Summary
Vi beskriver en rad metoder för att injicera färgämnen, DNA-vektorer, virus och celler i syfte att övervaka både cell öde och fenotyp av endogena och transplanterade celler från embryon eller pluripotenta celler i musembryon på embryonala dag (E) 9.5 och senare skeden av utveckling.
Abstract
Testa öde embryon eller pluripotenta stamceller-derivat i in vitro-protokoll har lett till kontroversiella resultat som inte nödvändigtvis speglar deras in vivo-potential. Företrädesvis bör dessa celler placeras i en lämplig embryonal miljö i syfte att förvärva sin definitiva fenotypen. Dessutom har cellens härstamning spåra studier i musen efter märkning av celler med färgämnen eller retrovirusvektorer förblev mestadels begränsad till tidigt skede musembryon med fortfarande dåligt utvecklade organ. För att övervinna dessa begränsningar, utformade vi standard-och ultraljud-medierad mikroinjektion protokoll för att injicera olika ämnen i utvalda regioner i hjärtat i musembryon vid E9.5 och senare stadier av utveckling. Embryonala explant eller embryon odlas sedan eller vänster för att ytterligare utvecklas i livmodern. Dessa medel innefattar fluorescerande färgämnen, virus, shRNAs eller stamcellshärledda progenitorceller. Våra metoder kan för bevarandet av helanktion av orgeln medan övervakningen migration och öde märkta och / eller injicerade cellerna. Dessa tekniker kan utsträckas till andra organ och kommer att vara till stor hjälp för att ta itu med viktiga biologiska frågor inom biologi utveckling.
Introduction
Mer än ett decennium sedan, har humana embryonala stamceller (HuESCs) härstammar från mänskliga blastocyster 1. Sedan dess har dessa celler blivit föremål för ett viktigt forskningsområde som behandlar otillfredsställda frågor i människans utvecklingsbiologi. HuESCs har dessutom förutsatt hopp inom regenerativ medicin. Under de senaste åren har mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genererats ur patientspecifika somatiska celler, ger modeller för genetisk sjukdom 2. Många in vitro-protokoll för differentiering av embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller mot olika cellinjer, inklusive hjärt linjerna 3, har rapporterats. De differentierade cellerna ofta phenotyped genom analys av RNA-och proteinuttryck, immunfärgning och / eller in vitro-funktionella test. Men pluripotenta stamceller derivat måste placeras i en lämplig embryonal miljö för att testa om de fullt ut förvärva cell öde deras foster-motsvarighet och om de rekapitulera det genuina in vivo-funktion som svar på regionala ledtrådar. Även vävnadsteknik är lovande, inte ännu ge det alla kända och okända signaler av rätt in vivo utvecklings embryonal vävnad 4,5.
Cellmärkning med färgämnen eller retrovirusvektorer i embryon, inklusive musembryon, har fört viktig information om den embryonala ursprung cell linjer under hjärt utveckling 6. Exempelvis dye injektion i perikardiell utrymmet av musembryon ex vivo, följt av in vitro-odling av isolerade hjärtan, användes för att märka epikardiella celler och deras avkomma 7. Men färg och retroviral cell märkning har främst tillämpats på tidiga musembryon med fortfarande dåligt utvecklade organ, eller kycklingembryon, som är mer lättillgängliga 8. Ett undantag är hjärnan, som är lättare att rikta in embryos 9,10. Ett sådant tillvägagångssätt har ännu inte tillämpats på det slå embryonala mus hjärta.
För att komplettera direkt märkning med färgämnen eller virus och utföra härstamning spåra i mer avancerade scen musembryon och vuxna möss, har det tillvägagångssätt cellmärkning kombinerats med analys av transgena möss med hjälp av Cre / Lox-teknik. Cre / Lox metod 11 har dock vissa begränsningar på grund av den spatiotemporal specificiteten för de genomiska regulatoriska regioner som används för att driva uttrycket av rekombinaset, och effektiviteten av Cre / Lox rekombination 12. Vidare innebär detta tillvägagångssätt inte helt motverka specifika frågor av cellmigration driven förvärv av cell öde som det bara kan märka en prekursor efter aktivering av den reglerande regionen för att driva Cre uttryck. Det kan inte heller tillämpas på mänskliga embryon av uppenbara etiska frågor.
Med tanke på dessa begränsningar, konstruerade vi en rad nya protocols att injicera en mängd olika cellmärkningsmedel såsom fluorescerande färgämnen, virus, genuttryck modulatorer såsom shRNAs och DNA-baserad cellmärkning vektorer, eller celler i musen embryot vid E9.5 och senare stadier av utveckling i utvalda regioner i hjärta.
De DNA / cell injektioner använder ett stereomikroskop och en enkel mikroinjektion anordning i kombination med ex vivo embryokultur upp till 48 timmar, eller isolerade hjärta eller embryonala Explantation kultur för 48-72 timmar. Vi rapporterar också ett ultraljud-medierad mikroinjektion protokoll i mus embryonala hjärtan i livmodern. Denna teknik gör det möjligt att följa utvecklingen av embryon 13 och möjliggör långsiktig uppföljning av injectates och / eller märkta celler.
Vi fann att dessa metoder bevara funktionen hos organ och ge en mer representativ miljö än in vitro-testning av stamcellspotential. Det ger också möjlighet att följa migrationenav märkt och / eller injicerade cellerna att övervaka deras öde. Ytterst bör detta ge en bättre förståelse av den regionala vävnads mönstring och viktiga biologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse
Djur förfaranden
Få godkännande från ett djur etisk kommitté och följa institutionens riktlinjer för arbete med virus, HuESC och / eller iPSC (i förekommande fall), samt hantering mus, få musembryon, samt utföra mus kirurgi. För tidsinställda parningar är dagen av pluggen betraktas embryonala dag (E) 0,5 / 0,5 dagar efter coitum.
- Mikroinjektion nålar:
För ex utero mikroinjektion, dra glaspipetter (1,2 mm yttre borsilikat diameter kapillärrör) med användning av en pipett avdragare / beveller att få en 1 eller 10 | im inre spetsdiameter och en skarp och konisk spetsform för att injicera DNA eller celler, respektive. För ultraljud-medierad injektioner, använda anpassade sterila nålar, som har en yttre / inre diameter (OD / ID) på 1,14 mm/0.53 mm, med en 50/35 um YD / ID-spets. - Kisel-fyllda petriskålar:
Förbered kisel som beskrivs i handboken. Fyllett rent glas 60 mm diameter petriskål med en elastomer lager av ~ 1 cm. Undvik luftbubblor. - Instrument:
Håll alla kirurgiska instrument sterila före och under förfarandet. - DNA-preparation:
Lägg 3 pg DNA och 12 | il Opti-MEM i ett rör. Lägg 3 xl Lipofectamine 2000 och 12 | il Opti-MEM i ett annat rör. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur och blanda de båda lösningarna. Använd omedelbart. - Cell förberedelse:
Bered en suspension av 10 6 celler / ml DMEM (Dulbeccos Eagle medium, hög glukos och 50% råttserum). 50 | il av den slutliga cellsuspensionen räcker till 8-10 embryon. - Dye förberedelser:
Använd det grönt fluorescerande CDCFDA-SE vid 25 mg / ml DMSO. Förbered 20 l alikvoter och förvara vid -20 ° C. Späd 1:100 / 1:200 i steril koksaltlösning eller PBS före användning. - Virus förberedelse:
Använd en kommersiell 3: e generationens PGK-GFP-uttryck lentivirus med en titer av ~ 10 9 -10 10 transducing enheter / ml DMEM. För beredning av lentivirus, se Tiscornia et al. 14 Använd personlig skyddsutrustning och säkert använda och göra sig av med virus.
2. Insamling av E9.5 och E10.5 embryon för ex vivo-injektion
- Euthanize en gravid musen på embryonala dag 9,5 eller 10,5.
- Sterilisera bröstet och buken av musen med 70% etanol.
- Gör en ventral mittlinje snitt för att öppna buken och hämta livmoderhornet vid RT i PBS och överför den efter två PBS-tvättar till en silikon-fyllda petriskål med M16-medium.
- Klämma livmoderhornet med insekt stift till silikonskiktet så att vaskulariserad sidan av livmodern är i botten.
- Skär ytan av uterus med fin pincett, och ett lock av decidua vid 1 mm under ytan.
- Hämta försiktigt embryot i gulesäcken genom att sprida ut på väggarna i decidua.
- Förvara embryona vid 37 °; C i M16-medium före cellinjektion. För injektion är varje embryo överförs till silikonskål fylld med M16-medium förvärmas vid 37 ° C.
3. DNA eller cellinjektion under ett stereomikroskop
- Fyll ett glas pipett från baksidan med en Hamilton spruta och skaka pipetten för att ta bort bubblor i spetsen.
- Ställ pipetten på mikroinjektion-hållare; ställa in hålltryck till 50 (DNA) eller 30 (celler) hPa, och insprutningstrycket till 150 (DNA) till 300 (celler) hPa. Ställ in insprutningstiden till 0,2 sek (DNA) eller 0,5 sekunder (celler). Dessa inställningar kan variera något beroende på vilken typ av microinjector och pipett.
- Klämma embryot till silikon botten genom gulesäcken utan att vidröra embryot korrekt. Titta regionen hos hjärtat och öppna säcken strax ovanför denna region.
- Lägg 4 stift runt embryot för att förhindra varje rörelse under cellinjektion.
- Använda mikromanipulator (inställd på manuell), slowly-position pipettspetsen under en vinkel av 45 ° över hjärtsäck, precis ovanför området av hjärtat som skall injiceras (Figur 1).
- Flytta pipetten in i regionen av intresse och utlösa injektionen. Ta ut pipetten så snabbt som möjligt. Se till att hjärtat är rätt att slå efter DNA / cell injektion.
4. Embryo, isolerat hjärta, och Explantation kultur
- Kultur på E9.5 embryon i 25% M2 medium och 75% råttserum, kompletterat med penicillin / streptomycin, förvärmda vid 37 ° C och syresatt med 40% O 2.
- Lägg 2 ml odlingsmedium i ett 25 ml provrör, försiktigt lägga till embryot, och oxygenat med 40% O 2 före skruvning av locket på röret. Inkubera upp till 36 timmar vid 37 ° C under rotation eller skakning (30 rotationer / min).
- Vid önskad tidpunkt (t.ex. 24 timmar), dissekera hjärtan försiktigt med fin pincett, utan att röra hjärtan, genom att först decapitating embryon; hjärtat är lätt att punktskatt genom att dra ut den med hjälp av den distala utflöde.
- Kultur den isolerade hjärta för en annan 36-48 timmar i DMEM med 50% FCS på en Matrigel belagd insats i en 12-brunnar. Se Dyer & Patterson (2013) för ett förbättrat protokoll för hjärt kultur 15.
- Gör något explantat av regionen av intresse. Som ett exempel, dissekera atrioventrikulär kanalen (AVC) och kultur till 48 tim på kollagen typ 1 gel 16.
5. Ultraljud-styrd Injektion i hjärtat I n utero
- Inställning av ultraljud maskin och microinjector:
- Använd den högupplösta ultraljudssystem med en 40 MHz-givare och mikroinjektion setup på en skena.
- Ställ injektionsvolym på microinjector vid 69 nl per injektion. Se tillverkarens mikroinjektion manual för programmering microinjector.
- Beredning av microinjection inställning och injektion:
- Placera en glasmikropipett i microinjector. För att säkerställa effektiv injektion, först belägga den inre sidan av pipetten med mineralolja genom att suga upp till den maximala volymen. Sedan mata ut oljan igen och lämnar 1-2 mm av olja inuti nålen.
- Sug injektatet tills maximal volym uppnåtts. Var noga med att inte vidröra någon yta med nålspetsen eftersom detta kommer trubbig spets och göra injektionen svårare.
- För att stabilisera livmoderhornet innehållande embryona under injektion, använd en modifierad petriskål med ett hål i mitten (2,5 cm i diameter), som täcks av en tunn silikonmembran med en liten skåra skuren i mitten och placera den över snittstället . Stabilisera petriskål om hantering musen tabellen genom att placera 3-4 klumpar av lera i kanterna på skålen.
- Injektionsproceduren:
- Raka buken av en gravid mus (vid den önskade embryostadium) före anestesisia för att ta bort hår. Behandla buken med en kemisk hårborttagning agent för att avlägsna kvarvarande hår och sterilisera med 70% etanol.
- Söva en gravid mus med syre / isofluran via en ansiktsmask. Använd 3-5% isofluran i 100% syrgas för första anestesi, följt av 1-1,5% under resten av förfarandet. Se till att musen är tillräckligt sövd genom att försiktigt klämma sina tassar och / eller svans.
- Placera musen på rygg på hanteringen mus bord (inställd för att värma vid 37 ° C) och täcker ögonen med smörjmedel för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
- Applicera elektrodgel på elektroderna och tejpar tassar på elektroderna för att övervaka hjärtfrekvens, andningshastighet, och EKG. Placera en rektal termometer för att övervaka kroppstemperaturen.
- Kontrollera först att musen är gravid genom att visualisera och räkna embryon genom ultraljud. Applicera ultraljud gel på magen och placera skanningshuvudet ovanför blåsan. För konsekvensens skull visualisera blåsan först,och räkna embryon i de vänstra och högra livmoderhornen, med start från den position av blåsan. Se till att embryonala hjärtan att slå normalt.
- Om musen är gravid, placera petriskål ovanför den framtida snitt webbplats med lera. Tryck på skålen något på magen så att skålen är i direkt kontakt.
- Ta ut skålen och sterilisera buken igen. Gör en 1,5-2 cm ventrala mittlinjen snitt, ca 0,75-1 cm ovanför slidan, för att öppna buken och bukhinnan. Undvik skador på inre organ.
- Exteriorize vänster eller höger livmoderhorn med pincett, försiktigt dra den genom silikonmembranet av skålen, och stabilisera skålen på leran igen. Förhindra omfattande dra eller manipulation, eftersom det kan orsaka blödningar i livmodern fartyg och för tidig död hos kvinnor och / eller embryon.
- Räkna embryona igen för att säkerställa adekvat registrering av vilka embryon injicerades.
- Applicera ultraljud gel på uterine horn till bilden hjärtat och för att förhindra uttorkning.
- Bild den första embryo som ska injiceras. Kontrollera normal misshandeln av den embryonala hjärta och föra register över i hjärn-kaudala och vänster-höger orientering embryot. Om nödvändigt ompositionera livmoderhornet något för att säkerställa korrekt orientering. Om detta visar sig vara svårt, gå vidare till nästa embryot.
- Punktera livmodern försiktigt med mikroinjektion nålen för att placera nålen i 45 ° vinkel ovanför embryot, något utanför av hjärtsäck (Figur 3). För märkning av epikardiella celler, bild hjärtan i en fyra-kammar visa och placera nålen så att den pekar mot atrioventrikulär spår (Figur 3). Om vinkeln behöver justeras, dra ut nålen, och flytta. Justera inte vinkeln med nålen inne i livmodern, eftersom detta skulle kunna bryta nålen. Undvik att punktera andra vävnader, såsom ben eller placenta.
- Flytta nålenpå perikardiell väggen och punktera den med en mild, men snabb rörelse. I allmänhet kommer det att finnas ett visst motstånd, men att flytta nålen alltför snabbt kan orsaka att nålspetsen att punktera hjärtat självt. Spetsen ska hamna i perikardiell utrymmet på atrioventrikulär spår. I fallet med perikardiell blödning, kommer blodkroppar vara synlig som en vit snö-liknande mönster. Om detta är fallet, sluta injicera embryot och gå vidare till ett annat embryo.
- Injicera injektatet. Injicera Maximalt 700 nl i perikardiell utrymmet för att undvika negativa effekter på hjärtan utveckling. Övervaka en korrekt injektion genom lätt, temporal svullnad av hjärtsäcken.
- Efter injektion, dra ut nålen och bekräfta att injektat fortfarande kan matas ut för att se till att nålen inte var tilltäppta av vävnadsfragment.
- Flytta hanteringstabellen till bilden och injicera nästa embryot. Håll antalet injicerade embryon att maximalt 3-4 (i en livmoderhorn) för att förhindraförlängd anestesi, för att möjliggöra kontroll embryon i den motsatta livmoderhornet, och för att se till att förfarandet inte störa embryonal utveckling.
- Efter injicering av det önskade antalet embryon, avlägsna överskott av ultraljud gel och placera försiktigt livmoderhornet tillbaka in i buken i sitt rätta läge.
- Stäng mödrars buk genom användning av ett skikt av suturen för peritoneum och magmusklerna, och ett andra skikt av suturen för huden.
- Injicera musen med den första dosen av smärtstillande. Använd en injektion av 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfin 15 min före sinande anestesi och ytterligare tre injektioner med 12 timmars intervall.
- Avbryt anestesi och övervaka musen för tillräcklig återhämtning från förfarandet. Hus den gravida musen i en enskild bur för den önskade varaktigheten av uppföljning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda injektionsprotokoll som beskrivs ovan kan celler märkas och / eller sprutas in i embryonala mus hjärta. Som bevis på konceptet, är flera exempel visas i vilken injektionsprotokollet och ex vivo AVC Explantation, isolerat hjärta, eller hela embryo kultur kombinerades (Figur 1).
Figur 1 visar framställningen av embryot före cellinjektion. Den E9.5 embryo har avlägsnats från dess decidua med bibehållen integritet i gulesäcken (Figur 1A). Gulesäcken öppnas strax ovanför hjärtat (Figur 1B). Pipetten är närmade sig (Figur 1C) och cellerna injiceras. Hjärtat bibehåller sin form (figur 1D) och förblir stryk.
För att hantera en mer specifik biologisk fråga i utvecklingsbiologi, såsom epitelceller att mesenkymet övergång (EMT), var en E9.5 AVC explant injiceras med en shRNA som nedreglerar ett protein som krävs för endotel-mesenkymala övergång endokardiska celler (Figur 2A). Styr embryo injicerades med en tom ryggrad vektor. Likaså har nyanser-cellerna endotelceller före klaff celler som uttrycker GFP under kontroll av den Sox9 promotor injiceras i AVC vid E10.5, följt av 48 tim explanterade hjärta kultur. Dessa celler förvärva markörer för EMT såsom periostin liknar de endogena endokardiska celler (figur 2B och 2C).
Dessa ex vivo-metoder är relativt lätt, men begränsat till korttidsuppföljning (maximalt 48-72 timmar). Det ultraljud-styrda injektionsbehandling ger en tekniskt mer utmanande strategi, men med möjlighet till långsiktigt, även efter förlossningen, i livmodern uppföljning. Den in utero injektion av färgämne eller virala vektorer för att märka celler i specifika hj regioner visas i figurerna 3A-3 C. Med denna metod kan särskild märkning av epikardiella celler uppnås med fluorescerande färgämnen (figur 3D och 3E) eller virus (Figur 3F), och metoden kan utvidgas med celler eller alternativa injectates.
. Figur 1 Cell injektion i hjärtat A:.. E9.5 embryo i gulesäcken B: visualisering av hjärtat efter att ha öppnat gulesäcken strax ovanför hjärtat. Den infällda bilden nedan visar en förstoring av hjärtat och pekar på AV-kanalen C:. Tillvägagångssätt av pipetten mot AVC D:. Injicerade embryot efter 48 h odling (H = hjärta).
. Figur 2 Injektion av en shRNA i AVC av en E9.5 embryo som förhindrar ex vivo EMT av endokardiska celler i en hjärt Explantation A:. Kontroll ryggrad vektor eller en shRNA injicerades tillsammans med lipotectamine i AVC av en E9.5 musembryo; 3 h senare tillsattes den AVC dissekerades ut och odlas på en kollagengel för att utlösa EMT av endokardiella celler. Den shRNA nedreglerade ett protein som krävs för EMT BC:. Nyanser cellhärledda valvulär celler manipulerade för att uttrycka GFP under kontroll av den Sox9 promotorn injicerades i AVC av E10.5 embryon. Hjärtat odlades under 2 dagar (B), och därefter fixeras och färgas med en anti-periostin antikropp (C). Den infällda bilden visar en förstoring av den AVC regionen.
.. Figur 3 I livmodern injektion A: schema som visar experimentuppställning. Den gravida musen placeras i ryggläge och en petriskål med silikon membran stabiliseras ovanför snittet webbplatsen. . 1 = microinjector, 2 = givare, 3 = petriskål med silikonmembran, 4 = ultraljud gel, 5 = mus med livmoderhornen (röd), 6 = Play-Doh lera, 7 = mus hantering tabell B: stillbild av en ultraljud film (M-läge) som visar placering av nålen och foster-hjärta före injektion. Den kvinnliga EKG visas längst ner (grön), och hjärt-och andningsfrekvens i det nedre högra (gul). H = hjärta C:. Ultraljudsbild som visar läget för nålen och foster-hjärta under injektion. Infällt: spetsen har passerat hjärtsäcken, men berör inte hjärtmuskeln, så att injiceraåt kan injiceras i den perikardiell utrymmet av atrioventrikulära spåret. Svart streckade linjerna markerar gränserna för atrium (A) och kammare (V) D:. Hela montera bilden av en E11.5 mus embryo visar stark fluorescens av färgämnet i perikardiell utrymmet E:. Representativ sektion av en E11.5 embryonal mus hjärta som visar perikardiell och epikardiella cellmärkning med ett fluorescerande färgämne (CDCFDA-SE, grön) 4 timmar efter injektion. Kärnor är märkta med DAPI (blå). LA = vänster förmak, LV = vänster kammare, RA = höger förmak, RV = höger kammare F:. Representativ sektion av en E14.5 embryonala mus hjärta visar mosaik epikardiell cellmärkning med GFP-uttryck lentivirus 3 dagar efter injektionen. För att bekräfta GFP specificitet var GFP-proteinet också färgas med en GFP-antikropp (röd). Kärnor är märkta med DAPI (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Intrakardiella ex vivo injektion protokoll som beskrivs ovan är utformade för att bevara hjärtmuskelfunktion i minst 48 timmar i mitten av scenen (E9.5-E11.5) musembryon. Dessa injektions metoder möjliggör rumsligt målinriktad injektion av DNA eller celler. De få exempel som visas i figur 1-3 ger bevis på konceptet för att avgränsa ex vivo och in vivo molekylära mekanismer av utvecklingsprocesser som sker i begränsade hjärt regioner, till exempel EMT av endokardiella eller epikardiella celler. Viktigast av dessa protokoll ger en möjlighet att följa migrationen och ödet av injicerade celler, t.ex. embryonala celler eller huESC derivat i en ordentlig embryonal miljö, en hittills otillfredsställda utmaning. In vivo-märkning (som epikardiska cellerna i figur 3) med mätt eller begränsa spädningar av färgämne eller virus tillåter härstamning spårning av cell (under) populationer på en kort-och långsiktig bAsis, utan behov av Cre / lox teknik (även kombinera dessa metoder kan vara användbara också).
Flera viktiga steg samtidigt tillämpar dessa protokoll observerades. Först embryona är mycket känsliga för ljus. Det rekommenderas därför att öva injektionsprotokollet under ett stereomikroskop så att förfarandet kan genomföras med hög reproducerbarhet och effektivitet inom 15 min per embryo. I samma linje bör hela ultraljud-medierad injektionsbehandling utföras inom 30 minuter för att bevara en god livskraft embryon och att inte äventyra deras i livmodern utveckling. Manipulering av livmodern bör hållas till ett minimum. Dessutom bör det noteras att kirurgi på dräktiga möss tenderar att leda till för tidig förlossning (1-2 dagar tidigare än normalt). Dock bör nyfödda vara allmänt friska och utvecklas normalt. Vidare kan penetreringen av pipetten genom livmoderväggen, gulesäcken och embryotatt nå hjärtsäck och slutligen myokardiet är en känslig procedur (steg 5.3.13). Detta steg bör göras noggrant och försiktigt. För optimering, är det rekommenderat att utföra flera kortsiktiga dye injektioner för att fastställa reproducerbarhet och omfattar injektion i icke-utvalda områden. Slutligen har vi inte funnit utvecklings hjärtfel i samband med injektionsförfaranden för de exempel som ges ovan. Men en mer detaljerad, steg-för-steg, morfologisk och funktionell analys bör utföras för att helt fastställa normal utveckling och funktion under de olika stadierna av intresse.
Begränsningarna av dessa tekniker är flera. (I) injektion under stereomikroskop är begränsad av ljus-och temperaturkänslighet i musembryon. Detta kan lösas genom utövande av mikroinjektion förfarandet för att vara så snabb som möjligt, regelbundet byte eller värmer mediet, och arbetar i ett mörkt rum. (Ii) I ex vivo kultur av embryon eller explantat är begränsad i tiden, till skillnad från den i livmodern ultraljud-guidad injektion, vilket möjliggör långsiktig uppföljning. Vital färgämnen tenderar att märka celler nästan omedelbart och förbli synliga upp till tre till fyra dagar efter injektion. Emellertid kommer intensiteten av färgämnet utspädas genom successiva celldelningar. Märkning av celler med lentivirus kan övervinna detta problem. Emellertid tar upptag av viruset i flera timmar och expression är optimal efter 24 till 48 timmar, vilket förhindrar korttidsanalys. (Iii) ultraljud-förmedlad injektion begränsas av kostnaden för utrustningen. Upplösningen på 40 MHz-givaren är tillräckligt för mitten-och slutskedet embryon, men mer begränsande för stegen före E11.5.
Sammanfattningsvis föreslår vi att de hjärt injektions protokoll som beskrivs ovan bör användas i mitten av karriären musembryon. Den ex vivo tekniken är kompatibel med den kultur av embryon, isolerade hjärtan, eller explantater. In vivo-förfarande möjliggör långsiktig uppföljning, inklusive postnatal utveckling. Dessa tekniker kommer att hjälpa betydligt testa differentieringspotentialen för mänskliga stamceller derivat i en lämplig miljö, samt ta itu med specifika frågor om utvecklingsbiologi, såsom cellmigration och regionala ledtrådar som är viktiga händelser på vägen mot att forma en fungerande hjärta . Dessutom kan våra metoder och andras 10 i framtiden kunna användas för undersökning av andra organ än hjärtat, beroende på tillgängliga ex vivo odlingsprotokoll och / eller utvecklingsstadiet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner stiftelsen Leducq (mitralis) och Agence Nationale pour la Recherche (bevilja ANR Specistem) för finansieringen av denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
