostazioni potrebbero variare leggermente a seconda del tipo di microinjector e pipetta.
- Pin l'embrione al fondo silicone attraverso il sacco vitellino senza toccare l'embrione corretta. Guarda la regione del cuore e aprire la sacca appena sopra questa regione.
- Aggiungere 4 pin in tutto l'embrione per evitare qualsiasi movimento durante l'iniezione di cellule.
- Utilizzando il micromanipolatore (impostato su manuale), slowly posizionare la punta della pipetta con un angolo di 45 ° al di sopra del pericardio, appena sopra la regione del cuore che deve essere iniettato (Figura 1).
- Spostare la pipetta nella regione di interesse e attivare l'iniezione. Estrarre la pipetta il più rapidamente possibile. Assicurarsi che il cuore sta battendo correttamente dopo l'iniezione di DNA / cellula.
4. Embryo, isolato Cuore, e Espianto Cultura
- Coltura gli embrioni E9.5 a 25% M2 medio e siero di ratto 75%, addizionato con penicillina / streptomicina, pre-riscaldato a 37 ° C e ossigenata con 40% O 2.
- Aggiungere 2 ml di terreno di coltura in una provetta di vetro da 25 ml, aggiungere delicatamente l'embrione, e ossigenato con il 40% O 2, prima di avvitare il tappo sul tubo. Incubare fino a 36 ore a 37 ° C durante la rotazione o agitazione (30 giri / min).
- Al punto di tempo desiderato (ad esempio 24 ore), sezionare i cuori accuratamente con una pinza sottile, senza toccare i cuori, per prima decapitating gli embrioni; il cuore è facile da accise estraendolo con il tratto di efflusso distale.
- Cultura cuore isolato per un altro 36-48 ore in DMEM con 50% FCS su un inserto Matrigel rivestite ambientato in un 12-pozzetti. Per un protocollo di miglioramento della cultura del cuore 15 Vedi Dyer e Patterson (2013).
- Fare qualsiasi espianto della regione di interesse. Come esempio, sezionare il canale atrio-ventricolare (AVC) e coltura per 48 ore a collagene di tipo 1 gel 16.
5. Iniezione Ultrasound-guida nel Cuore I n utero
- Impostazione della macchina ad ultrasuoni e microinjector:
- Utilizzare il sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione con un trasduttore 40 MHz e la configurazione microiniezione su un binario.
- Impostare il volume di iniezione sul microinjector a 69 nl per iniezione. Consultare il manuale microiniezione del produttore per la programmazione microinjector.
- Preparazione del microiinstallazione njection ed iniezione:
- Posizionare una micropipetta di vetro nel microinjector. Per assicurare un efficiente iniezione, prima mano il lato interno della pipetta con olio minerale aspirando fino al volume massimo. Quindi espellere nuovamente l'olio, lasciando 1-2 mm di olio all'interno dell'ago.
- Aspirare l'iniettato fino a raggiungere il volume massimo. Fare attenzione a non toccare le superfici con la punta dell'ago come questo smussare la punta e rendere più difficile l'iniezione.
- Per stabilizzare il corno uterino contenente gli embrioni durante l'iniezione, utilizzare un piatto Petri modificato con un foro nel mezzo (diametro 2,5 cm), coperto da una membrana di silicone sottile con una piccola fessura tagliata al centro, e posizionarlo sopra il sito di incisione . Stabilizzare il piatto Petri sul tavolo gestione del mouse posizionando 3-4 ciuffi di argilla sotto i bordi del piatto.
- Procedura di iniezione:
- Radere l'addome di un topo in stato di gravidanza (allo stadio embrionale desiderato) prima di anestesiaSia per eliminare i peli. Trattare l'addome con un agente depilazione chimica per rimuovere capelli residuo e sterilizzare con il 70% di etanolo.
- Anestetizzare un mouse incinta con ossigeno / isoflurano tramite una maschera. Utilizzare 3-5% isoflurano in ossigeno al 100% per anestesia, seguita da 1-1,5% durante il resto della procedura. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato da pizzicando delicatamente le zampe e / o coda.
- Posizionare il supina mouse sulla tabella gestione del mouse (impostato per riscaldare a 37 ° C) e coprire gli occhi con lubrificante per prevenire la disidratazione della cornea.
- Applicare il gel per elettrodi sugli elettrodi e nastro le zampe agli elettrodi per monitorare la frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, e l'ECG. Posizionare un termometro rettale per controllare la temperatura corporea.
- Verificare prima che il mouse è incinta visualizzando e contando gli embrioni con l'ecografia. Applicare il gel per ultrasuoni sull'addome e posizionare la testina di scansione sopra la vescica. Per coerenza, visualizzare la vescica prima,e contare embrioni in fianco e corna uterine destra, a partire dalla posizione della vescica. Assicurarsi che i cuori embrionali battono normalmente.
- Se il mouse è incinta, posizionare la capsula di Petri sopra il futuro sito di incisione con l'argilla. Premere il piatto leggermente sul ventre in modo che il piatto è in contatto diretto.
- Rimuovere il piatto e sterilizzare nuovamente l'addome. Fare un 1,5-2 cm linea mediana ventrale incisione, a circa 0,75-1 cm al di sopra della vagina, per aprire l'addome e del peritoneo. Evitare lesioni agli organi interni.
- Esteriorizzare sinistra o corno uterino destra con le pinze, tirare delicatamente attraverso la membrana di silicone del piatto, e stabilizzare nuovamente il piatto in argilla. Prevenire vasta tirare o manipolazione, in quanto ciò potrebbe causare sanguinamento dei vasi uterini e la morte prematura del femminile e / o embrioni.
- Contare di nuovo gli embrioni per garantire un'adeguata tenuta dei registri di cui embrioni sono stati iniettati.
- Applicare il gel per ultrasuoni sulla ucorni terine per l'immagine del cuore e per prevenire la disidratazione.
- Immagine il primo embrione da iniettare. Controllare il normale battito del cuore embrionale e tenere un registro di orientamento cranio-caudale e sinistra-destra dell'embrione. Se necessario, riposizionare il corno uterino leggermente per assicurare il corretto orientamento. Se questo risulta difficile, passare al successivo dell'embrione.
- Perforare l'utero accuratamente con l'ago microiniezione per posizionare l'ago in un angolo di 45 ° sopra l'embrione, leggermente al di fuori del pericardio (Figura 3). Per l'etichettatura di cellule epicardico immagine cuore in quattro camere e posizionare l'ago in modo che punti verso il solco atrio-ventricolare (Figura 3). Se l'angolo deve essere regolato, estrarre l'ago e riposizionare. Non regolare l'angolazione con l'ago all'interno dell'utero, dal momento che questo potrebbe rompere l'ago. Evitare la puntura altri tessuti, come arti o placenta.
- Spostare l'agosulla parete pericardica e forare con un movimento delicato, ma veloce. In generale, ci sarà una certa resistenza, ma spostando l'ago troppo veloce può causare la punta dell'ago per perforare il cuore stesso. La punta dovrebbe finire nello spazio pericardico del solco atrio-ventricolare. In caso di sanguinamento pericardico, globuli saranno visibili come un modello neve come bianco. Se questo è il caso, fermare iniettando l'embrione e passare ad un altro embrione.
- Iniettare l'iniettato. Iniettare al massimo 700 nl nello spazio pericardico per evitare effetti negativi sullo sviluppo cuori. Monitorare l'iniezione corretta da lieve, gonfiore temporale del sacco pericardico.
- Dopo iniezione, estrarre l'ago e confermare che iniettato può ancora essere espulso per assicurare che l'ago non è ostruito da frammenti di tessuto.
- Riposizionare la tabella di gestione per l'immagine e iniettare il prossimo embrione. Mantenere il numero di embrioni iniettati ad un massimo di 3-4 (in un corno uterino) per impedireanestesia esteso, per consentire embrioni di controllo nel corno uterino opposto, e per assicurare che la procedura non disturbare sviluppo embrionale.
- Dopo aver iniettato il numero desiderato di embrioni, rimuovere gel ultrasuoni eccesso e posizionare delicatamente il corno uterino nuovamente dentro l'addome nella posizione corretta.
- Chiudere dell'addome materno, utilizzando uno strato di sutura per peritoneo e muscoli addominali, e un secondo strato di sutura per la pelle.
- Iniettare il mouse con la prima dose di farmaci antidolorifici. Utilizzare una iniezione di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina 15 minuti prima di terminare anestesia e tre iniezioni supplementari con intervalli di 12 ore.
- Interrompere l'anestesia e monitorare il mouse per un adeguato recupero dalla procedura. Casa il mouse incinta in una gabbia individuale per la durata desiderata di follow-up.
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Representative Results
Utilizzando i protocolli di iniezione sopra descritti, le cellule possono essere etichettati e / o iniettati nel cuore embrionale mouse. Come prova di concetto, alcuni esempi sono riportati in cui il protocollo di iniezione e la ex vivo AVC espianto, isolato cuore, o tutta la cultura embrioni sono stati combinati (Figura 1).
La Figura 1 mostra la preparazione dell'embrione prima dell'iniezione delle cellule. L'embrione E9.5 viene estratto dalla decidua mantenendo l'integrità del sacco vitellino (Figura 1A). Il sacco vitellino viene aperto appena sopra il cuore (Figura 1B). La pipetta viene avvicinato (Figura 1C) e le cellule iniettate. Il cuore mantiene la sua forma (Figura 1D) e rimane pestaggio.
Per risolvere un problema biologico più specifico in biologia dello sviluppo come la epiteliale di transizione mesenchima (EMT), un espianto E9.5 AVC è stato iniettato con una shRNA che down-regola una proteina necessaria per endoteliale-mesenchimale transizione di cellule endocardico (Figura 2A). L'embrione controllo è stato iniettato con una dorsale vettore vuoto. Analogamente, tonalità derivati dalle cellule endoteliali cellule pre-valvolari esprimenti GFP sotto il controllo del promotore Sox9 stati iniettati nel AVC a E10.5, seguita da 48 ore espiantato cultura cuore. Queste cellule acquisiscono marcatori di EMT come periostin simili alle cellule endocardici endogene (Figure 2B e 2C).
Questi approcci ex vivo sono relativamente facili, ma limitati a breve termine di follow-up (massimo di 48-72 ore). La procedura di iniezione ecoguidata fornisce un approccio tecnicamente più impegnativo, ma con l'opzione di lungo termine, anche post-natale, in utero follow-up. L'iniezione in utero di colorante o vettori virali per marcare cellule in specifiche regioni cardiaci è mostrato nelle figure 3A-3 C. Con questo metodo, marcatura specifica di cellule epicardici può essere ottenuto con coloranti fluorescenti (figure 3D e 3E) o virus (Figura 3F), e il metodo può essere estesa, con cellule o injectates alternativi.
Iniezione Figura 1 Cella nel cuore A:... E9.5 embrione nel sacco vitellino B: visualizzazione del cuore dopo l'apertura del sacco vitellino appena sopra il cuore. L'inserto sotto mostra un ingrandimento del cuore e indica il canale AV C:. Approccio della pipetta verso la D AVC:. Iniettato embrione dopo 48 cultura hr (H = cuore).
. Figura 2 Iniezione di un shRNA nel AVC di un embrione E9.5 che impedisce ex vivo di cellule EMT endocardico in un espianto cardiaco A:. Controllo vettoriale backbone o un shRNA stato iniettato insieme lipotectamine nel AVC di un E9.5 embrione di topo; 3 ore dopo, l'AVC è stato dissezionato fuori e cresciuto su un gel di collagene per innescare EMT delle cellule endocardici. Il shRNA downregolato una proteina che è richiesta per EMT aC:. Tonalità cellule derivate cellule valvolari ingegnerizzate per esprimere GFP sotto il controllo del promotore Sox9 stati iniettati nel AVC di embrioni E10.5. Il cuore è stato coltivato per 2 giorni (B), e successivamente fissate e colorate con un anticorpo anti-periostin (C). L'inserto mostra un ingrandimento della regione AVC.
.. Figura 3 Nel iniezione utero A: schema raffigurante il setup sperimentale. Il mouse incinta è posizionato in posizione supina e un piatto di Petri con membrana in silicone è stabilizzato al di sopra del sito di incisione. . 1 = microinjector, 2 = trasduttore, 3 = piatto di Petri con membrana in silicone, 4 = gel per ultrasuoni, 5 = mouse con corna uterine (rosso), 6 = Play-Doh argilla, 7 = topo tabella di gestione B: ancora fotogramma di un film ultrasuoni (modo M) mostra la posizione dell'ago e cuore embrionale prima dell'iniezione. L'ECG femminile viene mostrato in basso (verde), e il cuore e il tasso di respirazione in basso a destra (giallo). H = cuore C:. Immagine ad ultrasuoni che mostra la posizione dell'ago e cuore embrionale durante l'iniezione. Inserto: la punta ha superato il pericardio, ma non toccare il miocardio, in modo che l'iniezioneate può essere iniettato nello spazio pericardico del solco atrio-ventricolare. Le linee nere tratteggiate segnano i confini della atrio (A) e il ventricolo (V) D:. Tutta montare l'immagine di un embrione di topo E11.5 mostra una forte fluorescenza del colorante nello spazio pericardico E:. Sezione rappresentativa di un E11.5 cuore del mouse embrionale mostra marcatura delle cellule e pericardico epicardico con un colorante fluorescente (CDCFDA-SE, verde) 4 ore dopo l'iniezione. I nuclei sono etichettati con DAPI (blu). LA = atrio sinistro, LV = ventricolo sinistro, RA = atrio destro, RV = ventricolo destro F:. Sezione rappresentativa di un cuore embrionale del mouse E14.5 mostra etichettatura delle cellule epicardico mosaico con GFP che esprimono lentivirus 3 giorni dopo l'iniezione. Per confermare la specificità GFP, la proteina GFP era macchiato con un anticorpo GFP (rosso). I nuclei sono etichettati con DAPI (blu).
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Discussion
I protocolli intra-cardiaca ex vivo di iniezione sopra descritti sono stati concepiti per preservare la funzione miocardica per almeno 48 ore in mid-stage (E9.5-E11.5) embrioni di topo. Questi approcci iniezione consentire l'iniezione spazialmente mirato di DNA o cellule. I pochi esempi riportati nelle figure 1-3 forniscono la prova di concetto per delineare ex vivo e in vivo dei meccanismi molecolari dei processi di sviluppo che si svolgono in regioni ristrette cardiaci, come EMT delle cellule endocardiche o epicardiche. Soprattutto, questi protocolli offrono l'opportunità di seguire la migrazione e il destino delle cellule iniettate come le cellule embrionali umane o derivati huESC in un ambiente embrionale adeguato, una sfida finora insoddisfatte. Nel etichettatura vivo (come le cellule epicardiche in figura 3) con saturazione o limitare diluizioni di colore o virus consente di lineage tracing dei cellulari (sotto) popolazioni su un breve e lungo termine basis, senza la necessità di tecnologia Cre / lox (sebbene combinazione di queste tecniche può essere utile come ben).
Sono stati osservati diversi passaggi critici, mentre applicando questi protocolli. In primo luogo, gli embrioni sono molto sensibili alla luce. Pertanto si raccomanda di praticare il protocollo di iniezione allo stereomicroscopio in modo che la procedura può essere eseguita con elevata riproducibilità ed efficienza entro 15 min per embrione. Nella stessa linea, l'intera procedura di iniezione ultrasuono-mediata deve essere effettuata entro 30 min conservare una buona vitalità degli embrioni e per non compromettere il loro sviluppo in utero. Manipolazione dell'utero dovrebbe essere ridotto al minimo. Inoltre, va notato che la chirurgia su topi incinta tende a causare parto prematuro (1-2 giorni prima del normale). Tuttavia, i neonati dovrebbero essere generalmente sani e svilupparsi normalmente. Inoltre, la penetrazione della pipetta attraverso la parete uterina, il sacco vitellino e l'embrioneper raggiungere il pericardio e infine il miocardio è una procedura delicata (passo 5.3.13). Questo passo dovrebbe essere fatto con attenzione e delicatezza. Per l'ottimizzazione, si consiglia di eseguire diverse iniezioni di colorante a breve termine per determinare la riproducibilità ed escludere l'iniezione in zone non mirati. Infine, non abbiamo trovato difetti cardiaci sviluppo riguardanti le procedure di iniezione per gli esempi precedenti. Tuttavia, un più dettagliato, stage-by-stage, analisi morfologica e funzionale deve essere effettuata per accertare completamente lo sviluppo e la normale funzione durante le fasi di interesse.
I limiti di queste tecnologie sono diverse. (I) L'iniezione sotto lo stereomicroscopio è limitata dalla sensibilità alla luce e temperatura degli embrioni di topo. Questo può essere superato dalla pratica della procedura microiniezione in modo da essere il più veloce possibile, regolarmente sostituzione o il riscaldamento del mezzo, e lavorando in una stanza buia. (Ii) L'ex vivo coltura di embrioni o espianti è limitata nel tempo, in contrasto con l'iniezione in utero ecografico, che consente a lungo termine di follow-up. Coloranti vitali tendono a marcare cellule quasi immediatamente e rimangono visibili fino a tre o quattro giorni dopo l'iniezione. Tuttavia, l'intensità del colorante sarà diluito da divisioni cellulari successive. Etichettatura cellule con lentivirus può superare questo problema. Tuttavia, l'assorbimento del virus richiede diverse ore e l'espressione è ottimale dopo 24-48 ore, che impedisce un'analisi a breve termine. (Iii) L'iniezione ultrasuono-mediata è limitata dal costo delle attrezzature. La risoluzione del trasduttore 40 MHz è sufficiente per metà ed embrioni in fase avanzata, ma più limitante per le fasi prima E11.5.
In sintesi, proponiamo che i protocolli di iniezione cardiaci di cui sopra devono essere utilizzati in embrioni metà stadio del mouse. La tecnica ex vivo è compatibile con la coltura di embrioni, cuori isolati, o espiantos. La procedura in vivo permette di follow-up a lungo termine, compreso lo sviluppo post-natale. Queste tecniche significativo aiuto nel testare il potenziale di differenziazione dei derivati di cellule staminali umane in un ambiente adeguato, nonché per affrontare specifiche questioni di biologia dello sviluppo come la migrazione cellulare e segnali regionali, che sono eventi chiave nella strada verso plasmare un cuore funzionale . Inoltre, i nostri metodi e quelle degli altri 10 maggio in futuro essere utilizzati per le indagini di altri organi di cuore, dipendenti protocolli disponibili ex vivo di cultura e / o stadio di sviluppo in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono la Fondazione Leducq (valvola mitrale) e l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR concedere Specistem) per il finanziamento di questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
