Summary
이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
마우스 각막 micropocket 분석은 혈관 형성을 평가하기위한 강력하고 정량적 생체 분석이다. 무 혈관 각막에 걸쳐 자연적으로 혈관의 성장을 유발 특정 성장 인자를 포함하는 표준화 된 서방 형 펠렛을 사용함으로써, 혈관 신생을 측정 및 정량화 될 수있다. 본 분석에서 사용되는 혈관 신생 반응은 성장 인자의 종류와 양에 따라 몇 일에 걸쳐 발생된다. 신생 혈관의 유도는 일반적으로 하나 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 또는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 트리거된다. hydron 및 수크 랄 페이트 (폴리-HEMA (폴리 (2 - 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트))) 및 펠릿 혼합물을 캐스팅 이들 성장 인자를 조합하여, 그들은 수술 마우스 눈에 이식 될 수있다. 이러한 균일 한 펠릿을 용기 영역 Q에 필요한 충분한 혈관 반응을 가능하게 (각각의 bFGF 또는 VEGF) 대여섯 일 동안 성장 인자를 느리게 출시슬릿 램프를 사용하여 uantification. 이 분석은 혈관 신생 변조기 약물이나 치료법뿐만 아니라 혈관 형성에 영향을 미치는 유전 적 배경을 가지의 비교 평가를 포함한 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 분석을 연습 후 숙련 된 조사관이 눈 미만 5 분의 펠렛을 이식 할 수 있습니다.
Introduction
혈관 신생 과정은 새로운 혈관의 형성은 기존의 것들을 형성, 매우 복잡하고 혈관 발아와 형태 형성의 여러 단계를 제어하는 여러 내인성 인자에 의해 조절된다. 혈관 신생 인해 프로 및 항 - 혈관 신생 인자의 균형의 변화, 통상적으로 정지 상태를 유지 맥관 밸런스에 트리거된다. 성인의 혈관 신생은 여성의 난소주기 동안이나 같은 상처 치유 및 조직 재생 등의 수리 과정에서 특정 생리 학적 조건에서 발생합니다. 그러나, 또한 악성 종양,자가 면역 질환 및 염증성 상태를 포함한 여러 병리 상태의 특징이다. 이러한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 신생의 참여는 연구와 치료를위한 매력적인 대상의 중요한 주제 있습니다.
때문에 혈관의 복잡성과 여러 가전의 참여에모델을 한정 남아 독특한 생체 미세 요점을 되풀이 할 수 관내 내피 세포, 혈관 주위 세포, 순환 세포와 간질 세포를 포함하는 과정에서 LLS와 요인. 혈관 신생의 체외 분석의 주요 크게 내피 세포에 직접적인 영향을 관찰하고 통제 된 조건에서 혈관 신생 과정의 특정 단계를 측정에 초점을 맞추고있다. 이러한 분석법은 내피 세포 증식 1, 마이그레이션이, 네트워크 형성 3, 관 형성 (4)의 정량화 및 타원체 5 돋아을 포함한다. 생체 내 모델을 시험 관내 것과 달리, 더 복잡하고 다양한 조직 세포 유형을 포함, 예 되 대동맥 링 분석 6. 생체에 존재하는 역시, 다른 시스템과 마찬가지로 순환 세포의 기여 및 내피 세포의 천연 기질을 캡처 할 수있다. 시도많은 개선되지만, 마이크로 유체 시스템 (7)을 사용하여 수행되는 생체 내 세팅 그러나 심지어 이러한 분석법을 모방 흐름 하에서 혈관 신생을 연구, 생체 내에서 여전히 존재하는 모든 구획을 설명 할 수 없다.
인해 시험 관내 및 생체 외에서 혈관 신생 모델의 한계로 생체 내 혈관 신생 모델 연구에 대한보다 안정적인 선택 남아있다. 이러한 모델의 예는 현미경 8 미만 성장하는 혈관의 시각화를 허용 투명한 챔버, "윈도우"의 주입을 포함, 예컨대 마우스 귀 및 닭 융모 막과 같은 정상 조직에있는 매트 리겔 및 혈관 형성과 같은 주사 피하 임플란트 (CAM ). 그러나, 대부분의 허용 및 정량 생체 내 혈관 신생 모델 중 하나는 자연적 무혈성 이용한다 여기서 설명 micropocket 각막 신생 혈관 분석이며,"화면"으로 각막 시각화하고 새로운 혈관 성장을 구를 평가합니다.
생쥐에서 개발로 여기에서 우리는 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다. 초기 모델 토끼 각막 혈관 신생 비특이적 자극을 측정 하였다. 이 토끼 눈의 전방의 방수에 종양 조각을 도입하여 수행 종양에 의한 혈관 신생 (11)을 측정 하였다.
그러나, 분석은 나중에 더 나은 지정하고 혈관 신생 효과를 표준화하기 위해 특정 성장의 효과를 연구하기 위해 열 요인 진화했다. 눈에 성장 인자를 분리하기 위하여, 혈관 신생 성장 인자의 공지 된 양을 함유하는 서방 형 펠렛 대신 원단으로 사용 하였다. 등의 bFGF 또는 VEGF와 같은 정제 된 재조합 혈관 형성 단백질의 가용성은 혈관 신생 modulaters (12)의 특정 대상으로 사용을 활성화. 초기에, 분석했다대부분의 크기로 인해 나중에 모델이 마우스로 번역 작업하기 쉽게 토끼에 사용; 더 작고 덜 비싼 동물 모델. 마우스에 토끼로부터 이동시켜 혈관 (13)에 영향을 미치는 유전 적 구성 요소에 대한 연구의 새로운 영역을 생성, 유전자 조작 된 동물을 사용 할 수 있다는 중요한 장점을 제공했다. 혈관 신생 연구에서 각막 분석의 더 이용 목적에 더하여, 다른 생물학적 과정은 또한 수정 된 분석법을 사용하여 조사되고있다. 예를 들어, 림프관의 연구는 특정 분자 마커 (14)를 통해 림프 혈관의 시각화를 허용 저용량의 bFGF 펠렛의 주입을 통해 가능하게되었다. 또한,이 분석은 혈관 (15) 상에 방사선의 효과를 평가하는 수단을 제공했다.
요약하면, 각막의 혈관 신생 micropocket 분석은 정량적, 담당자는roducible, 생체 내에서 혈관을 유연하게 평가. 이 분석의 주요 장점은 용기가 자연스럽게 무 혈관 조직에서 성장하기 때문에 배경 혈관의 측정이 필요하다는 것이다. 우리는 여기에서 자세한 내용이 분석의 프로토콜을 설명하고 발생할 수있는 다양한 시나리오에 대해 설명합니다. 분석은 3 이산 세그먼트로 구성되어 있습니다. 여기에서는 생성 된 신생 혈관 성장을 정량화하는 데 사용되는 성장 인자를 포함하는 펠릿의 제조에, 후속 수술 이식 최종적 방법을 서술한다.
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Protocol
동물을 포함한 모든 프로토콜에 제출하고 승인 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 보스턴 어린이 병원에와 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 권고에 따라 실시된다. 절차를 수행하는 동안 멸균 계측 및 무균 techniqure을 사용하십시오.
펠렛의 1 준비
- 수크 랄 페이트 10 ㎎ 및 멸균 구부러 주걱 hydron의 60 mg의 달다. 별도의 microcentrifuge 튜브에 배치합니다.
- 멸균 10cm 접시에 메쉬의 1cm 사각형 조각을 놓습니다. 그래서 얕은 뚜껑에 달려 메쉬 반전. 옆으로 설정합니다.
- 적어도 10 분 동안 hydron와 소용돌이에 에탄올 500 μl를 추가합니다.
- 간단히 수크 랄 페이트와 소용돌이에 : 성장 인자 (bFGF를 20 μg, VEGF에 대한 50 μg 기준)의 해당 금액을 추가합니다. 보관 성장 인자1 ㎎ / ㎖의 농도에서 -80 ° C 냉동고. 추가 액체 볼륨은 완전히 묻힌 수크 랄 페이트을 보장하기 위해 20 μl를 최소해야하지만, 50 μl를 초과하지 않아야합니다. 큰 부피는 다음 단계에서의 액체의 증발이 어렵게 만든다.
- 혼합물이 완전히 건조 될 때까지 사용되는 액체의 양에 따라 일반적으로 30 ~ 50 분, 낮은에서 설정 한 원심 증발기로 수크 랄 페이트 혼합물을 놓습니다.
- 멸균 주걱의 테이퍼 끝 잔류 수분의 혼합물을 확인합니다. 혼합물은 "사각 사각"느껴야한다.
- 튜브 내에서 수크 랄 페이트 혼합물을 분리시킨 주걱의 테이퍼 끝을 사용합니다.
- 수크 랄 페이트에 hydron의 10 μl를 추가합니다.
- 때문에 hydron의 점성 특성으로 200 μL 피펫 팁의 끝을 절단 한 후 그려 다시 피펫 팅 및 수크 랄 페이트에 추가하기 전에 10 μl를 놓습니다.
- 신속하게 구부러진 말다툼을 사용울라는 hydron 및 수크 랄 페이트를 혼합 튜브에서 제거합니다.
- 절곡 주걱 끝의 바닥 측을 따라 혼합물을 모아서 튜브의 벽을 따라 주걱을 그리면서 다음 튜브를 회전한다. 이 단계가 효율적으로 수행해야하므로, 혼합물을 신속하게 건조된다.
- 제자리에 고정 집게를 사용하여 제조 된 메쉬 상 혼합물을 확산. 혼합물에도 층일과 메쉬의 구멍에 기입한다.
- 튜브 포함 hydron로 구부러진 주걱을 담그고 메쉬가 코트에게 양면을 사용합니다.
- 접시의 가장자리에 측면에 기울고 코팅 된 메쉬를 넣고 30 ~ 45 분 동안 실온에서 건조 할 수 있습니다.
- -20 ° C의 냉동고에서 메시를 놓거나 다음 단계로 바로 진행합니다. 접시 내부에 메쉬를 유지합니다.
- 큰 페트리 접시, 뚜껑의 내부에 35mm 접시를 놓습니다. 신중하게 떨어져 35mm의 접시 위에 메쉬의 섬유를 당겨 집게의 쌍을 사용합니다. 길 잃은 펠릿 C이 단부에 큰 접시에서 수집 될 수있다.
- 범위에 균일 알약을 확인합니다. 따라서 프로세스는 bFGF에 대한 펠릿 당 표준 투여 량을 대략 250 펠릿을 산출하고 VEGF는 각각 80, 200 NG NG이다.
- 최대 3 개월 -20 ° C 냉동고에서 35mm 접시에 보관 펠렛.
펠렛의 2 외과 이식
- 운영 현미경 수술 영역을 설정합니다.
- AVERTIN (400 ~ 500 ㎎ / ㎏, 복강 내)와 마우스를 마취 등의 눈이 볼 수 현미경으로 마우스를 놓습니다. 마취의 충분한 수준을 보장하기 위해 발가락 핀치를 수행합니다.
- 안구 꼭대기 proparacaine 용액 1 방울을 배치하여 마우스를 마취 눈. 20 ~ 30 초 정도 기다렸다가 거즈 패드를 가볍게 두 드리십시오.
- 흠집이 생길 수 #와 포셉과 눈 사이의 피부를 떠날 특정되는 한 보석상의 집게를 마우스 눈을 Proptose. 이 올바르게 적용 압력을 판단하는 것이 중요합니다.60; 너무 단단히 눈을 잡고 너무 눈 수술 중 이동할 수 보류를 느슨하게하면서, 빨간색과 자극이 될 원인이됩니다.
- 각막으로 각막 윤부에서 약 1mm를 절개를하기 위해 30 ° microknife를 사용합니다. 절개의 길이는 1 ~ 2 mm 이상이어야한다. 절개는 midstroma에 상피층을 넘어 침투 깊이만큼 있지만, 눈을 파열 너무 깊이하지해야합니다.
- 절개에 수직 인 포켓을 만들기 위해 폰 그라프 칼을 사용한다.
- 절개 사이트에서 각막 층 아래에 칼을 밀어 부드럽게에서 칼을 작동하므로 주머니를 형성하는 공간을 확대 절개을 따라 이동합니다. 그것은 눈의 곡률로 작업 할 수있을뿐만 아니라, 마우스를 이동하는 데 도움. 눈을 파열 방지하기 위해 끝이 아래로 밀어하지 않도록주의하십시오.
- proparacaine와 # 5 보석상의 집게를 적신 접시에서 펠렛을 선택합니다. 눈에 펠릿을 넣습니다. proparacaine와 폰 그라프 칼을 적셔하고 고무하고 유연하게 펠릿에 액체의 일부를 전송합니다. 거즈 패드 나 면봉으로 과도한 습기를 제거합니다.
- 각막 층 아래 내부를 밀어 폰 그라프 칼을 사용하여 주머니에 펠릿을 넣습니다. 전체 펠릿 내부되면, 펠렛의 안전을 확인하기 위해 사이트를 통해 폰 그라프 칼의 평평한면을 실행합니다.
- 코트 트리플 항생제 연고와 눈.
- 위에 마우스를 켜고 반대 눈 수술을 반복합니다.
각막 신생 혈관의 3 정량화.
시간의 집합 기간 동안 선박을 개발하기 위해 동물을 둡니다. 용기 등급의 일이 사용 성장 인자에 따라 달라집니다. 학년의 bFGF는 일 6 일에 (5)와 약한 VEGF에 주입의 일이 일 0입니다.
- AVERTIN와 마우스 (400 ~ 500 ㎎ / ㎏, 복강 내)를 마취.
- GRA 용 세극등 현미경을 사용땡. 한 눈은 혈관이 성장하는데 유독 눈의 둘레 선박의 길이와 거리를 정량화하는 측정 보조 장치로서 사용 접안 렌즈 내의 십자선, 선이있다.
- 그래서 눈은 바로 앞 펠릿 눈에 볼 마우스를 위치, 범위의 앞에 마우스를 잡습니다. 피부는 얼굴에 체결과 눈이 약간 proptosed되도록 엄지 손가락과 집게 손가락 사이의 머리를 안정.
- 윤부 혈관을 따라 직접 펠릿 아래의 십자선의 y 축 놓습니다. 펠릿을 향해 상향 분지 혈관의 길이를 측정한다. mm의 십분의이 측정을 기록하고 선박 길이 (VL) (그림 1A)를 지정합니다.
- 이 선박은 싹 것을 눈 주위의 거리가 분명이되도록 마우스 나 십자선를 돌립니다. 그것은 12 지정이 번호 클럭 시간 (CH) (그림 1을 통해 하나의 간격 시계 얼굴과 눈을 생각하는 가장 쉬운 방법입니다B). 그것은 전체 번호 또는 0.25 (예를 들면, 2, 2.25, 2.5 또는 2.75)의 분수를 할 수 있습니다. 참고 : CH는 주관적이다. 예를 들어, 일부는 다른 용기 길이가 절반 최대 인 지점에서의 측정을 중지 할 수있는 동안 윤부로부터 발아 모든 선박을 포함하는 눈 주위의 거리를 측정 할 수있다. 중요한 요소는 한 학년에 선택하는 방법과 일치하는 것입니다.
각막 혈관 신생의 정량도 1. (A) 80 ng의 bFGF로 펠렛 C57BL / 6J 마우스 혈관 길이를 측정하도록 배향 세극등 레티클을 도시에 이식한다. VL = 0.9 mm. (B) 같은 눈 보여주는 세극등 레티클은 시계 시간을 측정하기 위해 회전. CH = 3.25. 계산 된 혈관 영역 = 1.84mm 2. 이 이미지들은 디지털 십자선 회로도를 추가 할 수 있도록 향상되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 타원형의 영역을 기반으로 아래의 식을 이용하여 혈관 영역 (VA), 계산 익스프레스 VA 제곱 밀리미터 (참고, 그것은 채점 할 때이 점을 명심하도록. 도움이된다). 수식은 다음과 같습니다
선박 세로 x 시계 시간 X 0.2 π = 선박 지역
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Representative Results
통상 낮은 혈관 신생 C57BL / 6J 생쥐의 bFGF와 VEGF 펠렛 전형적인 결과가도 2A 및 B에 도시되어, 각각.도 2E 이러한 성장의 다양한 투여와 C57BL / 6J 균주에서 혈관 영역의 정규 분포 (VA)을 나타낸다 요인. 1.8-2.4 mm (2)의 범위의 값이 허용 비록 80 ng의 bFGF의 펠렛은 일반적으로, 대략 2.0 mm 2의 VA 초래한다. 200 ng를 VEGF 펠렛은 일반적으로 0.6-0.9 mm (2)의 허용되는 값의 범위는 약 0.7 mm (2)의 반응을 일으킨다. 항 - 혈관 신생 효과가 의심되는 실험을 위해, 더 큰 용기 영역 감소를 시각화 할 수있는 것이 바람직하다. 3의 bFGF 구동 신생 혈관에서 항 혈관 약물 탈리도마이드의 효과를 보여준다. 치료는 혈관의 성장을 38 % 억제되었습니다. 여기서 실험에 증가 수도이 표준 펠릿 근처 최대 응답 발생의 원인이되므로 저용량을 사용하는 것이 가장 좋습니다 예상된다. 10 ~ 40 NG의 bFGF로 구성된 펠렛 더 적절한 (그림 2C)이 될 것이다.
특정 성장 인자에 대한 높은 혈관 신생 반응을하는 것으로 알려진 균주 VA보기 배 전형적인 낮은 혈관 신생 균주의 이상을 가질 수있다.도 2d는 20 겨 FGF 펠릿에 129S1 / SvImJ 마우스의 반응을 보여준다. 비교를 위해, 동일한 투여 펠릿도 2c의 C57BL / 6J에 도시된다. bFGF- 및 VEGF-유도 된 신생 혈관 모두에 다양한 균주의 혈관 신생 잠재력을 자세하게 설명하는 폭 넓은 테이블은 이전에 우리가 실험실 (13)에 의해 출판되었다.
특정 균주 또는 색소 침착은 펠릿에 대한 응답으로 홍채 혈관의 성장 또는 누수가 발생할 수 있습니다. 이것은 하나의 발생 또는 개별 마우스의 두 눈과 수도 있고 천만 이상 일치하지 않을 수 있습니다상기 분석이 수행되는 반사성 기. 이 현상은 전방 (전방 출혈)을 채우기 위해 혈액을 일으키는 원인이되는 홍채 혈관의 파열 될 수 있습니다. Hyphemas는. 어렵거나 불가능 각막 신생 혈관을 만들 등급 4이 발생 중성 (4A) 및 중증 (4B) 양식을 보여줍니다도 할 수 있습니다.
도 성장 인자 - 유도 된 각막 혈관 신생의 예 2. (A) 80 ng의 bFGF로 펠렛이 2.0 mm와 동일한 용기 영역의 결과 낮은 혈관 신생 C57BL / 6J 마우스에 주입. 이 투여 량은 혈관 펠릿 도달하고으로 성장하게하는 것이 매우 일반적이다. (B)에 주입 20 ng의 bFGF로 펠렛C57BL / 6J 마우스, 1.04 mm이 동일한 용기 영역의 결과. (C) 200 ng의 VEGF의 펠렛이 0.71 mm와 동일한 용기 영역 초래 C57BL / 6J 마우스에 주입. 높은 혈관 129S1 / SvImJ 균주의 (D) 20 NG의 bFGF 펠렛. (C)에 비해,도 20 ng의 FGF의 펠렛은,이 균주를 갖는 혈관 전위보다 C57BL / 6J 쥐의 두 배 이상. (E) 각막 신생 혈관 영역은 VEGF 또는 bFGF를 하나의 용량을 증가시켜 유도 C57BL / 6J 쥐 (평균 ± 표준 편차, N = 10). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
bFGF를 유도 VESS의 그림 3 억제항 혈관 대리인 엘 성장. (A) 제어 차량 처리 C57BL / 6J 마우스입니다. 2.0 mm이 동일한 기 용기 영역에서 얻어진 80 ng의 bFGF를 펠릿 주입. (B) 탈리도마이드 (5 일간 경구 200 밀리그램 / kg)을 처리 한 마우스. 그룹 용기 영역은 1.25 mm 2와 같고 혈관 성장에 38 %의 감소를 반영합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 성장 쥐의 홍채 요인에 의한 hyphemas. (A) C57BL / 6J-TyrC-2J / J 경미한 전방 출혈. 이 균주는 색소 대응과 같은 각막 신생 혈관을 전시하지만 더 프로입니다북동 출혈 아이리스. 129P3 / J 마우스에서 (B) 대규모 전방 출혈. 전체 눈은 붉은 색조뿐만 아니라 가까운 홍채 아래로 피가 더 뚜렷 풀을 보유하고 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성공적인 각막 분석을 수행하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 이식되는 선박을 자극 할 수있는 균일 한 알약을하고있다. 펠릿 제조의 가장 중요한 부분)은 반송파없이 성장 인자를 사용하는 일이다; 2) 펠릿 주조 메쉬 에펜 도르프 튜브에서 신속하지만 신중 최종 혼합물을 이동) 및 수크 랄 페이트 hydron 3과 성장 인자의 양호한 혼합을 보장한다. 그것은 "더미"펠릿 기술을 연습 성장 인자없이하는 것이 좋습니다. 펠렛은 흰색과 백악질 표시와 모양이 대략 사각형이어야한다. 이 지역은 가능성 만 hydron을 포함하기 때문에 명확한 영역을 포함 모든 펠렛을 제외해야합니다. 또한 펠릿 모방 헤파린 결합 수크 랄 페이트의 포함에 의해 안정화되는 에탄올 및 그와 bFGF와 VEGF 형성되어 있음에 유의해야한다. 수크 랄 페이트 또한 PL 느린 방출을 제공하는 역할성장 인자 atform. 다른 자극 또는 억제가 펠릿에 추가하는 경우, 이러한 요인은 에탄올의 안정성을 결정하는 첫번째 테스트해야합니다. 그것은 "더미"펠릿이 처음이 기술을 연습 성장 인자없이하는 것이 좋습니다. "더미"또는 가짜 펠릿 성장 인자 또는 화합물의 볼륨을 대체 PBS 만 수크 랄 페이트와 hydron 테스트중인이 포함되어 있습니다. 이 펠릿은 혈관 성장 또는 각막 윤부 염증을 자극하지 않습니다. 샴 펠릿 에이전트 친 혈관 것으로 의심되고 펠릿에 성장 인자의 첨가없이 시험 실험에 적절한 제어의 역할을한다. 화합물 및 성장 인자가 성장 인자의 경우 펠릿만으로는 적절한 제어하는 것이 상호 작용이 조사되는 경우, 펠렛을 위해 조합 될 수있다.
외과 주입 분석의 가장 어려운 부분입니다.0; 이는 절개에 적절한 깊이를 측정하기 위해 초기에 매우 어렵다. 너무 깊은 절개 파열 세계를 원인과 눈가 작동된다. 이 극적인 효과이며 따라서 한 빨리 눈 "팝업"하지 배운다. 그것은 지속적으로 주머니 형성이 가능하도록 충분히 깊은 절개를 만들기 위해 상당히 오래 걸립니다. 절개가 너무 얕하면 각막의 최상부 층은 쉽게 손상되거나 그것이 포켓을 만들기 위해 삽입 될 때 폰 그라프 칼로 찢어. 새로운 혈관의 성장을 정량화의 마지막 단계는 채점 방식의 일관성을 요구한다. 눈의 원주 둘레 성장을 묘사 한 클럭 시간 값보다 주관적 동안 혈관 길이는 직접적인 측정이다. 사용 방법은 마우스에서 마우스로 실험 사이에서 동일해야한다.
분석의 또 다른 중요한 요소는 마취의 선택이있을 수있다간편하고 수술의 성공에 영향. 는 노즈콘을 통해 전달 기화 마취 달리 마우스의 쉬운 조작으로 주사 가능 AVERTIN는 적어도 복잡하다. 이 때문에 설치류 (16, 17)의 각막 병변와의 연결뿐만 아니라 케타민과 자일 라진 (xylazine)의 결합을 방지하는 것이 좋습니다.
이것은 실험 기간 동안 마우스의 체중에 변화를 주목하는 것이 중요하다. 체중 감소는 가난한 주택 조건이나 질병을 나타내는 수 있으며 이러한 부정적인 눈에 혈관을 성장 마우스의 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 중량 손실 중량의 비율 (있는 경우)를 결정하기 위해 펠릿 주입 및 용기 그레이딩 일에주의해야한다. 5 % 이하의 손실이 허용되고, 특히 빈번한 투약 치료 실험 동안, 마우스를 처리하는 스트레스에 기인 할 수있다. 5 % 이상의 체중 감소가 우려스러운이며 비특이적 것혈관 성장을 억제. 따라서 이러한 실험 결과는 유효하지 않은 것으로 간주한다.
절차 기법 및 변수 연구의 효능 실험에서 고유의 변동을 고려하여, 마우스의 최소 개수가 유효한 결과를 달성하기 위해 사용되어야한다. 우리의 경험에서 우리는 10 눈의 N을 산출 그룹 당 5 쥐보다 적은 수의 조언을하지 않습니다.
각막 micropocket 분석의 많은 장점에도 불구하고, 약간의 제한도있다. 주요 단점은이 기술을 습득하기 위해 비교적 긴 훈련 기간이 필요하다. 20-25 쥐의 실험이 신뢰할 수있는 것으로 간주되기 전에 마우스 눈에서 작업없이 이전 기술 경험을 가진 개인은 연습의 약 4 개월이 필요합니다. 또한, 이와 같이 수행되는 실험 간의 비교 가능성을 제한하는, 상기 분석을 수행하는 여러 사람들 사이에서 다소의 편차가있다서로 다른 사람들이 서로 다른 시간에. 이 모델의 또 다른 한계는 실험 (5-6 일간) 상대적으로 짧은 펠릿에서의 bFGF 또는 VEGF의 방출에 의해 제한된다는 것입니다. 이것은 부분적 절차 이전 시간의 원하는 길이에 대한 쥐를 전처리에 의해 보상 될 수 있지만, 따라서,이 분석은, 생체 내에서 빠른 응답이 치료에 매우 적합하다. 표준 약물 검사 분석은 일반적으로 등급의 일까지 계속 (0 일) 펠릿 주입의 일에 관리를 시작 (5 일 또는 6).
이 기술의 중요성은 가장 신뢰할 수있는 혈관 신생 정량 분석법 중 하나라는 것이다. 마우스의 대안은 그러나이 분석은 질적이며 인해 플러그에 발생하는 광범위한 세포 침투에 특정 성장 인자에 덜 특정, 마트 리겔 플러그 분석이다. 각막 분석의 유연성은 하나의 양을 조정할 수의 신생 혈관 생성하고 특정 자극을 선택합니다. 그것은 다른 알려진 또는 의심되는 혈관 신생 인자와 표준 성장 인자를 대체 할 수있다. 또한, 전신 전달없이 항 - 혈관 신생 활성을 평가하기 위해 동일한 규격 펠릿 내 성장 인자 억제제 및 가능한 조합 될 수있다. 마지막으로, 분석은 하나의 유전 효과를 매핑 및 혈관 신생에 대한 특정 유전자의 영향을 확립하는데 유용 할 수있는 다른 유전 적 배경에 혈관 형성을 자극 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 그래픽 작업을 위해 크리스틴 존슨 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
- Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).
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