Summary
प्रोटोकॉल चूहों में विकसित रूप में कॉर्निया micropocket परख का वर्णन है.
Abstract
माउस कॉर्निया micropocket परख angiogenesis के मूल्यांकन के लिए एक मजबूत और मात्रात्मक इन विवो परख है. स्वाभाविक रूप से avascular कॉर्निया में रक्त वाहिनियों की वृद्धि को गति प्रदान कि विशिष्ट वृद्धि कारक युक्त मानकीकृत धीमी गति से जारी छर्रों का उपयोग करके, angiogenesis मापा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस परख में वाहिकाजनक प्रतिक्रिया प्रयोग किया जाता वृद्धि कारक के प्रकार और मात्रा पर निर्भर करता है, कई दिनों के पाठ्यक्रम पर उत्पन्न होता है. neovascularization की प्रेरण आमतौर पर या तो बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) या संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) से शुरू हो रहा है. Sucralfate और Hydron (पाली हेमा (पाली (2 hydroxyethyl methacrylate))) और छर्रों में मिश्रण कास्टिंग के साथ इन वृद्धि कारकों के संयोजन से, वे शल्य चिकित्सा माउस आंख में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. ये वर्दी छर्रों पोत क्षेत्र q के लिए आवश्यक पर्याप्त वाहिकाजनक प्रतिक्रिया सक्षम करने (क्रमशः bFGF या वीईजीएफ़) पांच या छह दिनों में वृद्धि कारकों धीरे धीरे जारीएक भट्ठा दीपक का उपयोग uantification. इस परख वाहिकाजनक न्यूनाधिक दवाओं या उपचार के साथ ही angiogenesis प्रभावित करने वाले विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच तुलना के मूल्यांकन सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस परख अभ्यास के बाद एक कुशल अन्वेषक आंख प्रति कम से कम 5 मिनट में एक गोली प्रत्यारोपण कर सकते हैं.
Introduction
angiogenesis की प्रक्रिया, नई रक्त वाहिकाओं के गठन के पहले से मौजूद लोगों को फार्म, अत्यधिक जटिल है और पोत अंकुरण और morphogenesis के विभिन्न चरणों को नियंत्रित कि कई अंतर्जात कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है. एंजियोजिनेसिस कारण समर्थक और विरोधी वाहिकाजनक कारकों के बीच संतुलन में बदलाव, सामान्य रूप से एक मौन राज्य में vasculature का कहना है कि एक संतुलन के लिए शुरू हो रहा है. वयस्कों में angiogenesis ऐसी महिला डिम्बग्रंथि चक्र के दौरान के रूप में या इस तरह के घाव भरने और ऊतक उत्थान के रूप में मरम्मत की प्रक्रिया में कुछ शारीरिक स्थितियों में होता है. हालांकि, यह भी कैंसर, autoimmune शर्तों और भड़काऊ रोगों सहित कई विकृतियों की एक बानगी है. इन शारीरिक और रोग की स्थिति में angiogenesis की भागीदारी यह अनुसंधान और उपचार के लिए एक आकर्षक लक्ष्य के लिए एक महत्वपूर्ण विषय बना देता है.
कारण angiogenesis की जटिलता और कई CE के शामिल होनेमॉडल सीमित रहते हैं और अद्वितीय में विवो microenvironment पुनरावृत्ति नहीं कर सकते हैं इन विट्रो endothelial कोशिकाओं, pericytes, घूम कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं, सहित प्रक्रिया में LLS और कारकों. angiogenesis के लिए इन विट्रो assays में मुख्य काफी हद तक endothelial कोशिकाओं पर प्रत्यक्ष प्रभाव देख और नियंत्रित परिस्थितियों में वाहिकाजनक प्रक्रिया में कुछ कदम मापने पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं. ये assays endothelial सेल प्रसार 1, माइग्रेशन 2, नेटवर्क के गठन 3, ट्यूब गठन 4 की मात्रा का ठहराव और spheroids 5 से अंकुरण शामिल हैं. पूर्व vivo मॉडल, इन विट्रो लोगों के विपरीत, अधिक जटिल हैं और कई ऊतक प्रकार की कोशिकाओं को शामिल, एक उदाहरण है महाधमनी रिंग परख 6. विवो में मौजूद है फिर भी, अन्य प्रणालियों की तरह, यह घूम कोशिकाओं के योगदान और endothelial कोशिकाओं के प्राकृतिक स्ट्रोमा कब्जा नहीं कर सकते. प्रयासबहुत सुधार हुआ है, हालांकि microfluidic सिस्टम 7 का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे इन विवो सेटिंग, लेकिन फिर भी इन assays नकल करने के लिए प्रवाह के तहत angiogenesis अध्ययन करने के लिए, अभी भी विवो में मौजूदा सभी डिब्बों के लिए खाते में करने में असमर्थ हैं.
कारण इन विट्रो और पूर्व vivo angiogenesis मॉडल, की सीमाओं के vivo मॉडल angiogenesis के अध्ययन के लिए और अधिक विश्वसनीय विकल्प रहते हैं. इन मॉडलों के उदाहरण माइक्रोस्कोप 8 के तहत बढ़ रही रक्त वाहिकाओं के दृश्य की अनुमति है कि पारदर्शी कक्षों, "विंडोज", का आरोपण शामिल हैं, ऐसे में इस तरह के माउस कान और चिकन chorioallantoic झिल्ली के रूप में सामान्य ऊतकों में Matrigel और पोत के गठन के रूप में इंजेक्शन चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण (सीएएम ). हालांकि, सबसे स्वीकार्य और मात्रात्मक vivo में angiogenesis मॉडलों में से एक स्वाभाविक रूप से avascular कारनामे जो यहाँ वर्णित कॉर्निया micropocket neovascularization परख है,एक "स्क्रीन" के रूप में कॉर्निया कल्पना और नए वाहिकाजनक वृद्धि 9 का आकलन करने के लिए.
चूहों में विकसित रूप में यहाँ हम कॉर्निया micropocket परख का वर्णन. प्रारंभ में मॉडल खरगोश कॉर्निया में अविशिष्ट वाहिकाजनक उत्तेजनाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह खरगोश आंख की पूर्वकाल चैम्बर के जलीय हास्य में ट्यूमर टुकड़े शुरू करने से किया जाता है और ट्यूमर प्रेरित neovascularization 11 मापा गया था.
हालांकि, परख बाद में बेहतर निर्दिष्ट और वाहिकाजनक प्रभाव मानकीकृत करने के लिए विशेष विकास के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए 10 कारकों विकसित किया गया था. आंख में वृद्धि कारक जारी करने के लिए आदेश में, वाहिकाजनक वृद्धि कारकों के ज्ञात मात्रा युक्त धीमी गति से जारी छर्रों के बजाय ऊतकों का इस्तेमाल किया गया. ऐसे bFGF या वीईजीएफ़ के रूप में शुद्ध पुनः संयोजक वाहिकाजनक प्रोटीन की उपलब्धता angiogenesis modulaters 12 के विशिष्ट लक्ष्यों के रूप में उनके उपयोग के सक्षम होना चाहिए. प्रारंभ में, परख थामोटे तौर पर अपने आकार की वजह से, लेकिन बाद में मॉडल चूहों में अनुवाद किया गया था के साथ काम करने के लिए आसान कर रहे हैं जो खरगोश, में इस्तेमाल किया; एक छोटे और कम खर्चीला पशु मॉडल. चूहों को खरगोश से स्थानांतरण जिससे angiogenesis 13 प्रभावित आनुवंशिक घटकों में अनुसंधान का एक नया क्षेत्र बनाने, आनुवंशिक रूप से चालाकी से पशुओं का उपयोग करने में सक्षम होने का एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान की. Angiogenesis का अध्ययन करने में कॉर्निया परख के अधिक स्वीकार्य उपयोग करने के अलावा, अन्य जैविक प्रक्रियाओं को भी संशोधित assays का उपयोग जांच की जा सकती है. उदाहरण के लिए, lymphangiogenesis की पढ़ाई विशिष्ट आणविक मार्कर 14 के माध्यम से लसीका वाहिकाओं के दृश्य अनुमति दी है जो कम खुराक bFGF छर्रों का आरोपण के माध्यम से संभव बनाया गया. इसके अलावा, इस परख angiogenesis 15 पर विकिरण के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराया गया है.
योग में, कॉर्निया micropocket एंजियोजिनेसिस परख एक मात्रात्मक, प्रतिनिधि हैroducible, vivo में angiogenesis के लचीला आकलन. इस परख का एक प्रमुख लाभ वाहिकाओं एक स्वाभाविक रूप से avascular ऊतक पर बढ़ने क्योंकि पृष्ठभूमि जहाजों की माप अनावश्यक है. हम यहाँ के विवरण में इस परख के प्रोटोकॉल का वर्णन है और हो सकता है जो विभिन्न परिदृश्यों पर चर्चा की. परख 3 असतत क्षेत्रों के होते हैं. यहाँ हम परिणामस्वरूप neovascular विकास यों इस्तेमाल वृद्धि कारक समावेशी छर्रों की तैयारी, बाद में शल्य आरोपण और अंत में विधि का वर्णन करेंगे.
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Protocol
जानवरों से जुड़े सभी प्रोटोकॉल के लिए प्रस्तुत किया है और मंजूरी दे दी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा बच्चों के अस्पताल के बोस्टन में और प्रयोगशाला पशु की देखभाल के मूल्यांकन एवं प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन (AAALAC) की सिफारिशों के अनुसार आयोजित कर रहे हैं. प्रक्रिया प्रदर्शन करते हुए बाँझ इंस्ट्रूमेंटेशन और सड़न रोकनेवाला techniqure उपयोग सुनिश्चित करें.
हिमपात के 1. तैयारी
- Sucralfate के 10 मिलीग्राम और बाँझ ऋजु रंग के साथ Hydron की 60 मिलीग्राम वजन. अलग microcentrifuge ट्यूबों में रखें.
- एक बाँझ 10 सेमी डिश में जाली एक 1 सेमी चौकोर टुकड़ा रखें. तो उथले ढक्कन पर टिकी हुई है जाल पलटना. अलग निर्धारित करें.
- कम से कम 10 मिनट के लिए Hydron और भंवर के लिए इथेनॉल के 500 μl जोड़ें.
- संक्षेप में sucralfate और भंवर: वृद्धि कारक (bFGF के लिए 20 ग्राम, वीईजीएफ़ के लिए 50 माइक्रोग्राम मानक) की उचित मात्रा में जोड़ें. एक स्टोर में वृद्धि कारक1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर. जोड़ी तरल मात्रा में पूरी तरह से सिक्त है sucralfate सुनिश्चित करने के लिए 20 μl की एक न्यूनतम होनी चाहिए लेकिन 50 μl अधिक नहीं होनी चाहिए. अधिक से अधिक मात्रा अगले चरण में तरल के वाष्पीकरण कठिन बना देता है.
- मिश्रण पूरी तरह से सूखा है जब तक इस्तेमाल किया तरल की मात्रा के आधार पर सामान्य रूप से 30-50 मिनट, कम पर सेट केन्द्रापसारक बाष्पीकरण में sucralfate मिश्रण रखें.
- एक बाँझ रंग का पतला अंत के साथ अवशिष्ट नमी के लिए मिश्रण की जाँच करें. मिश्रण "कुरकुरे" महसूस करना चाहिए.
- ट्यूब के भीतर sucralfate मिश्रण को तोड़ने के लिए रंग का पतला अंत का प्रयोग करें.
- Sucralfate को Hydron के 10 μl जोड़ें.
- कारण Hydron का चिपचिपा प्रकृति के, एक 200 μl pipet टिप से अंत में कटौती और फिर आकर्षित और फिर ऊपर pipetting और sucralfate को जोड़ने से पहले 10 μl जारी.
- जल्दी तुला विवाद का उपयोगयूला Hydron और sucralfate मिश्रण और ट्यूब से हटाने के लिए.
- तुला रंग की नोक के नीचे पक्ष के साथ मिश्रण को इकट्ठा और ट्यूब की दीवार के साथ रंग बाहर ड्राइंग, जबकि तब ट्यूब बारी बारी से. इस कदम कुशलता से किया जाना चाहिए ताकि मिश्रण तेजी से सूख जाएगा.
- यह जगह में पकड़ संदंश का उपयोग कर तैयार की जाली पर मिश्रण बिखरा हुआ है. मिश्रण एक भी परत हो और जाली के छेद में भरने चाहिए.
- ट्यूब युक्त Hydron में तुला रंग विसर्जित और जाल का यह कोट दोनों पक्षों का उपयोग करें.
- पकवान के किनारे के खिलाफ तरफ झुकाव लेपित मेष रखें और 30-45 मिनट के लिए आरटी पर सुखाने के लिए अनुमति देते हैं.
- -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जाल रखें या अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना. पकवान के अंदर जाल रखें.
- बड़ा पेट्री डिश, ढक्कन बंद के अंदर 35 मिमी पकवान. ध्यान से अलग 35 मिमी पकवान से अधिक की जाली के तंतुओं को खींचने के लिए संदंश की जोड़ी का उपयोग करें. आवारा छर्रों सीएक छोर पर बड़ा पकवान से एकत्र किया.
- दायरे के तहत एकरूपता के लिए छर्रों की जाँच करें. प्रक्रिया इस प्रकार bFGF के लिए गोली प्रति मानक खुराक लगभग 250 छर्रों पैदावार और वीईजीएफ़ क्रमशः 80 एनजी और 200 एनजी है.
- अप करने के लिए 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 35 मिमी पकवान में स्टोर छर्रों.
हिमपात के 2 सर्जिकल आरोपण
- ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत एक शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की स्थापना की.
- Avertin (400-500 मिलीग्राम / किग्रा, intraperitoneal) के साथ माउस anesthetize और इसलिए आंख से दिखाई देता है खुर्दबीन के नीचे माउस की स्थिति. संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर सुनिश्चित करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करना.
- नेत्रगोलक ऊपर proparacaine समाधान की 1 बूंद रखकर माउस आंख anesthetize. 20-30 मिनट रुको और एक धुंध पैड के साथ थपका.
- Dulled # साथ संदंश और आंख के बीच में त्वचा को छोड़ने के लिए कुछ किया जा रहा है 1 जौहरी संदंश माउस आंख Proptose. यह सही ढंग से लागू दबाव न्याय करने के लिए महत्वपूर्ण है.60; बहुत मजबूती से आंख होल्डिंग भी नेत्र शल्य चिकित्सा के दौरान स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देगा एक पकड़ ढीली है, जबकि लाल और चिढ़ बनने के लिए प्रेरित करेगा.
- कॉर्निया में किनारी से लगभग 1 मिमी एक चीरा बनाने के लिए 30 ° microknife का प्रयोग करें. चीरा लंबाई में 1-2 मिमी होना चाहिए. चीरा midstroma में उपकला परत से परे घुसना करने के लिए पर्याप्त गहरी लेकिन आँख टूटना इतना गहरा नहीं होना चाहिए.
- चीरा सीधा करने के लिए एक जेब बनाने के लिए वॉन GRAEF चाकू का प्रयोग करें.
- चीरा साइट पर कॉर्निया की परत के नीचे चाकू स्लाइड और धीरे में चाकू काम करते हैं और इस प्रकार जेब बनाने, अंतरिक्ष विस्तार करने के लिए चीरा साथ यह चाल है. यह आंख की वक्रता के साथ काम करने के लिए सक्षम होने के लिए के रूप में अच्छी तरह से माउस स्थानांतरित करने के लिए मदद करता है. आँख rupturing से बचने के लिए टिप के साथ नीचे धक्का नहीं है सावधान रहें.
- Proparacaine साथ # 5 जौहरी संदंश गीले और पकवान के बाहर एक गोली लेने. आंख पर एक गोली रखें. Proparacaine साथ वॉन GRAEF चाकू गीला और यह रबड़ और लचीला बनाने के लिए गोली पर तरल के कुछ हस्तांतरण. धुंध पैड या कपास झाड़ू से अधिक नमी निकालें.
- कॉर्निया की परत के नीचे के अंदर धक्का वॉन GRAEF चाकू का उपयोग कर जेब में गोली डालें. पूरे गोली के अंदर एक बार, गोली सुरक्षित है कि जाँच करने के लिए साइट पर वॉन GRAEF चाकू के फ्लैट की ओर चला.
- कोट ट्रिपल एंटीबायोटिक मलहम के साथ नजर.
- पर माउस मुड़ें और विपरीत आंख में सर्जरी दोहराएँ.
कॉर्नियल neovascularization की 3 मात्रा.
समय का एक निर्धारित अवधि से अधिक जहाजों को विकसित करने के लिए जानवरों के लिए छोड़ दें. पोत ग्रेडिंग के दिन इस्तेमाल वृद्धि कारक पर निर्भर करता है. ग्रेड bFGF दिन 6 दिन 5 और कमजोर वीईजीएफ़ पर आरोपण के दिन 0 दिन है.
- Avertin साथ माउस (400-500 मिलीग्राम / किग्रा, intraperitoneal) anesthetize.
- Gra के लिए भट्ठा दीपक माइक्रोस्कोप का उपयोगडिंग. एक नेत्र जहाजों अंकुरित है कि आंख की परिधि के आसपास पोत की लंबाई और दूरी यों एक मापने सहायता के रूप में इस्तेमाल किया ऐपिस के भीतर एक reticule, लाइनों है.
- इसलिए आंख सीधे आगे गोली के साथ आंख में देखा जाता है माउस स्थिति, गुंजाइश के सामने माउस पकड़. त्वचा चेहरे पर कड़ा है और आंख से थोड़ा proptosed है तो अंगूठे और तर्जनी के बीच सिर को स्थिर.
- अंगीय पोत साथ सीधे गोली नीचे reticule के वाई अक्ष रखें. छर्रों की ओर उर्ध्व शाखाओं में जहाजों की लंबाई को मापने. मिलीमीटर का दसवां में इस माप रिकार्ड और पोत की लंबाई (वीएल) (चित्रा 1 ए) को नामित.
- इन जहाजों अंकुरित है कि आंख के आसपास दूरी स्पष्ट हो जाता है कि तो माउस या reticule या तो मुड़ें. यह 12 नामित इस संख्या घड़ी घंटे (सीएच) (चित्रा 1 के माध्यम से 1 के अंतराल के साथ एक घड़ी चेहरे के रूप में आंख के बारे में सोच के लिए सबसे आसान हैबी). यह एक पूरी संख्या या 0.25 (जैसे, 2, 2.25, 2.5 या 2.75) की भिन्न हो सकते हैं. नोट: सीएच व्यक्तिपरक है. उदाहरण के लिए, कुछ दूसरों पोत की लंबाई आधा अधिक से अधिक है जहां बिंदु पर मापने बंद कर सकता है, जबकि किनारी से अंकुरित सभी जहाजों को शामिल करने की आंख के आसपास की दूरी को मापने सकता है. महत्वपूर्ण कारक एक ग्रेड चुनता कैसे साथ लगातार हो रहा है.
कॉर्निया neovascularization चित्रा 1 मात्रा. (ए) 80 एनजी bFGF गोली C57BL / 6J माउस पोत की लंबाई मापने के लिए उन्मुख भट्ठा दीपक reticule दिखाने में प्रत्यारोपित. वीएल = 0.9 मिमी. (बी) एक ही आंख दिखा भट्ठा दीपक reticule घड़ी घंटे को मापने के लिए घुमाया. सीएच = 3.25. परिकलित पोत क्षेत्र = 1.84 मिमी 2. इन छवियों को डिजिटल रूप reticule योजनाबद्ध के अलावा के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- एक अंडाकार के क्षेत्र पर आधारित है जो नीचे सूत्र का उपयोग पोत क्षेत्र (वीए), गणना एक्सप्रेस वीए चुकता मिलीमीटर में (ध्यान दें, यह ग्रेडिंग जब मन में इस रखने के लिए. उपयोगी है). निम्नानुसार सूत्र है:
पोत की लंबाई एक्स घड़ी घंटे एक्स 0.2 π = पोत क्षेत्र
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Representative Results
सामान्य कम वाहिकाजनक C57BL / 6J चूहों में bFGF और वीईजीएफ़ छर्रों के लिए विशिष्ट परिणाम चित्रा 2A और बी में दिखाए जाते हैं, क्रमशः. चित्रा 2 ई इन विकास के अलग खुराकों के साथ C57BL / 6J तनाव में पोत क्षेत्र की सामान्य वितरण (वीए) से पता चलता है कारकों. 1.8-2.4 मिमी 2 की एक सीमा में मूल्यों स्वीकार्य हैं, हालांकि 80 एनजी bFGF छर्रों सामान्य रूप से, लगभग 2.0 मिमी 2 के एक वीए में परिणाम. 200 एनजी वीईजीएफ़ छर्रों आम तौर पर 0.6-0.9 मिमी 2 की स्वीकार्य मूल्यों की एक सीमा के साथ लगभग 0.7 मिमी 2 की एक प्रतिक्रिया के कारण. एक विरोधी वाहिकाजनक प्रभाव संदिग्ध है जहां प्रयोगों के लिए, बड़ा पोत क्षेत्रों कमी कल्पना करने के लिए सक्षम होने के लिए वांछित हैं. 3 bFGF संचालित neovascularization पर विरोधी वाहिकाजनक दवा thalidomide के प्रभाव से पता चलता है. उपचार वाहिनियों की वृद्धि का 38% निषेध में हुई. प्रयोगों में जहां एक वृद्धि हो सकती हैयह मानक गोली एक के पास अधिकतम प्रतिक्रिया का कारण बनता है के रूप में कम खुराक का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है उम्मीद की जा. 10-40 एनजी bFGF से मिलकर हिमपात अधिक उपयुक्त (चित्रा -2) होगा.
एक विशेष वृद्धि कारक के लिए एक उच्च वाहिकाजनक प्रतिक्रिया के लिए जाना जाता उपभेदों एक VA दो बार है कि एक ठेठ कम वाहिकाजनक तनाव की तुलना में अधिक हो सकता है. चित्रा 2 डी एक 20 एनजी FGF गोली को एक 129S1 / SvImJ माउस की प्रतिक्रिया से पता चलता है. तुलना के लिए, एक ही खुराक गोली चित्रा -2 में एक C57BL / 6J में दिखाया गया है. BFGF- और वीईजीएफ़ प्रेरित neovascularization दोनों को विभिन्न उपभेदों के वाहिकाजनक क्षमता का ब्यौरा एक व्यापक तालिका में पहले हमारी प्रयोगशाला में 13 से प्रकाशित किया गया है.
कुछ उपभेदों या pigmentations एक गोली के जवाब में आईरिस वाहिकाओं के विकास या रिसाव प्रदर्शन कर सकते हैं. यह एक में होते हैं या एक व्यक्ति माउस की दोनों आंखों और कर सकते हैं या ईएनटी में लगातार नहीं हो सकता है कर सकते हैंपरख प्रदर्शन किया है जिसमें गुस्सा समूह. इस घटना पूर्वकाल कक्ष (hyphema) को भरने के लिए रक्त के कारण आईरिस वाहिकाओं के फटने में परिणाम कर सकते हैं. Hyphemas. मुश्किल या असंभव कॉर्निया neovascularization ग्रेडिंग कर 4 इस घटना के एक हल्के (4 क) और गंभीर (4 बी) फार्म दिखाता समझ सकते हैं.
चित्रा वृद्धि कारक प्रेरित कॉर्निया neovascularization के 2 उदाहरण. (ए) 80 एनजी bFGF गोली 2.0 मिमी 2 के बराबर एक पोत क्षेत्र में है, जिसके परिणामस्वरूप एक कम वाहिकाजनक C57BL / 6J माउस में प्रत्यारोपित. इस खुराक जहाजों गोली तक पहुँचने और यह रूप में विकसित करने के लिए प्रेरित करने के लिए यह बहुत आम है. (बी) एक में प्रत्यारोपित 20 एनजी bFGF गोलीC57BL / 6J माउस, 1.04 मिमी 2 के बराबर एक पोत क्षेत्र में जिसके परिणामस्वरूप. (सी) 200 एनजी वीईजीएफ़ गोली 0.71 मिमी 2 के बराबर एक पोत क्षेत्र में है, जिसके परिणामस्वरूप एक C57BL / 6J माउस में प्रत्यारोपित. उच्च वाहिकाजनक 129S1 / SvImJ तनाव में (डी) 20 एनजी bFGF गोली. (सी) की तुलना में, यह भी एक 20 एनजी FGF गोली, इस तनाव है एक वाहिकाजनक संभावित अधिक C57BL / 6J चूहों की कि दो बार से अधिक है. (ई) कॉर्नियल neovascular क्षेत्र वीईजीएफ़ या bFGF या तो की खुराक में वृद्धि से प्रेरित C57BL / 6J चूहों में (एसडी ± मतलब, एन = 10). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
BFGF प्रेरित VESS की चित्रा 3 निषेधविरोधी वाहिकाजनक एजेंट द्वारा अल विकास. (ए) नियंत्रण वाहन इलाज C57BL / 6J माउस. 2.0 मिमी 2 के बराबर एक समूह पोत क्षेत्र में जिसके परिणामस्वरूप 80 एनजी bFGF गोली का आरोपण. (बी) Thalidomide (5 दिनों के लिए मौखिक 200 मिलीग्राम / किग्रा), माउस का इलाज किया. समूह पोत क्षेत्र 1.25 मिमी 2 के बराबर होती है और पोत विकास में 38% की कमी को दर्शाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4 ग्रोथ murine आईरिस में कारक प्रेरित hyphemas. (ए) एक C57BL / 6J-TyrC-2J / जम्मू में हल्के hyphema. इस तनाव उनके pigmented समकक्षों के रूप में एक ही कॉर्निया neovascularization दर्शाती है लेकिन अधिक समर्थक हैपूर्वोत्तर खून बह रहा है आईरिस के लिए. एक 129P3 / जम्मू माउस (ख) बड़े पैमाने hyphema. पूरे आँख एक लाल रंग के साथ ही करीब आईरिस के नीचे करने के लिए रक्त के अधिक स्पष्ट पूल हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
एक सफल कॉर्निया परख प्रदर्शन में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. पहले प्रत्यारोपित किया जा रहा है और वाहिकाओं उत्तेजक सक्षम वर्दी छर्रों कर रही है. गोली तैयार करने का सबसे महत्वपूर्ण भागों) वाहक मुक्त वृद्धि कारक का उपयोग कर रहे हैं 1; 2) छर्रों डाल रहे हैं जहां जाल को Eppendorf ट्यूब से तेजी से लेकिन ध्यान से अंतिम मिश्रण चलती) sucralfate और Hydron और 3 के साथ विकास का पहलू का एक अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करना. यह "डमी" छर्रों तकनीक का अभ्यास करने के लिए वृद्धि कारक के बिना किया जा सिफारिश की है. हिमपात सफेद और चूने दिखाई देते हैं और आकार में मोटे तौर पर वर्ग होना चाहिए. इन क्षेत्रों की संभावना केवल Hydron होते ही स्पष्ट क्षेत्रों में शामिल है कि किसी भी छर्रों बाहर रखा जाना चाहिए. यह भी छर्रों mimics बाध्यकारी हेपरिन जो sucralfate का समावेश द्वारा स्थिर रहे हैं और इथेनॉल कि bFGF और वीईजीएफ़ साथ बनते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. Sucralfate भी एक धीमी गति से जारी PL प्रदान करने के लिए कार्य करता हैवृद्धि कारकों के लिए atform. अन्य stimulators या अवरोधकों छर्रों को जोड़ रहे हैं, तो इन कारकों इथेनॉल में स्थिरता का निर्धारण करने के लिए पहले परीक्षण किया जाना चाहिए. यह "डमी" छर्रों शुरू में तकनीक का अभ्यास करने के लिए वृद्धि कारक के बिना किया जा सिफारिश की है. "डमी" या नकली छर्रों वृद्धि कारक या यौगिक की मात्रा के लिए एवजी पीबीएस के साथ ही sucralfate और Hydron परीक्षण किया जा रहा है होते हैं. इन छर्रों पोत विकास या अंगीय सूजन को प्रोत्साहित नहीं करते. शाम छर्रों एक एजेंट के समर्थक वाहिकाजनक होने का संदेह है और गोली के लिए विकास का पहलू के अलावा बिना परीक्षण किया जाता है, जहां प्रयोगों में एक उचित नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. यौगिकों और वृद्धि कारक वृद्धि कारक के मामले छर्रों अकेले उचित नियंत्रण होगा जिसमें एक बातचीत की जांच की जा रही है जहां उदाहरणों, के लिए छर्रों में जोड़ा जा सकता है.
सर्जिकल आरोपण परख की सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा है.0; यह चीरा के लिए उपयुक्त गहराई गेज करने के लिए शुरू में बहुत मुश्किल है. भी गहरी एक चीरा टूटना करने के लिए दुनिया का कारण बनता है और आंख से निष्क्रिय हो जाता है. यह एक नाटकीय प्रभाव है और इसलिए एक जल्दी आंख "पॉप" के लिए नहीं सीखता है. यह लगातार जेब गठन की अनुमति के लिए गहरी पर्याप्त एक चीरा बनाने के लिए काफी लंबे समय तक ले जाता है. चीरा भी उथले है जब, कॉर्निया के ऊपरवाला परत आसानी से क्षतिग्रस्त है या इसे जेब बनाने के लिए डाला जाता है के रूप में वॉन GRAEF चाकू के साथ बंद फट. नए पोत विकास बढ़ाता का अंतिम चरण ग्रेडिंग के तरीके में स्थिरता की आवश्यकता है. आंख की परिधि के चारों ओर विकास का चित्रण घड़ी घंटे मूल्य अधिक व्यक्तिपरक है जबकि पोत की लंबाई एक सीधा माप है. प्रयोग विधि माउस से माउस को और प्रयोगों के बीच ही होना चाहिए.
परख का एक अन्य महत्वपूर्ण घटक संज्ञाहरण का विकल्प हो सकता है, जो हैआसानी और शल्य प्रक्रिया की सफलता पर असर. यह नाक शंकु के माध्यम से दिया वाष्पीकृत संज्ञाहरण के विपरीत माउस का आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है के रूप में इंजेक्शन Avertin कम से कम जटिल है. यह कारण कृन्तकों 16,17 में कॉर्निया घावों के साथ अपने सहयोग के रूप में अच्छी तरह से ketamine और xylazine के संयोजन से बचने की सलाह दी जाती है.
यह प्रयोग के दौरान चूहों के वजन में कोई परिवर्तन नोट करना महत्वपूर्ण है. वजन घटाने गरीब आवास की स्थिति या बीमारी का संकेत हो सकता है और इन नकारात्मक आंख में जहाजों विकसित करने के लिए एक माउस की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं. बाट खो वजन का प्रतिशत, यदि कोई हो निर्धारित करने के लिए गोली आरोपण और पोत ग्रेडिंग के दिन पर लिया जाना चाहिए. 5% या उससे कम की हानि स्वीकार्य है और विशेष रूप से लगातार खुराक के साथ इलाज के प्रयोगों के दौरान, चूहों से निपटने के तनाव से परिणाम कर सकते हैं. ग्रेटर 5% से वजन घटाने से संबंधित है और nonspecifically होगापोत विकास को दबाने. इस प्रकार इस तरह के प्रयोगों से परिणाम अमान्य माना जाना चाहिए.
प्रक्रिया तकनीक और अध्ययन चर की प्रभावकारिता से निहित प्रयोगात्मक प्रसरण के लिए खाते में करने के लिए, चूहों की एक न्यूनतम संख्या मान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में हम 10 आंखों की एक एन उपज समूह प्रति 5 चूहों की तुलना में कम नहीं की सलाह.
कॉर्निया micropocket परख के कई फायदे के बावजूद, कुछ सीमाएं भी हैं. मुख्य दोष तकनीक मास्टर करने के क्रम में एक अपेक्षाकृत लंबी अवधि के प्रशिक्षण के लिए की जरूरत है. 20-25 चूहों के प्रयोगों विश्वसनीय माना जा सकता से पहले माउस आंख में काम कर रहा कोई पूर्व तकनीकी अनुभव के साथ एक व्यक्ति अभ्यास के लगभग चार महीने की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, इस प्रकार का प्रदर्शन कर रहे हैं कि प्रयोगों के बीच तुलना करने की संभावना सीमित परख करने वाले विभिन्न लोगों के बीच कुछ बदलाव कर रहे हैंअलग अलग लोगों द्वारा अलग अलग समय में. इस मॉडल की एक और सीमा प्रयोगों (5-6 दिन) अपेक्षाकृत कम कर रहे हैं और गोली से bFGF या वीईजीएफ़ की रिहाई से प्रतिबंधित कर रहे हैं. यह आंशिक रूप से प्रक्रिया के लिए पहले समय के वांछित लंबाई के लिए चूहों पूर्व इलाज के लिए मुआवजा दिया जा सकता है इसलिए, इस परख, विवो में एक तेजी से प्रतिक्रिया है कि उपचार के लिए अत्यधिक उपयुक्त है. स्टैंडर्ड औषधि परीक्षण assays आमतौर पर ग्रेडिंग के दिन तक जारी रखने दिवस (0) गोली आरोपण के दिन प्रशासन शुरू (दिन 5 या 6).
इस तकनीक का महत्व यह सबसे विश्वसनीय मात्रात्मक angiogenesis assays के एक है. चूहों में एक वैकल्पिक हालांकि इस परख अधिक गुणात्मक और कारण प्लग में होता है कि एक व्यापक सेल घुसपैठ करने के लिए एक निश्चित वृद्धि कारक को कम विशिष्ट है, Matrigel प्लग परख है. कॉर्निया परख का लचीलापन एक राशि से तैयार करने की अनुमति देता हैके angiogenesis उत्पन्न और एक विशिष्ट उत्तेजक चुनने के लिए. यह अन्य ज्ञात या संदिग्ध वाहिकाजनक कारकों के साथ मानक वृद्धि कारकों स्थानापन्न करने के लिए संभव है. इसके अतिरिक्त, यह प्रणालीगत प्रसव बिना विरोधी वाहिकाजनक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए एक ही गोली के भीतर मानक वृद्धि कारकों और संभव अवरोधकों गठबंधन करने के लिए संभव है. अंत में, इस परख एक आनुवंशिक प्रभाव मानचित्रण में और angiogenesis पर एक विशेष जीन के प्रभाव स्थापित करने में उपयोगी हो सकता है, जो विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, पर angiogenesis को प्रोत्साहित करने के लिए अनुमति देता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम ग्राफिक काम के लिए क्रिस्टिन जॉनसन धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03--300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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