Summary
Biz, (E) 9.5 ve daha sonraki aşamalarında embriyonik gün fare embriyoları olan embriyonik veya pluripotent hücrelerinden elde edilen iç ve aşılanmış hücrelerden hücre kaderine ve fenotipi hem izlenmesi amacıyla, boyalar enjekte DNA vektörleri, virüs, ve hücreler, bir dizi yöntem tarif gelişme.
Abstract
In vitro protokol embriyonik veya pluripotent kök hücre-türevlerinin kaderini test edilmesi zorunlu olarak in vivo potansiyel yansıtmaz tartışmalı sonuçlara yol açmıştır. Tercihen, bu hücreler, belirli bir fenotip elde etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmelidir. Ayrıca, boya veya retroviral vektörler ile hücrelerin etiketlenmesi sonra fare çalışmaları izleme hücre soyu hala az gelişmiş organları ile erken evre fare embriyoları çoğunlukla sınırlı kalmıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, E9.5 ve gelişiminin sonraki aşamalarında fare embriyosunda kalp hedeflenen bölgelerde çeşitli maddeler enjekte etmek, standart ve ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokolleri tasarlanmıştır. Embriyonik eksplant ya da embriyolar ya da daha fazla kültürlendi utero geliştirmeye bırakılır. Bu maddeler, fluoresan boyalar, virüs, shRNAs veya hücre-türevi projenitör hücrelerini içerir. Bizim yaklaşımlar fu korunması için izinorganın nction göçünü ve işaretlenmiş ve / veya enjekte edilen hücrelerin kaderini gözlenerek. Bu teknolojiler diğer organlara uzatılabilir ve gelişim biyolojisinde önemli biyolojik soruları için çok yararlı olacaktır.
Introduction
Daha on yıl önce, insan embriyonik kök hücreleri (HuESCs) insan blastosistlerin 1 elde edilmiştir. O zamandan beri, bu hücreler, insan gelişim biyolojisi karşılanmamış sorular adresleri önemli bir araştırma alanının konusu haline gelmiştir. HuESCs ayrıca rejeneratif tıpta umut sağladı. Son yıllarda, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2 genetik hastalık modelleri sağlayan, hastaya özgü somatik hücrelerinden elde edilmiştir. Kalp soy 3 de dahil olmak üzere çeşitli hücre soyları, doğru ya da embriyonik uyarılmış pluripotent kök hücrelerin farklılaşması için in vitro protokol birçok rapor edilmiştir. Farklılaşmış hücreleri genellikle RNA ve protein ifadesi, immun boyama, ve / veya in vitro fonksiyonel testler analizi ile fenotiplenir. Bununla birlikte, pluripotent kök hücresi türevleri tam cel elde olup olmadığını test etmek için uygun bir oluşum safhasındaki bir ortamda yerleştirilmesi gerekirl kendi embriyonik meslektaşı kaderi ve bölgesel uyaranlara yanıt olarak gerçek in vivo fonksiyonu özetlemek ister. Doku mühendisliği umut verici olmasına rağmen, henüz gelişmekte olan embriyonik doku 4,5 in vivo olarak uygun tüm bilinen ve bilinmeyen ipuçları sağlamaz.
Fare embriyoları içeren embriyolar, boyalar veya retroviral vektörlerle hücre etiketleme, kalp gelişimi 6 sırasında hücre soylarının embriyonik kökeni gibi önemli bilgileri getirdi. Örneğin, izole edilmiş kalpler in vitro kültürü ile, ardından ex vivo fare embriyoları, en perikardiyal boşluğu içine enjeksiyon boya, epikardiyal hücreleri ve bunların soyundan 7 etiketlemek için kullanıldı. Ancak, boya ve retroviral hücre etiketleme çoğunlukla 8 daha kolay erişilebilir hala az gelişmiş organ veya tavuk embriyolar, erken fare embriyoları tatbik edilmiştir. Bir istisna e hedef kolaydır, beyin tarafındanmbryos 9,10. Böyle bir yaklaşım, henüz dayak embriyonik fare kalp tatbik edilmemiştir.
Boyalar ya da virüs doğrudan etiketleme tamamlayıcı olarak ve daha ileri evre fare embriyo ve yetişkin farelerde izleme soy gerçekleştirmek için, hücre etiketleme yaklaşımı Cre / Lox teknolojisi kullanılarak transgenik farelerin analizi ile kombine edilmiştir. Cre / Lox yaklaşımı 11 ancak rekombinazın ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılabilir genomik düzenleyici bölgelerin uzaysal özgüllük ve Cre / Lox rekombinasyon 12 verim nedeniyle bazı sınırlamalar vardır. Sadece Cre ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılan düzenleyici bölgesi aktivasyonunun ardından bir ön etiket gibi Bundan başka, bu yaklaşım, tam hücre kaderin hücre göçü odaklı edinim özel soruları gidermez. Ayrıca bariz etik sorunları için insan embriyosu için geçerli olamaz.
Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz yeni p bir dizi tasarlanmışhedeflenmiş bölgelerinde bu gibi floresan boyalar, virüs, ve bu shRNAs DNA-bazlı hücre etiketleme vektörleri gibi gen ekspresyonu modülatörlerinin veya E9.5 ve gelişiminin sonraki evrelerinde de fare embriyo hücreleri gibi hücre etiketleme çeşitli ajanlar enjekte rotocols kalp.
DNA / hücre enjeksiyonları Stereomikroskopta ve 48 saat veya 48-72 saat boyunca izole kalp ya da embriyonik eksplant kültürü kadar ex vivo embriyo kültürü ile birlikte basit bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Biz de rahimde fare embriyonik gönlünde bir ultrason aracılı mikroenjeksiyon protokol rapor. Bu teknik embriyoların 13 gelişimini izleme sağlar ve injectates ve / veya etiketli hücrelerin uzun süreli takip için izin verir.
Biz, bu yaklaşımlar organın işlevini korumak ve kök hücre potansiyeli in vitro test daha temsili bir ortam temin ettiği bulunmuştur. Ayrıca göç takip fırsat sağlarkendi kaderini izlemek hücreleri etiketli ve / veya enjekte. Sonuç olarak, bu bölge, doku desenleme ve önemli biyolojik süreçlerin daha iyi bir anlayış elde edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hazırlık
Hayvan Prosedürleri
Bir hayvan etik kurul onay almak ve virüs ile çalışmak için kurumsal yönergeleri izleyin, HuESC ve / veya iPSC (varsa) yanı sıra, fare kullanımı, fare embriyo elde edilmesi, ve fare ameliyat. Zamanlı eşleştirmesi için, tıpanın gün embriyonik gün (E) 0.5 / 0.5 gün post-coitum olarak kabul edilir.
- Mikroenjeksiyon iğneler:
Ex utero mikroenjeksiyon için, 1 ya da 10 mikron iç uç çapını ve sırasıyla, DNA veya hücreleri enjekte etmek için keskin ve konik ucu şeklini almak için bir pipet çektirmenin / beveller kullanılarak cam pipetler (1.2 mm dış çaplı borosilikat kılcal tüpler) çekin. Ultrason aracılı enjeksiyonlar için, kullanımı, 50/35 um OD / ID ucu ile mm/0.53 1.14 mm'lik bir iç / dış çapa (OD / İD) sahip steril iğneler, özel. - Silikon dolu petri:
Kılavuzunda açıklandığı gibi silikon hazırlayın. Doldurmak~ 1 sm bir elastomer tabakası ile temiz bir cam 60 mm çapında Petri kabı. Hava kabarcıkları kaçının. - Araçlar:
İşlem sırasında önce ve tüm cerrahi aletler steril tutun. - DNA hazırlanması:
Tek bir tüp içinde 3 ug DNA ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Başka bir tüp içinde 3 ul Lipofektamin 2000 ve 12 ul Opti-MEM ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve her iki çözümü karıştırın. Hemen kullanın. - Hücre hazırlanması:
10 6 hücre süspansiyonunu hazırlamak / ml DMEM (Dulbecco'nun Eagle Medium, yüksek glikoz ve% 50 fare) tedaviden geçirildi. Nihai hücre süspansiyonu, 50 ul 8-10 embriyolar için yeterlidir. - Boya hazırlama:
25 mg / ml DMSO de yeşil floresan CDCFDA-SE kullanın. -20 ° C'de 20 ul alikotları ve mağaza hazırlayın Steril serum fizyolojik veya PBS kullanımdan önce 1:100 / 1:200 sulandırmak. - Virüs hazırlanması:
~ 10 9 10 -10 tra bir titreye sahip olan ticari bir 3. kuşak PGK-GFP-ifade lentivirüs kullanınbirim / ml DMEM nsducing. Lentivirüsünün hazırlanması için, Tiscornia vd. 14. kişisel koruyucu ekipman giyin ve güvenli bir şekilde kullanımı ve virüs imha bakın.
Ex vivo Enjeksiyon için E9.5 ve E10.5 Embriyolar 2. Koleksiyonu
- Embriyonik gün 9.5 veya 10.5 hamile bir fareyi Euthanize.
- % 70 etanol ile fare göğüs ve karın sterilize edin.
- Karın açmak ve PBS içinde oda sıcaklığında uterin boynuz almak ve M16 ortamı ile bir silikon dolu bir Petri kabı iki PBS yıkar sonra aktarmak için bir ventral orta hat kesi olun.
- Rahim vaskülarize yan alt böylece silikon tabakaya böcek pimleri ile uterin boynuzu Pin.
- Yüzeyinin 1 mm ince forseps ile rahim yüzey ve desidua bir kapak kesin.
- Yavaşça desidua duvarlar dışarı yayarak yumurta kesesinde embriyo almak.
- 37 ° embriyolar Mağaza, Hücre enjekte edilmeden önce C M16 ortam. Enjeksiyon için her bir embriyo önceden ısıtılmış 37 ° C de M16 ortamı ile doldurulmuş silikon kabına aktarılır
Stereomicroscope altında 3. DNA veya Hücre Enjeksiyon
- Bir Hamilton şırınga ile arka cam pipet doldurun ve ucunda kabarcıklarını çıkarmak için pipet sallayın.
- Mikroenjeksiyon tutucuya pipet ayarlayın; 50, tutma basıncı (DNA) ya da 30 (hücreler) hPa ve 300 (hücre) için 150 enjeksiyon basıncı (DNA) hPa ayarlayın. 0.2 sn (DNA) veya 0.5 saniye (hücre) için enjeksiyon zamanı ayarlayın. Bu ayarlar, hafif mikroenjektör ve pipet türüne göre değişiklik gösterebilir.
- Uygun embriyo dokunmadan sarısı ile silikon alt embriyo Pin. Kalbin bölge izlemek ve sadece bu bölgede yukarıda kese açık.
- Hücre enjeksiyonu sırasında herhangi bir hareketi önlemek için embriyo yaklaşık 4 işaretçilerine ekleyin.
- (Manuel ayarlı) mikromanipülatör kullanarak, slowlSadece (Şekil 1), enjekte edilecek olan kalbin bölgenin üstüne perikard en az 45 ° 'lik bir açı y konumu pipet ucu.
- Ilgi bölgesi içine pipet hareket ve enjeksiyon tetikler. Mümkün olduğunca çabuk pipet dışarı atın. Emin kalp düzgün DNA / hücre enjeksiyonu sonra dayak olun.
4.. Embriyo, İzole Kalp ve Eksplantasyon Kültür
- Penisilin / streptomisin, 37 ° C'de önceden ısıtılmış ve% 40 O2 ile oksijen ile takviye edilmiş% 25 M2 ortamı ve% 75 sıçan serum içinde kültür E9.5 embriyolar.
- , 25 ml'lik bir cam tüp içinde 2 ml kültür ortamı nazikçe embriyo ekleyin ve boru üzerine kapak vidalanarak önce% 40 O2 ile oksijenat. Döner ya da (30 devir / dakika) çalkalanarak 37 ° C'de 36 saate kadar inkübe edin.
- Istediğiniz zaman noktasına (örneğin 24 saat) At, ilk DE, kalpleri dokunmadan, ince forseps ile dikkatlice kalpleri teşrihEmbriyoların capitating; kalp uzak çıkış yolunu kullanarak dışarı çekerek ÖTV kolaydır.
- Kültür, 12 oyuklu bir plaka içerisinde geçen bir Matrigel ile kaplanmış bir ek üzerine% 50 FCS ile DMEM içinde 36-48 saat boyunca bir kalp izole edilmiştir. Kalp kültürünün 15 geliştirilmiş bir protokol için Dyer ve Patterson (2013) bakınız.
- Ilgili bölgenin herhangi bir eksplant yapın. Bir örnek olarak, kollajen tip 1 jel 16 üzerinde 48 saat için atriyo-ventriküler kanal (AVC) ve kültür teşrih.
Kalp I n utero 5. Ultrason eşliğinde Enjeksiyon
- Ultrason makinesi ve mikropüskürtücünün Kurulum:
- Bir ray üzerinde 40 MHz transdüser ve mikroenjeksiyon kurulum ile yüksek çözünürlüklü ultrason sistemi kullanın.
- Enjeksiyon başına 69 nl de mikroenjektör üzerinde enjeksiyon ses seviyesini ayarlayın. Mikropüskürtücüden programlama için üreticinin mikroenjeksiyon kılavuzuna bakın.
- Microi hazırlanmasınjection kurulum ve enjeksiyon:
- Mikroenjektör bir cam mikropipet yerleştirin. Maksimum hacme kadar aspire verimli enjeksiyon, ilk kapladıkları mineral yağ ile pipet iç tarafını sağlamak. Daha sonra, iğne içindeki yağın 1-2 mm'lik bir uzaklık bırakarak yeniden yağ çıkarın.
- Maksimum ses ulaşılana kadar enjektat aspire. Bu ucu künt ve enjeksiyon daha zor hale getirecek gibi iğne ucu ile herhangi yüzeylerine dokunmayın için dikkatli olun.
- Enjeksiyon sırasında embriyoları içeren uterin boynuzu stabilize etmek için, merkezi kesilmiş küçük bir yarık ile donatılır, ince silikon membran ile kaplı ortasında bir delik olan bir tadil edilmiş Petri kabı (2.5 cm çaplı), kullanımı ve insizyon üzerinde konumlandırmak . Yemeğin kenarlarının altında kil 3-4 yığınları konumlandırarak fare taşıma masaya Petri stabilize.
- Enjeksiyon prosedürü:
- Önce anestezi için (istenen embriyonik aşamada) hamile bir fare karın Tıraşsia saç kaldırmak için. Kalıntı tüylerden ve% 70 etanol ile sterilize etmek için, bir kimyasal saç temizleme maddesi ile karın tedavi.
- Bir maske ile oksijen / izofluran ile hamile bir fare anestezisi. Prosedürün geri kalan kısmı boyunca 1-1.5%, ardından ilk anestezi için,% 100 oksijen içinde% 3-5 izofluran kullanın. Fare yeterince hafifçe pençeleri ve / veya kuyruk kısma anestezi emin olun.
- (37 ° C ısı ayarlı) fare taşıma masaya fare sırtüstü yerleştirin ve korneanın su kaybını önlemek için yağlayıcı ile gözlerinizi kapayın.
- Elektrotlar üzerinde elektrot jeli uygulayın ve kalp hızı, solunum hızı ve EKG izlemek için elektrotlara pençeleri bantlayın. Vücut sıcaklığını izlemek için bir rektal termometre yerleştirin.
- İlk fare görselleştirme ve ultrason ile embriyolar sayarak hamile olduğunu doğrulayın. Karın ultrason jeli uygulayın ve mesane üzerinde tarama kafasına yerleştirin. Tutarlılık için, ilk olarak mesane görselleştirmekve mesane konumdan başlayarak, sol ve sağ embriyolar rahim boynuzları sayılır. Embriyonik kalpleri normal yenerek emin olun.
- Fare hamile ise, kil ile gelecek kesi yukarıda Petri kabı yerleştirin. Çanak direkt temas halinde olduğunu böylece biraz karın üzerine çanak basın.
- Çanak çıkarın ve tekrar karın sterilize. Karın ve periton açmak için, yaklaşık 0.75-1 cm vajina üzerinde, bir 1.5-2 cm ventral orta hat kesi olun. Iç organlara zarar görmesini önlemek.
- Forseps ile sol veya sağ uterin boynuz Exteriorize, yavaşça yemeğin silikon zarından çekin ve tekrar kil üzerine çanağı stabilize. Önlemek kapsamlı bu uterus damarları ve kadın ve / veya embriyoların erken ölüm kanamaya neden olabilir bu yana, çekme ya da manipülasyon.
- Embriyolar enjekte edildiği, yeterli kayıt tutulmasını sağlamak için tekrar embriyolar saymak.
- U üzerinde ultrason jeli uygulayıngörüntü Terine boynuzları kalp ve dehidratasyonu önlemek için.
- Görüntü ilk embriyo enjekte edilecek. Embriyonik kalbin normal dayak kontrol edin ve embriyonun kaudal-kafatası ve sağ-sol yönelim kayıtlarını tutmak. Gerekirse, uygun yönlenmesinin sağlanması için hafifçe uterin boynuzu yerleştirin. Bu zor ise, bir sonraki embriyo geçmek.
- Biraz (Şekil 3) perikard dışında, embriyo üzerinde 45 ° açı iğne konumlandırmak için mikroenjeksiyon iğne ile dikkatlice rahim delinme. Bu atriyoventriküler oluk (Şekil 3) doğru çekiyor, böylece epikardiyal hücrelerin etiketlenmesi için, görüntü dört odacık görüntüsü kalp ve iğne pozisyon. Açısı ayarlanabilir gerekiyorsa, iğneyi çekin ve yeniden konumlandırmak. Bu iğneyi bozabilecek yana, rahim içinde iğne ile açısını ayarlamak etmeyin. Böyle bacaklarda veya plasenta gibi diğer dokuları, delinmesiyle kaçının.
- Iğne taşımakperikard duvara ve yumuşak, ama hızlı hareket ile delinme. Genel olarak, orada bazı direnç olacak, fakat çok hızlı iğne hareket iğne ucu kalbi kendisi delinmeye neden olabilir. Ucu atriyoventriküler oluk perikard uzayda bitmelidir. Perikardiyal kanama durumunda, kan hücreleri, beyaz bir kar-benzeri bir model olarak görünür olacaktır. Bu durumda, embriyo enjekte durdurmak ve başka bir embriyo geçmek.
- Enjekte edilecek enjekte edilir. Kalpler gelişimi üzerine olumsuz etkiyi önlemek için perikard uzaya maksimum 700 nl enjekte edilir. Perikardiyal kese hafif, geçici şişlik uygun enjeksiyon izleyin.
- Enjeksiyonu takiben, dışarı iğneyi çekin ve enjektat hala iğne doku parçaları tarafından tıkanmış değildi sağlamak için çıkarılır olabilir onaylamak.
- Görüntü işleme tablo konumlandırmak ve sonraki embriyo enjekte. Önlemek için (bir uterin boynuz) 3-4 maksimal enjekte edilen embriyoların sayısını tutunzıt uterin boynuzu kontrol embriyoları için izin vermek için ve prosedür, embriyo gelişimini rahatsız değil sağlamak için, anestezi genişletilmiş.
- Embriyo istenilen sayıda enjekte ettikten sonra, fazla ultrason jeli kaldırın ve yavaşça onun uygun pozisyonda karın içine geri uterin boynuz yerleştirin.
- Bir periton ve karın kasları için ameliyat dikiş ipliğinin bir tabaka ve cilt için dikişin ikinci bir katman kullanarak maternal karın kapatın.
- Ağrı kesici ilk dozu ile fare enjekte edilir. Önceki 12 saat aralıklarla anestezi ve üç ek enjeksiyonları biten 0.05-0.1 mg / kg Buprenorphine 15 dakika bir enjeksiyonunu kullanın.
- Anestezi durdurun ve prosedür yeterli kurtarma için fareyi izlemek. Ev izlem süresi için arzu edilen tek bir kafes içinde gebe fare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen enjeksiyon protokolleri kullanılarak, hücreler, 'etiketlenmiş ve / veya embriyonik fare kalp içine enjekte edilebilir. Kavramının kanıtı olarak, birkaç örnek enjeksiyon protokolü ve ex vivo AVC eksplant, izole edilmiş kalp veya bir bütün olarak embriyo kültürü (Şekil 1) bir araya getirilmiş olduğu gösterilmiştir.
Şekil 1, hücre enjekte edilmeden önce embriyonun hazırlanışını göstermektedir. Yumurta sarısı kese (Şekil 1A) bütünlüğünü muhafaza ederken E9.5 embriyonun desiduada kaldırılır. Yolk kesesi sadece kalp (Şekil 1B) üzerinde açıldı. Pipet (Şekil 1C) yaklaşıp hücreler enjekte edilir. Kalp şeklini (Şekil 1D) korur ve dayak kalır.
Bu tür geçiş (EMT) mezenşimi için epitel gibi gelişimsel biyoloji içinde daha spesifik biyolojik soruyu çözmek için, bir E9.5 AVC eksplant sh ile enjekte edildiEndokardiyal hücrelerin endotelyal-mezenkimal geçiş (Şekil 2A) için gerekli olan bir proteini down-regüle RNA. Kontrol embriyo boş bir omurga vektörü ile enjekte edildi. Aynı şekilde, SOX9 promotörünün kontrolü altında GFP ifade tonlar hücre-türevli endotel hücreleri, ön kapak 48 saat eksplante kalp kültüre edilmesini, takiben, E10.5 de AVC enjekte edildi. Bu hücreler, (Şekil 2B ve 2C) endojen endokardiyal hücrelere periostin benzeri EMT belirteçleri kazanır.
Bu ex vivo yaklaşımlar nispeten kolaydır, ancak kısa süreli takipte (maksimum 48-72 saat) ile sınırlıdır. Ultrason rehberliğinde enjeksiyon işlemi teknik olarak daha zor bir yaklaşım sağlar, ancak utero takipte uzun vadeli seçeneği, hatta post-natal, ile. Boya ya da belirli kalp bölgelerinde hücreleri etiketlemek için viral vektörlerin in utero enjeksiyon, Şekil 3A-3'de gösterilmiştir C. Bu yöntemle, epikardiyal hücre özel etiketleme floresan boyalar (Şekil 3D ve 3E) veya virüs (Şekil 3F) ile elde edilebilir, ve yöntem, hücre ya da alternatif injectates ile üzerinde genişletilebilir.
. Kalp Şekil 1. Hücre enjeksiyonu A:.. Yolk kesesi E9.5 embriyo B: kalbin hemen üstünde yumurta sarısı kesesi açıldıktan sonra kalp görselleştirme. Aşağıdaki ilave kalbin bir büyütme gösterir ve AV kanal C çekiyor:.. AVC D doğru pipet yaklaşımı: 48 saat kültürden (H = kalp) sonra embriyo enjekte.
. Kardiyak eksplant endokardiyal hücrelerinin ex vivo EMT engelleyen bir E9.5 embriyonun AVC bir shRNA Şekil 2 Enjeksiyon A:. Kontrol omurga vektör veya ShRNA bir E9.5 ve AVC lipotectamine ile birlikte enjekte edildi fare embriyosu; 3 saat sonra, AVC endokardiyal hücreler EMT tetiklemek için disseke ve bir kollajen jel üzerinde yetiştirildi. . ShRNA EMT BC için gerekli olan bir proteini downregüle: SOX9 promotörünün kontrolü altında GFP ifade etmek için renk tonlarını hücresinden türetilmiş hücre kapak E10.5 embriyoların AVC enjekte edildi. Kalp 2 gün (B) kültürlenmiştir ve daha sonra sabit ve bir anti-periostin antikor (C) ile boyanmıştır. Ilave AVC bölgesinin bir büyütülmüş şeklini göstermektedir.
.. Şekil 3. utero enjeksiyonu A: deney düzeneği gösteren şema. Gebe fare sırt üstü konumlandırılmıştır ve silikon membran ile bir Petri kabı kesi üzerinde stabilize edilir. . 1 = mikropüskürtücü, 2 = dönüştürücü, silikon membran ile 3 = Petri kabı, 4 = ultrason jeli, uterus boynuzu (kırmızı), 5 = fare, 6 = Play-Doh kil, 7 = fare kullanımı tablo B: hala çerçevesi enjeksiyondan önce iğne ve embriyonik kalp konumunu gösteren ultrason film (M + mod). Kadın EKG altındaki (yeşil) ve sağ alt (sarı) kalp ve solunum hızında gösterilmiştir. H = kalp C:. Enjeksiyon sırasında iğnenin ve embriyonik kalbin konumunu gösteren ultrason görüntüsü. Ankastre: ucu perikard geçti, ancak miyokard değmeyecek, böylece enjekteate atriyo-ventriküler oluğun perikardiyal boşluğa enjekte edilebilir. Siyah noktalı çizgiler, atrium (A) ve ventrikül (V) 'in sınırlarını belirlemek D:. Bütün perikardiyal boşluk içindeki boyanın güçlü floresan gösteren bir E11.5 fare embriyo görüntü montaj E:. Bir E11.5 temsili bölümünde floresan bir boya (CDCFDA-SE, yeşil) enjeksiyonundan sonra 4 saat ile perikard ve epikardiyal hücre etiketleme gösteren embriyonik fare kalp. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmiş. LA = sol atrium, LV = sol ventrikül, RA = sağ atrium, RV = sağ ventrikül F:. 3 gün enjeksiyonundan sonra GFP-ifade lentivirüsünün mozaik epikardiyal hücre etiketleme gösteren E14.5 embriyonik fare kalp temsilcisi bölümü. GFP özgünlüğünü teyit etmek için, GFP protein aynı zamanda, bir GFP antikor (kırmızı) ile boyandı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda tarif edilen intra kardiyak ex vivo enjeksiyon protokolleri orta aşama (E9.5-E11.5) fare embriyo en az 48 saat boyunca miyokard fonksiyonu korumak için tasarlanmıştır. Bu enjeksiyon yaklaşımlar DNA ya da hücre konumsal hedeflenen enjeksiyon için izin verir. Şekiller 1-3 de gösterilen birkaç örnek ex vivo ve bu endokardiyal veya epikardiyal hücre EMT olarak kısıtlı kalp bölgelerinde yer alan gelişimsel süreçlerinin vivo moleküler mekanizmalar tasvir konseptinin kanıt sağlar. En önemlisi, bu protokolleri, uygun bir embriyonik ortamı, bir bugüne kadar karşılanmamış meydan insan embriyonik hücreler veya huESC türevleri gibi enjekte edilen hücrelerin göçünü ve kaderini takip için bir fırsat sağlamaktadır. Yılında doyurarak ile (Şekil 3 epikardiyal hücreleri gibi) in vivo etiketleme veya boya veya virüs dilüsyonlarını sınırlayan bir kısa hem de uzun vadeli b hücre (alt) nüfus soy izleme sağlarCre / lox tekniği gerek kalmadan asis, (bu teknikleri birleştirmek de yararlı olabilir).
Bu protokolleri uygulanırken bazı kritik adımlar gözlendi. İlk olarak, embriyolar, ışığa karşı oldukça duyarlıdır. Bu nedenle, işlem embriyo başına 15 dakika içinde yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ve verimlilik ile gerçekleştirilebilir, böylece bir stereo mikroskop altında enjeksiyon protokolü uygulama önerilir. Aynı paralel olarak, tüm ultrason aracılı enjeksiyon işlemi embriyo iyi canlılığını korumak için ve utero gelişme uzlaşma 30 dakika içinde yapılmalıdır. Rahim Manipülasyon minimumda tutulmalıdır. Ayrıca, hamile fareler üzerinde cerrahi (1-2 gün önce, normal) erken doğum neden eğiliminde olduğu not edilmelidir. Ancak, yenidoğan genellikle sağlıklı olmalı ve normal geliştirmek. Ayrıca, rahim duvarı, yolk kesesi ve embriyo ile pipet penetrasyonperikard ulaşmak ve nihayet miyokardiyumu hassas bir işlemdir (adım 5.3.13) olduğu için. Bu adımı dikkatle ve nazikçe yapılmalıdır. Optimizasyonu için, tekrarlanabilirlik belirlemek ve hedefli olmayan bölgelerde enjeksiyon dışlamak için çeşitli kısa vadeli boya enjeksiyonlarının yapılması tavsiye edilir. Son olarak, yukarıda verilen örnekler için enjeksiyon prosedürleri ile ilgili gelişim kalp kusur bulamadık. Ancak, daha detaylı, aşama aşama, morfolojik ve fonksiyonel analiz tamamen ilgi aşamalarında normal gelişimini ve fonksiyonunu tespit etmek için yapılmalıdır.
Bu teknolojilerin sınırlamalar çeşitli vardır. (I) bir stereomikroskop altında enjeksiyon fare embriyo ışık ve ısı hassasiyeti ile sınırlıdır. Bu, düzenli olarak değiştirilmesi ya da orta ısınma ve karanlık bir odada, çalışma mümkün olduğu kadar hızlı olması için mikroenjeksiyon prosedürün uygulanması ile aşılabilir. (Ii) v exembriyolar veya eksplantlarının ivo kültür uzun dönem takiplerde sağlar utero ultrason rehberliğinde enjeksiyon, aksine, zamanla sınırlıdır. Vital boyalar hemen hücreler etiket eğilimindedir ve 3-4 gün sonrası enjeksiyon kadar görünür kalır. Bununla birlikte, boyanın yoğunluğu ardışık hücre bölünmesi ile seyreltilmiş olacaktır. Lentivirüsünün ile hücrelerin etiketlenmesi bu sorunun üstesinden gelebilir. Ancak, virüsün alımı birkaç saat sürer ve anlatım kısa vadeli analiz engeller 24-48 saat sonra en uygunudur. (Iii) ultrason aracılı enjeksiyon ekipman maliyeti ile sınırlıdır. 40 MHz transdüser çözünürlüğü orta ve geç evre embriyolar için yeterlidir, ama daha önce E11.5 için aşamaları için sınırlayıcı.
Özet olarak, yukarıda tarif edilen kalp enjeksiyon protokolleri orta evre fare embriyolarında kullanılması gerektiğini önerir. Ex vivo tekniği embriyoların kültürü, izole kalplerin veya eksplant ile uyumlus. In vivo prosedür post-natal gelişim dahil olmak üzere uzun dönemli takipte sağlar. Bu teknikler uygun bir ortamda insan kök hücresi türevleri farklılaşma potansiyelini test yanı sıra, bu tür hücre göçü ve fonksiyonel bir kalp şekillendirme doğru yolda kilit olaylar bölgesel dokulara gibi gelişimsel biyoloji özel sorular ele ölçüde yardımcı olacaktır . Ayrıca, bizim yöntem ve diğerleri 10 bu gelecekte mevcut ex vivo kültür protokolleri ve / veya in vivo gelişim aşamasına bağlı kalp daha başka organların incelenmesi için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar Vakfı Leducq (Mitral) ve Agence Nationale bu araştırmalara fon la Recherche (ANR Specistem hibe) dökün kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
