Summary
Vi beskriver en rekke metoder for å injisere fargestoffer, DNA-vektorer, virus og celler for å overvåke både celle skjebne og fenotype av endogene og podet celler avledet fra embryoniske eller pluripotente celler i mus embryo ved embryonisk dag (E) 9,5 og senere stadier av utviklingen.
Abstract
Testing skjebnen til embryonale eller pluripotent stamcelle-derivater i in vitro-protokoller har ført til kontroversielle utfall som ikke nødvendigvis gjenspeiler deres in vivo potensial. Fortrinnsvis bør disse cellene plasseres i et riktig embryoniske miljø for å erverve sitt bestemt fenotype. Videre har celle avstamning tracing studier i mus etter merking celler med fargestoffer eller retrovirale vektorer forble stort sett begrenset til tidlig stadium mus embryoer med fortsatt dårlig utviklede organer. For å overvinne disse begrensningene, designet vi standard og ultralyd-mediert mikroinjeksjon protokoller for å injisere ulike agenter i målrettede områder av hjertet i muse embryoer ved E9.5 og senere stadier av utviklingen. Embryonale eksplantering eller embryo er så kultivert eller venstre for å videreutvikle i utero. Disse agentene inkluderer fluorescerende fargestoffer, virus, shRNAs eller stamcelle-avledet stamceller. Våre tilnærminger tillate for bevaring av fufunksjons-av organet mens overvåking migrasjon og skjebnen av merkede og / eller injiserte celler. Disse teknologiene kan bli utvidet til andre organer, og vil være svært nyttig for å håndtere viktige biologiske spørsmål i biologi av utviklingen.
Introduction
Mer enn et tiår siden, har menneskelige embryonale stamceller (HuESCs) er avledet fra menneskelige blastocysts en. Siden da har disse cellene bli gjenstand for et viktig forskningsfelt som omhandler udekkede spørsmål i menneskets utviklingsbiologi. HuESCs har dessuten gitt håp i regenerativ medisin. I de senere årene har menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) blitt generert fra pasient-spesifikke somatiske celler, og gir modeller av genetisk sykdom to. Mange in vitro protokoller for differensiering av embryonale eller indusert pluripotent stamceller mot ulike celleslektsnavn, inkludert hjerte linjene 3, har blitt rapportert. De differensierte celler er ofte phenotyped ved analyse av RNA og protein ekspresjon, farging og / eller in vitro-funksjonstester. Men pluripotent stamcelle derivater må plasseres i en skikkelig embryonale miljø for å teste om de fullt ut overta cell skjebnen til sin embryonale motstykke og om de rekapitulere den ekte in vivo funksjon som svar på regionale signaler. Mens tissue engineering er lovende, betyr det ikke likevel gi alle de kjente og ukjente signaler i riktig in vivo utviklings embryonale vev 4,5.
Celle merking med fargestoffer eller retrovirale vektorer i embryoer, inkludert mus embryoer, har brakt viktig informasjon som til embryonale opprinnelse celle linjene under hjerte-utvikling seks. For eksempel, fargestoff injeksjon i det perikardiale plass av museembryoer ex vivo, etterfulgt av in vitro dyrking av isolerte hjerter, ble brukt til å merke epikardiale celler og deres etterkommere 7. Men, har vært mest brukt fargestoff og retroviral celle merking til tidlig mus embryoer med fortsatt dårlig utviklede organer, eller kylling embryo, som er lettere tilgjengelig åtte. Et unntak er hjernen, noe som er lettere å målrette i embryos 9,10. En slik tilnærming har ennå ikke blitt brukt til å slå embryonale mus hjerte.
For å komplettere direkte merking med fargestoffer eller virus og å utføre avstamning tracing i mer avanserte scene mus embryoer og voksne mus, har cellen etikettmetoden blitt kombinert med analyse av transgene mus ved hjelp av Cre / Lox teknologi. Den Cre / LOX tilnærming 11 har imidlertid noen begrensninger på grunn av tid og rom spesifisiteten av de genomiske regulatoriske områder som brukes for å drive ekspresjon av rekombinase, og effektiviteten av Cre / Lox rekombinasjon 12.. Videre gjør denne tilnærmingen ikke fullt ut ta opp konkrete spørsmål av celle migrasjon-drevet oppkjøp av cellen skjebne som det kan bare merke en forløper etter aktivering av det regulatoriske område brukes til å drive Cre uttrykk. Det kan heller ikke gjelde for menneskelige embryoer for åpenbare etiske problemstillinger.
Gitt disse begrensningene, utviklet vi en rekke nye protocols å injisere en rekke cellemarkørmidler slik som fluorescerende fargestoffer, virus, genekspresjon modulatorer slik som shRNAs og DNA-baserte cellemerking vektorer eller celler i mus embryo ved E9.5 og senere stadier av utviklingen i målrettede regioner av hjerte.
De DNA / celleinjeksjoner bruke et stereomikroskop, og en enkel mikroinjeksjon enhet kombinert med ex vivo embryo kultur opptil 48 timer, eller i isolert hjerte eller embryonale eksplantering kultur i 48-72 timer. Vi rapporterer også en ultralyd-mediert mikroinjeksjon protokollen i mus embryonale hjerter i utero. Denne teknikken gjør det mulig å overvåke utviklingen av embryo 13 og gir mulighet for langsiktig oppfølging av injectates og / eller merkede celler.
Vi har funnet at disse tilnærmingene bevare funksjonen av organet og gi et mer representativt miljø enn in vitro testing av stamcelle potensial. Det gir også mulighet til å følge migrasjonav merket og / eller injisert celler for å overvåke deres skjebne. Til syvende og sist, bør dette gi en bedre forståelse av regional vev mønster og viktige biologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forberedelse
Animal prosedyrer
Innhente godkjenning fra en dyreetisk komité og følge institusjonelle retningslinjer for arbeid med virus, HuESC og / eller iPSC (når gjeldende), samt mus håndtering, skaffe mus embryoer, og utfører muse kirurgi. For tidsbestemt parringer, er den dag pluggen betraktes embryonisk dag (E) 0,5 / 0,5 dager post-coitum.
- Mikroinjeksjon nåler:
For ex utero mikroinjeksjon, trekke glass pipetter (1,2 mm i ytre diameter borsilikat kapillære rør) ved hjelp av en pipette avtrekker / beveller å få en 1 eller 10 mikrometer innvendig spissen diameter og en skarp og konisk spiss form for å injisere DNA eller celler, henholdsvis. For ultralyd-mediert injeksjoner, bruk tilpasset sterile nåler, som har en ytre / indre diameter (OD / ID) på 1,14 mm/0.53 mm, med en 50/35 mikrometer OD / ID spissen. - Silicon-fylt petriskåler:
Forbered silisium som beskrevet i manualen. Fyllet rent glass 60 mm diameter petriskål med en elastomer lag av ~ 1 cm. Unngå luftbobler. - Instrumenter:
Hold alle kirurgiske instrumenter sterile før og under prosedyren. - DNA forberedelse:
Legg 3 mikrogram DNA og 12 mL Opti-MEM i ett rør. Legg 3 mL Lipofectamine 2000 og 12 mL Opti-MEM i et annet rør. Inkuber i 5 min ved romtemperatur og bland begge løsninger. Brukes umiddelbart. - Cell forberedelse:
Forbered en suspensjon av 10 6 celler / ml DMEM (Dulbeccos Eagle Medium, høy glukose og 50% rotte serum). 50 pl av den endelige celle-suspensjonen er tilstrekkelig for 8-10 embryoer. - Dye forberedelse:
Bruk den grønne fluorescerende CDCFDA-SE på 25 mg / ml DMSO. Forbered 20 ul delprøver og oppbevar ved -20 ° C. Fortynn 1:100 / 1:200 i sterilt saltvann eller PBS før bruk. - Virus forberedelse:
Bruk en kommersiell 3. generasjon PGK-GFP-uttrykke lentivirus med en titer av ~ 10 9 -10 10 transducing enheter / ml DMEM. For utarbeidelse av lentivirus, se Tiscornia et al. 14 Bruk personlig verneutstyr og trygt bruke og avhende virus.
2. Innsamling av E9.5 og E10.5 embryo for Ex vivo Injection
- Avlive en gravid mus på embryonale dag 9.5 eller 10.5.
- Steril brystet og magen av musen med 70% etanol.
- Lag en ventral midtlinjen snitt til å åpne buken og hente livmor horn ved RT i PBS og overføre den etter to PBS vasker til en silikonfylte petriskål med M16 medium.
- Pin uterine horn med insekt stiftene til det silikonlaget slik at vaskularisert side av livmoren er på bunnen.
- Skjær overflaten av livmoren med fin pinsett, og et lokk av den decidua på 1 mm under overflaten.
- Forsiktig hente embryoet i plommesekken ved å spre ut veggene i decidua.
- Oppbevar embryoene ved 37 °; C i M16 medium før celle injeksjon. For injeksjon blir hvert embryo overføres til silikon fatet fylt med M16 medium forvarmes ved 37 ° C.
Tre. DNA eller Cell Injection Under et stereomikroskop
- Fyll glasset pipette fra baksiden med en Hamilton sprøyte og riste på pipetten for å fjerne bobler på spissen.
- Sett pipetten på mikroinjeksjon holder; sette å holde trykket til 50 (DNA) eller 30 (celler) hPa, og injeksjonstrykket til 150 (DNA) til 300 (celler) hPa. Sett innsprøytningstid til 0,2 sek (DNA) eller 0,5 sek (celler). Disse innstillingene kan litt varierer i henhold til hvilken type microinjector og pipette.
- Pin embryoet til silikon bunnen gjennom plommesekken uten å berøre embryo riktig. Se region av hjertet og åpne sekk like over denne regionen.
- Legg fire pinner rundt embryo for å hindre enhver bevegelse under celle injeksjon.
- Bruke mikromanipluatoren (satt til manuell), slowly stilling pipettespissen i en vinkel på 45 ° over pericardium, like over det område av hjertet som skal injiseres (fig. 1).
- Flytt pipetten inn i regionen av interesse og utløse injeksjonen. Ta ut pipetten så raskt som mulig. Pass på at hjertet er skikkelig juling etter at DNA / celle injeksjon.
4. Embryo, Isolated Heart, og Eksplantering Kultur
- Kultur på E9.5 embryo i 25% M2 medium og 75% rotte serum, supplert med penicillin / streptomycin, forvarmet ved 37 ° C og oksygenrikt med 40% O 2.
- Tilsett 2 ml kulturmedium i et 25 ml glassrør, tilsett embryoet, og oksygenat med 40% O 2 før skru lokket på røret. Inkuber opp til 36 timer ved 37 ° C ved å rotere eller rister (30 omdreininger / min).
- På ønsket tidspunkt (f.eks 24 timer), dissekere hjertene nøye med fine tang, uten å berøre hjertene, etter første decapitating embryoene; hjertet er lett å avgiftsdirektoratet ved å trekke den ut ved hjelp av distal utstrømningen tarmkanalen.
- Kultur den isolerte hjertet for en annen 36-48 timer i DMEM med 50% FCS på en Matrigel-belagt innsats satt i en 12-brønns plate. Se Dyer & Patterson (2013) for en forbedret protokoll for hjertekultur 15..
- Gjør noe eksplantering av regionen av interesse. Som et eksempel, dissekere atrioventrikulær kanalen (AVC) og kultur det i 48 timer på kollagen type 1 gel 16.
5. Ultralyd-veiledet Injeksjon i hjertet jeg n utero
- Oppsett av ultralyd maskin og microinjector:
- Bruk høy oppløsning ultralyd system med en 40 MHz svinger og mikroinjeksjon oppsett på en rail.
- Sett injeksjonsvolum på microinjector på 69 nl per injeksjon. Se produsentens mikroinjeksjon manual for programmering av microinjector.
- Utarbeidelse av microinjection oppsett og injeksjon:
- Plasser et glass mikropipette i microinjector. For å sikre en effektiv injeksjon, første belegg på innersiden av pipetten med mineralolje ved å suge opp til det maksimale volum. Da mate oljen igjen, slik at på 1-2 mm av olje inne i nålen.
- Aspirer injektat inntil maksimalt volum er nådd. Vær forsiktig så du ikke å berøre noen overflater med nålespissen da dette vil sløv spissen og gjøre injeksjonen mer vanskelig.
- For å stabilisere livmor horn inneholder embryoene under injeksjon, bruker en modifisert petriskål med et hull i midten (2,5 cm diameter), dekket av et tynt silikonmembran med et lite slit kutt i sentrum, og plassere den over snittet området . Stabilisere petriskål på musen håndtering bordet ved å plassere 3-4 klumper av leire under kantene av fatet.
- Injeksjonsprosedyren:
- Barbere magen til en gravid mus (på ønsket fosterstadiet) før bedøvetsia å fjerne hår. Unn magen med et kjemisk hårfjerningsmiddel for å fjerne rester av hår og sterilisere med 70% etanol.
- Anesthetize en gravid mus med oksygen / isoflurane via en ansiktsmaske. Bruk 3-5% isofluran i 100% oksygen for initial anestesi, etterfulgt av 1-1,5% i løpet av resten av prosedyren. Kontroller at musen er tilstrekkelig bedøvet ved å klemme forsiktig labbene og / eller hale.
- Sett muse liggende på mus håndtering bordet (satt til å varme ved 37 ° C) og dekker øyne med smøremiddel for å hindre dehydrering av hornhinnen.
- Påfør elektrode gel på elektrodene og tape potene til elektrodene til å overvåke hjertefrekvens, pustefrekvens, og EKG. Plasser en rektal termometer for å overvåke kroppstemperatur.
- Kontroller først at musen er gravid ved å visualisere og telle embryoer ved ultralyd. Påfør ultralyd gel på magen og plasser skanne hodet over blæren. For konsistens, visualisere blæren første,og telle embryoer i venstre og høyre uterine horn, med start fra posisjonen av blæren. Sørg for at embryonale hjerter slå normalt.
- Hvis musen er gravid, plassere petriskål over fremtiden innsnitt området med leire. Trykk på tallerken litt på magen, slik at retten er i direkte kontakt.
- Fjern fatet og sterilisere magen igjen. Lag en 1,5-2 cm ventral midtlinjesnitt ca 0.75-1 cm over vagina, for å åpne buken og bukhinnen. Unngå skader på indre organer.
- Exteriorize venstre eller høyre livmor horn med tang, dra det forsiktig gjennom silisium membran av fatet, og stabilisere fatet på leire igjen. Unngå omfattende trekke eller manipulasjon, da dette kan forårsake blødninger i livmor fartøy og for tidlig død av den kvinnelige og / eller embryo.
- Telle embryoene igjen for å sikre tilstrekkelig journalføring av hvilke embryoer ble injisert.
- Påfør ultralyd gel på uterine horn til bilde hjertet og for å hindre dehydrering.
- Bilde første embryo som skal injiseres. Sjekk normal juling av den embryonale hjertet og holde oversikt over den kranie-caudal og venstre-høyre orientering av embryoet. Om nødvendig, flytt livmor horn litt for å sikre riktig retning. Hvis dette viser seg vanskelig, gå videre til neste embryo.
- Punkter uterus omhyggelig med mikroinjeksjon nål for å posisjonere kanylen i en 45 ° vinkel over embryo, litt utenfor perikardium (figur 3). For merking av epikardiale celler, image hjertet i en fire-kammer utsikt og plassere nålen slik at den peker mot atrioventrikulær groove (figur 3). Hvis vinkelen må justeres, trekk ut nålen, og flytte. Ikke justere vinkelen med nålen inne i livmoren, siden dette kan bryte nålen. Unngå punktering andre vev, for eksempel lemmer eller morkake.
- Flytt nålenpå perikard veggen og punktere den med en mild, men rask bevegelse. Generelt vil det være en viss motstand, men beveger nålen for fort kan føre til at nålespissen å punktere hjertet selv. Spissen skulle ende opp i perikard plass av atrioventrikulær groove. I tilfelle av pericardial blødning, vil blodceller bli synlig som et hvitt sne-lignende mønster. Hvis dette er tilfelle, stopp injisere embryo og gå videre til et annet embryo.
- Injisere injektat. Injiser maksimalt 700 nl inn i det perikardiale plass for å forhindre ugunstig innvirkning på hjerte utvikling. Overvåk riktig injeksjons ved svak, verdslig hevelse i perikardial sac.
- Etter injeksjon, trekk nålen ut og bekrefte at injektat kan fortsatt bli kastet ut for å sikre at nålen ikke ble tilstoppet av vev fragmenter.
- Omplassere håndtering tabellen til bilde og injisere den neste embryo. Hold antall injiserte embryoer maksimalt gå opp til 3-4 (i en uterine horn) for å hindreforlenget anestesi, for å tillate kontroll-embryoer i motstålivmorhornet, og for å sikre at fremgangsmåten ikke forstyrr embryonal utvikling.
- Etter å ha injisert ønsket antall embryoer, fjerne overflødig ultralyd gel og påfør livmor horn tilbake i magen i sin rette posisjon.
- Lukke maternal magen ved hjelp av et lag av suturen for peritoneum og magemusklene, og et andre lag av suturen for huden.
- Injisere mus med den første dosen av smertestillende medikamenter. Bruk én injeksjon med 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfin 15 min før slutt anestesi og ytterligere tre injeksjoner med 12 timers mellomrom.
- Avvikle anestesi og overvåke musen for tilstrekkelig utvinning fra prosedyren. Hus den gravide mus i en individuell bur for ønsket varighet på oppfølging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av injeksjons protokoller som er beskrevet ovenfor, kan cellene være merket og / eller sprøytes inn i embryonale muse hjerte. Som bevis på konseptet, er vist flere eksempler hvor injeksjonsprotokoll og ex vivo AVC eksplantering, isolerte hjerte, eller hele embryoet kultur ble slått sammen (fig. 1).
Figur 1 viser fremstillingen av embryoet før celleinjeksjon. Den E9.5 embryo er fjernet fra sin decidua samtidig opprettholde integriteten til plommesekken (figur 1A). Plommesekken blir åpnet like over hjertet (Figur 1B). Pipetten er kontaktet (figur 1C), og cellene injisert. Hjertet beholder sin form (figur 1D) og forblir juling.
For å møte en mer spesifikk biologisk spørsmål i utviklingsbiologi som epiteliale å mesenchyme overgang (EMT), ble en E9.5 AVC explant injisert med en shRNA som nedregulerer et protein som kreves for endothelial-mesenchymale overgang av endokardiale celler (Figur 2A). Kontrollen embryo ble injisert med en tom vektor ryggrad. På samme måte ble det fargetoner celle-stammer endoteliale pre-ventil celler som uttrykker GFP under kontroll av promoteren Sox9 injisert i AVC ved E10.5, etterfulgt av 48 timers eksplantert hjerte kultur. Disse cellene skaffe markører for EMT som periostin lik den endogene endokardiale celler (figurene 2B og 2C).
Disse ex vivo tilnærminger er relativt enkelt, men begrenset til kortsiktig oppfølging (maksimalt 48-72 timer). Den ultralydveiledet injeksjonsprosedyren gir en teknisk mer utfordrende tilnærming, men med mulighet for langsiktig, selv etter fødselen, in utero oppfølging. Den in utero injeksjon av fargestoff eller virale vektorer å merke celler i bestemte hjerte-regioner er vist i figurene 3A-3 C. Med denne metoden kan spesifikk merking av epikardiale celler oppnås med fluorescerende fargestoffer (figurene 3D og 3E) eller virus (figur 3F), og fremgangsmåten kan utvides ved med celler eller alternative injectates.
. Figur 1 Cell injeksjon i hjertet A:.. E9.5 embryo i plommesekken B: visualisering av hjertet etter å ha åpnet plommesekken like over hjertet. Det innfelte nedenfor viser en forstørrelse av hjertet, og peker AV-kanalen C:. Tilnærming av pipetten mot AVC D:. Injisert embryo etter 48 timers kultur (H = hjerte).
. Figur 2 Injeksjon av en shRNA i AVC av en E9.5 embryo som hindrer ex vivo EMT av endokardiale celler i en hjerte eksplantering A:. Kontroll ryggrad vektor eller en shRNA ble injisert sammen med lipotectamine i AVC av en E9.5 muse fosteret; 3 timer senere ble AVC dissekert ut og dyrket på en kollagen-gel for å utløse EMT av endokardiale celler. Den shRNA downregulated et protein som er nødvendig for EMT BC:. Fargetoner celle-stammer ventil celler konstruert for å uttrykke GFP under kontroll av den Sox9 promotoren ble injisert i AVC av E10.5 embryoer. Hjertet ble dyrket i 2 dager (B) og deretter fiksert og farget med et anti-periostin antistoff (C). Det innfelte viser en forstørrelse av AVC-regionen.
.. Figur 3 I utero injeksjon A: ordningen viser den eksperimentelle oppsettet. Den gravide mus er plassert liggende og en petriskål med silikonmembran er stabilisert over snittet området. . 1 = microinjector, 2 = svinger, 3 = petriskål med silikonmembran, 4 = ultralyd gel, 5 = mus med livmor horn (rød), 6 = Play-Doh leire, 7 = mus håndtering tabell B: stillbilde av en ultralyd-film (M-modus) som viser plasseringen av nålen og embryonale hjerte før injeksjon. Den kvinnelige EKG vises nederst (grønn), og hjerte-og pustefrekvens i nedre høyre (gul). H = heart C:. Ultralydbilde som viser plasseringen av nålen og embryonale hjertet under injeksjonen. Innfelt: spissen har passert hjerteposen, men ikke berører hjertemuskelen, slik at injectspiste kan injiseres inn i det perikardiale plass på atrioventrikulær sporet. Svarte stiplede linjene markerer grensene til atriet (A) og hjertekammer (V) D:. Hele montere bildet av en E11.5 mus embryo som viser sterk fluorescens av fargestoff i perikard plass E:. Representativt snitt av en E11.5 embryonale mus hjerte viser perikard og epicardial celle merking med et fluorescerende fargestoff (CDCFDA-SE, grønn) 4 timer etter injeksjonen. Nuclei er merket med DAPI (blå). LA = venstre atrium, LV = venstre ventrikkel, RA = høyre atrium, RV = høyre ventrikkel F:. Representativt snitt av en E14.5 embryonale mus hjerte viser mosaikk epicardial celle merking med GFP-uttrykke lentivirus tre dager etter injeksjon. For å bekrefte GFP spesifisitet ble GFP protein også farget med en GFP antistoff (rød). Nuclei er merket med DAPI (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den intra-kardiale ex vivo injeksjon protokollen beskrevet ovenfor er utformet for å bevare hjerteinfarkt funksjon i minst 48 timer i midten av scenen (E9.5-E11.5) mus embryoer. Disse injeksjons tilnærminger tillate romlig målrettet injeksjon av DNA eller celler. De få eksemplene som er vist i figur 1-3 gir proof of concept for opptegning ex vivo og in vivo molekylære mekanismer av utviklingsprosesser som finner sted i bundne hjerte regioner, slik som EMT av endokardiale eller epikardiale celler. Viktigst av disse protokollene tilveiebringe en mulighet til å følge migrasjon og skjebne injiserte celler som humane embryonale celler eller huESC derivater i et riktig embryoniske miljø, et hittil udekket utfordring. In vivo merking (som de epikardiale celler i figur 3) med mette eller begrense fortynninger av fargestoff eller virus tillater avstamning sporing av celle (sub) populasjoner på kort så vel som langsiktige basis, uten behov for Cre / lox-teknologi (selv om å kombinere disse teknikkene kan være nyttig i tillegg).
Det ble observert flere viktige skritt når en bruker disse protokollene. Først embryoene er svært følsomme for lys. Det anbefales derfor å praktisere injeksjonsprotokoll under et stereomikroskop, slik at fremgangsmåten kan utføres med høy reproduserbarhet og effektivitet i løpet av 15 min pr embryo. I samme linje, bør hele ultralyd-mediert injeksjonsprosedyren utføres innen 30 minutter for å bevare en god levedyktighet av befruktede egg og å ikke svekke deres in utero utviklingen. Manipulering av livmoren bør holdes på et minimum. I tillegg bør det bemerkes at operasjonen på gravide mus en tendens til å resultere i for tidlig fødsel (1-2 dager tidligere enn normalt). Imidlertid bør nyfødte være generelt sunn og utvikle seg normalt. Videre inntrengning av pipetten gjennom livmorveggen, plommesekken og embryoetfor å nå posen og til slutt myokard er en vanskelig prosedyre (trinn 5.3.13). Dette trinnet bør gjøres nøye og forsiktig. For optimalisering, anbefales det å utføre flere kortsiktige fargestoff injeksjoner for å bestemme reproduserbarhet og inkluderer injeksjon i ikke-målrettede områder. Endelig har vi ikke funnet utviklings kardiale defekter knyttet til injeksjon prosedyrer for eksemplene gitt ovenfor. Men en mer detaljert, scene-for-scene, morfologisk og funksjonell analyse bør utføres for å helt fastslå normal utvikling og funksjon i løpet av de stadier av interesse.
Begrensningene av disse teknologiene er flere. (I) Injeksjon under stereomikroskopet er begrenset av lys og temperaturfølsomhet av museembryoer. Dette kan overvinnes ved utøvelse av den mikroinjeksjon fremgangsmåte for å være så rask som mulig, regelmessig utskifting eller oppvarming av mediet, og som arbeider i et mørkt rom. (Ii) Den tidligere vIvo kultur av embryoer eller eksplantater er begrenset i tid, i motsetning til i utero ultralydveiledet injeksjon, noe som gir mulighet for langsiktig oppfølging. Vital fargestoffer tendens til å merke celler nesten umiddelbart og være synlig opp til tre til fire dager etter injeksjon. Imidlertid vil intensiteten av fargestoffet fortynnes med suksessive celledelinger. Merking celler med lentivirus kan løse dette problemet. Imidlertid opptak av viruset tar flere timer, og uttrykket er optimalt etter 24 til 48 timer, noe som hindrer at kortvarige analyser. (Iii) Den ultralyd-mediert injeksjon er begrenset av kostnaden for utstyret. Oppløsningen på 40 MHz transducer er tilstrekkelig for midt-og sen-stadium embryoer, men mer begrensende for stadiene før E11.5.
I sammendraget, foreslår vi at hjerte injeksjon protokollen beskrevet ovenfor bør brukes i mid-trinns mus embryoer. Den ex vivo teknikken er kompatibel med kulturen i embryoer, isolerte hjerter, eller eksplanterings. In vivo-prosedyren gjør for langsiktig oppfølging, inkludert post-natal utvikling. Disse teknikkene vil bidra i betydelig grad i å teste differensiering potensialet av human stamcelle-derivater i et riktig miljø, så vel som for å ta opp spesifikke spørsmål utviklingsbiologi eksempel cellemigrasjon og regionale signaler, som er viktige hendelser på veien mot å forme en funksjonell hjerte . I tillegg kan våre metoder og andres 10 i fremtiden bli brukt til etterforskning av andre organer enn hjertet, avhengig av ledig ex vivo kultur protokoller og / eller utviklingsstadiet in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner stiftelsen Leducq (mitral) og Agence Nationale pour la Recherche (gi ANR Specistem) for å finansiere denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μm external diameter |
| Pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| Microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petri dishes | 10-cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| Eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Other | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60-mm diameter | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| Rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| Pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| Fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| Culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
