To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.
Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.
Het histologisch onderzoek van biologisch weefsel is een fundamentele benadering in het begrijpen van de aard van moleculen / cellen in hun natuurlijke context. Idealiter hoge-resolutie beeldvorming van het gehele orgaan het meest informatief en gewenst. Omdat licht heeft een beperkte indringdiepte, door verstrooiing 1, vaste organen worden doorgesneden om hoge-resolutie microscopische beeldvorming uitvoeren. Vandaar dat de meeste van de histologie studies uitgevoerd op enkele weefselsecties die slechts een klein deel van het orgel. In sommige studies, bijvoorbeeld die welke gericht zijn op te sporen uit neuronale verbindingen in de hersenen of het ruggenmerg, alle coupes van de doelorganen worden verzameld en afgebeeld voor een 3D-reconstructie. Echter, weefsel snijden en de daaropvolgende beeldvorming van individuele secties heeft verschillende beperkingen. Hiertoe behoren tijdrovend en leidt tot een onvolledige 3D reconstructie van het weefsel door mechanische vervormingen en moeilijkeies in de uitlijning van de resulterende beelden.
Onlangs heeft clearing en imaging intacte transparante organen ontwikkeld als een afdoende oplossing voor deze tekortkoming 2,3. Na clearing, wordt het gehele orgaan verleende transparant waardoor de beeldvorming licht te reizen end-to-end (figuur 1) naar een hoge-resolutie afbeeldingen van de unsectioned orgel te produceren met behulp van een laser scanning microscoop, zoals een multi-foton of licht-sheet microscoop ( Figuur 2). Verschillende onderzoeksgroepen hebben nieuw weefsel clearing protocollen ontwikkeld om te kunnen op de foto om hun weefsel van belang voor verschillende doeleinden. Deze omvatten organisch oplosmiddel 2-5, water 6,7 en elektroforese gebaseerde 8 clearing protocollen. Onder hen, 3-dimensionale beeldvorming oplosmiddel verwijderd organen of 3DISCO een protocol goed toepasbaar op een verscheidenheid van biologische monsters waaronder centrale zenuwstelsel (CZS) organen, immuunorganen en vaste tumoren. In Addition, kan het worden gecombineerd met verschillende microscopische technieken zoals licht vel fluorescentie microscopie (LSFM), multi foton en confocale laser scanning microscopie. 3DISCO is gebaseerd op het wissen van gemakkelijk beschikbare en goedkope reagentia zoals tetrahydrofuran (THF) en dibenzylether (DBE) 4. Het gehele protocol kan zo kort 3-4 uur duren. Zo 3DISCO is een robuuste en snelle techniek in vergelijking met traditionele histologische methoden die weken kan duren tot maanden in beslag 9.
Tissue wismethodes doel om verstrooiing van imaging licht te verminderen door het afstemmen van de brekingsindex van de verschillende weefsellagen in de ontruimde organen. Hierdoor kan het beeldvormende licht diep in weefsels en het stimuleren van de gemerkte cellen / moleculen. Dit oud concept weefsel clearing 17 heeft opgedaan toenemende aandacht na de eerste geavanceerde toepassing van de techniek op intacte muishersenen door Dodt en collega 2. Sindsdien is er een snel groeiende lijst van nieuwe clearing methoden, met inbegrip 3DISCO, SCA / e, ClearT2, helderheid en SeeDB 3,4,7,18-20. In wezen, zij allen hebben tot doel de organen transparant voor deep tissue imaging maken door het behoud van de fluorescent label. Onder hen, 3DISCO onderscheidt zich als een van de meest eenvoudige en reproduceerbare methoden. Het relatief snel in vergelijking met andere hierboven genoemde wismethodes (1-5 dagen versus 2-3 weken voor volwassen hersenen, respectievelijk) 21. Het is al succesvolledig toegepast op verschillende organen zoals de hersenen, ruggenmerg, lymfeknopen, milt, longen, solide tumoren, pancreas en borstklieren 3,4,9. Daarnaast zijn diverse publicaties door onafhankelijke onderzoeksgroepen reeds deze methode gebruikt om het verkrijgen beeldvorming resulteert 22,23. Toch kan verschillende weefsel clearing procedures voordelig zijn voor verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, terwijl Sca / e en SeeDB gelden beste embryonale weefsels 6,7, ze waterbasis wismethodes, die gemakkelijker te hanteren tijdens de beeldvorming zijn. In tegenstelling, DUIDELIJKHEID is een ingewikkelde en kostbare clearing methode. Maar het kan voordelig zijn in de context van antilichaam labeling, vooral in grote weefsels zoals hersenen 8.
De meest kritische stap om de beste beeldresultaten van 3DISCO verkrijgen is weefsel etikettering, die wordt bereikt voordat het weefsel clearing. Het is essentieel om te beginnen met de sterkste fluorescentiesignaal mogelijk. Dit kan be bereikt op verschillende manieren, waaronder transgene expressie van fluorescerende eiwitten, opsporing door synthetische kleurstoffen, virale transfectie of antilichaam labeling. Het moet in gedachten worden gehouden dat elke clearing procedure het fluorescerende signaal van de weefsels zal verminderen. Dus, als het fluorescerende signaal niet sterk genoeg is in het begin – dat wil zeggen het is niet gemakkelijk opspoorbaar voor de clearing-beeldvorming van de ontruimde weefsels levert slechte resultaten.
Er zijn enkele beperkingen van opruimmethoden die wachten op verbeteringen. Een belangrijke beperking is dat aangezien opruimen reagentia veranderen de structuur van de organen verwijderd, kunnen ze niet worden gebruikt op levend weefsel. Daarom moeten experimenten zoals met fotoactiveerbare mEos2 24 worden uitgevoerd voordat de vaststelling en clearing. Na clearing, super-resolutie beeldvorming van het fluorescente signaal van lichte en fotostabiel eiwitten mogelijk wordt. Bovendien, omdat de clearing protocol vermindert deintensiteit van de fluorescerende eiwitten, kan het gewiste organen niet worden opgeslagen voor langere perioden. Het is belangrijk op te merken dat sommige organen moeilijker te wissen. Vooral als het ontlede organen behouden grote hoeveelheden bloedcellen (bijvoorbeeld milt, lever), die relatief moeilijk te beeld te wissen en. Het is ook relatief moeilijker om een volledig verdwijnen van grote weefsels, zoals volwassen inproefdierhersenen bereiken. Dergelijke weefsels moet langere incubatietijden, waardoor, anderzijds, verminderen het fluorescentiesignaal. Bovendien ontwikkelen van microscopie methoden die kunnen het grote transparante organen tegelijk ook bij een hoge-resolutie een wacht moeten worden aangepakt. Een andere belangrijke beperking van de techniek weefsel labeling. Terwijl een sterk fluorescerend signaal via genetische of virus expressie is ideaal, kan niet elke cel of molecuul genetisch of viraal worden geëtiketteerd. Anderzijds, antilichaamidentificatie dikke weefsels geen eenvoudige procedure zelfs niet possible meestal. Het kan bijzondere permeabilisatie protocollen en lange incubatietijden nodig (enkele dagen tot enkele weken) 3. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat de weefsels krimpen ~ 20% in elke dimensie (gemeten voor ruggenmergweefsel) na het wissen voornamelijk als gevolg van uitdroging en delipidering. Deze krimp optreedt ratiometrically en moeten worden gecorrigeerd in kwantificering stappen. Zoals in de gepresenteerde resultaten, fluorescerend gemerkte structuren intact blijven, hetgeen de vermelding van eiwitintegriteit in de weefsels verwijderd. Door de hydrofobe aard van het uiteindelijke kwam weefsel kan niet verder gekleurd met antilichamen of ingesloten in water bevattende oplossingen bijvoorbeeld Focusclear-die wordt gebruikt ZUIVERHEID of 80% glycerol. Tenslotte is het een uitdaging om overweldigende groottes van beeldgegevens te analyseren. Wanneer bijvoorbeeld een gehele murine brein gescand op cellulair resolutie zou het zeer moeilijk op te sporen en te kwantificeren gewenste Structures (bijv. neuronale of glia netwerken) en vergelijk dan verschillende monsters op een geautomatiseerde manier. Samengevat, terwijl onderzoekers willen te weten komen nieuwe clearing methoden, de verschillende uitdagingen hierboven (moeilijkheid van clearing diverse weefsels, imaging met een hoge resolutie van grotere gebieden, en ingewikkelde data-analyse) moet worden verbeterd in parallel.
Concluderend recent ontwikkelde weefsel clearing technieken waaronder 3DISCO, elegant zien dat hoge-resolutie 3D beeldvorming van organen intact is nu mogelijk. Met behulp van deze werkwijzen kunnen wetenschappers anatomische informatie van cellen en moleculen bekomen in de intacte orgaan. Deze baanbrekende 3D-imaging studies op transparante organen inspireren een groeiend aantal onderzoekers om complexe anatomische en moleculaire organisatie van weefsels / organen in heide en ziekte ontcijferen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken C. Hojer voor kritische lezing van het manuscript, B. Bingöl (Genentech) voor deelname aan script vertellingen, N. Bien-Ly voor het delen van de ervaring van verbeterde vaatstelsel beeldvorming met staartaderinjectie van Lectin kleurstof, en M Solloway (Genentech ) voor de muizen die in pancreas beeldvorming. GFP-M lijn werd gemaakt door J. Sanes (Washington University in St. Louis) en CX3CR1-GFP muizen door R. Littman (NYU). Het werk wordt ondersteund door Genentech, Inc
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | can be obtained from Jackson | ||
CX3CR1 GFP mouse | can be obtained from Littman lab at NYU | ||
TgN(hGFAP-ECFP) mouse | can be obtained from Jackson | ||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
NaH2PO4 | (Mallinckrodt, 7892-04) | ||
2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | used to prepare Avertin solution |
Saline | Braun | ||
Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | used in perfusion |
Glass vials | VWR | 548-0554 | |
Forceps | FST | 11251-10 | |
Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
100mL Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
Cover slip | Corning | 2940-245 | |
Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
Amira with RT resolve microscopy module |
Visage Imaging | image analysis software | |
Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
ImageJ | NIH | freeware |