इमेजिंग 3DISCO द्वारा एक सेलुलर स्तर पर बरकरार बायोलॉजिकल सिस्टम मंजूरी
Summary
To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.
Abstract
Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.
Introduction
जैविक ऊतकों की ऊतकीय परीक्षा उनके प्राकृतिक संदर्भ में अणुओं / कोशिकाओं की प्रकृति को समझने में एक मौलिक दृष्टिकोण है. आदर्श रूप में, पूरे अंग के उच्च संकल्प इमेजिंग सबसे जानकारीपूर्ण और वांछित है. प्रकाश 1 बिखरने की वजह से एक सीमित प्रवेश गहराई, क्योंकि, तय अंगों उच्च संकल्प सूक्ष्म इमेजिंग प्रदर्शन करने के क्रम में sectioned किया जाना है. इसलिए, ऊतक विज्ञान के अध्ययन के अधिकांश अंग के केवल एक छोटे से हिस्से का प्रतिनिधित्व कुछ ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन कर रहे हैं. कुछ अध्ययनों में, उदाहरण के लिए, मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में neuronal कनेक्शन को ट्रेस करने के लिए लक्ष्य उन, लक्ष्य अंगों से सभी ऊतक वर्गों एकत्र कर रहे हैं और एक 3 डी पुनर्निर्माण के लिए imaged. हालांकि, ऊतक सेक्शनिंग और अलग अलग वर्गों के बाद इमेजिंग विभिन्न सीमाएं हैं. ये होने के कारण यांत्रिक विकृतियों को समय लगता है और ऊतकों की एक अधूरी 3D पुनर्निर्माण के लिए अग्रणी और मुश्किल में शामिलजिसके परिणामस्वरूप छवियों के संरेखण में एँ.
हाल ही में, समाशोधन और इमेजिंग बरकरार पारदर्शी अंगों इस कमी 2,3 करने के लिए एक महत्वपूर्ण समाधान के रूप में विकसित किया गया है. समाशोधन करने पर, संपूर्ण अंग प्रदान की गई है पारदर्शी इमेजिंग प्रकाश यात्रा करने की अनुमति अंत करने के लिए अंत इस तरह के एक बहु फोटान या प्रकाश चादर खुर्दबीन के रूप में एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग unsectioned अंग के उच्च संकल्प छवियों का उत्पादन करने के लिए (चित्रा 1) ( चित्रा 2). विभिन्न अनुसंधान समूहों विभिन्न प्रयोजनों के लिए उनके हित के ऊतक छवि के लिए सक्षम होने के लिए नए ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल विकसित किया है. ये कार्बनिक विलायक 2-5, 8 समाशोधन प्रोटोकॉल आधारित पानी 6,7 और वैद्युतकणसंचलन शामिल हैं. उनमें से, विलायक के 3 आयामी इमेजिंग अंगों को मंजूरी दे दी या 3DISCO केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अंगों, प्रतिरक्षा अंगों और ठोस ट्यूमर सहित जैविक नमूने की एक किस्म पर एक तत्काल लागू प्रोटोकॉल है. Addit मेंआयन, यह इस तरह के प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM), बहु फोटॉन और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग के रूप में विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है. 3DISCO ऐसे 4 tetrahydrofuran (THF) और dibenzyl आकाश (DBE) के रूप में आसानी से उपलब्ध है और सस्ती अभिकर्मकों के साथ समाशोधन पर आधारित है. पूरे प्रोटोकॉल 3-4 घंटा के रूप में के रूप में कम ले जा सकते हैं. इस प्रकार, 3DISCO 9 को पूरा करने के लिए महीने के लिए सप्ताह का समय लग सकता है कि परंपरागत ऊतकीय तरीकों की तुलना में एक मजबूत और तेजी से तकनीक है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक समाशोधन तरीकों को मंजूरी दे दी अंगों में अलग ऊतक परतों के अपवर्तक सूचकांक मिलान करके इमेजिंग प्रकाश के प्रकीर्णन को कम करना है. नतीजतन, इमेजिंग प्रकाश गहरी ऊतकों में घुसना और लेबल की कोशिकाओं / अणुओं को प्रोत्साहित कर सकते हैं. 17 समाशोधन ऊतक की इस पुरानी अवधारणा Dodt और उनके सहयोगियों द्वारा 2 बरकरार माउस दिमाग पर तकनीक का पहली परिष्कृत आवेदन के बाद से बढ़ ध्यान प्राप्त किया है. तब से, 3DISCO, एससीए / ई, ClearT2, स्पष्टता और SeeDB 3,4,7,18-20 सहित नई समाशोधन तरीकों की एक तेजी से बढ़ती हुई सूची में नहीं है. संक्षेप में, वे सब फ्लोरोसेंट लेबल के संरक्षण से गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए पारदर्शी अंगों प्रस्तुत करना करना है. उनमें से, 3DISCO सबसे सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों में से एक के रूप में बाहर खड़ा है. यह अपेक्षाकृत तेजी से अन्य समाशोधन उपर्युक्त विधियों (1-5 दिनों बनाम वयस्क दिमाग के लिए 2-3 सप्ताह, क्रमशः) 21 की तुलना में है. यह पहले से ही सफलता की गई हैपूरी तरह से इस तरह के मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी, लिम्फ नोड्स, तिल्ली, फेफड़े, ठोस ट्यूमर, अग्न्याशय, और स्तन ग्रंथियों 3,4,9 के रूप में विभिन्न अंगों के लिए आवेदन किया. इसके अलावा, स्वतंत्र अनुसंधान समूहों द्वारा कई प्रकाशनों पहले से ही इमेजिंग 22,23 परिणाम प्राप्त करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया. फिर भी, अलग ऊतक समाशोधन प्रक्रियाओं अलग स्थितियों के लिए फायदेमंद हो सकता है. एससीए / ई और SeeDB भ्रूण ऊतकों 6,7 पर सबसे लागू कर रहे हैं, जबकि उदाहरण के लिए, वे इमेजिंग के दौरान संभालना आसान हो सकता है, जो पानी आधारित समाशोधन तरीके हैं. इसके विपरीत, स्पष्टता एक जटिल और महंगा समाशोधन विधि है. लेकिन यह विशेष रूप से इस तरह के मस्तिष्क के रूप में 8 बड़े ऊतकों में, एंटीबॉडी लेबलिंग के संदर्भ में फायदेमंद हो सकता है.
3DISCO से सबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम ऊतक समाशोधन से पहले पूरा किया है जो ऊतक लेबलिंग, है. यह संभव मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत के साथ शुरू करने के लिए आवश्यक है. यह ख कर सकते हैंई सिंथेटिक रंगों, वायरल अभिकर्मक या एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा अनुरेखण, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति सहित विभिन्न तरीकों से हासिल की. यह किसी भी समाशोधन प्रक्रिया के ऊतकों के फ्लोरोसेंट संकेत कम हो जाएगा कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. फ्लोरोसेंट संकेत शुरुआत में काफी मजबूत नहीं है इसलिए, अगर – इसे मंजूरी दे दी ऊतकों के समाशोधन इमेजिंग से पहले आसानी से detectable नहीं है यानी गरीब परिणाम होगा.
सुधार के लिए इंतजार कर रहे हैं तरीकों कि समाशोधन की कुछ सीमाएं हैं. एक महत्वपूर्ण सीमा समाशोधन अभिकर्मकों को मंजूरी दे दी अंगों की संरचना में परिवर्तन के बाद से, वे रहते ऊतक पर इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है. इसलिए, इस तरह के photoactivatable mEos2 24 के साथ ही प्रयोगों फिक्सिंग और समाशोधन से पहले किया जाना चाहिए. समाशोधन पर, उज्ज्वल और photostable प्रोटीन से फ्लोरोसेंट संकेत के सुपर संकल्प इमेजिंग संभव हो जाता है. इसके अलावा, क्योंकि समाशोधन प्रोटोकॉल घटता हैफ्लोरोसेंट प्रोटीन की तीव्रता को मंजूरी दे दी अंगों लंबी अवधि के लिए जमा नहीं किया जा सकता है. यह कुछ अंगों को मंजूरी दे दी जानी करने के लिए कठिन हैं कि नोट करना महत्वपूर्ण है. विच्छेदित अंगों रक्त कोशिकाओं (जैसे, तिल्ली, जिगर) की उच्च मात्रा बरकरार रहती है, तो विशेष रूप से, वे स्पष्ट और छवि को अपेक्षाकृत कठिन हैं. यह ऐसे वयस्क कृंतक मस्तिष्क के रूप में बड़े ऊतकों, के लिए एक पूर्ण समाशोधन प्राप्त करने के लिए भी अपेक्षाकृत कठिन है. इस तरह के ऊतकों, दूसरी ओर, फ्लोरोसेंट संकेत को कम कर सकता है, जो लंबे समय तक ऊष्मायन बार पड़ सकता है. इसके अलावा, माइक्रोस्कोपी तरीकों का विकास छवि बड़े पारदर्शी अंगों पर एक बार एक उच्च संकल्प पर संबोधित किया जाना एक का इंतजार कर रहा है जरूरत है कि कर सकते हैं. तकनीक का एक अन्य महत्वपूर्ण सीमा ऊतक लेबलिंग है. आनुवंशिक या वायरस अभिव्यक्ति के माध्यम से एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत आदर्श है, नहीं हर कोशिका या अणु आनुवंशिक रूप से या virally लेबल किया जा सकता. दूसरी ओर, मोटी ऊतकों की एंटीबॉडी लेबलिंग एक सरल प्रक्रिया या भी नहीं पीओ नहीं हैज्यादातर मामलों में ssible. यह 3 (एक कुछ हफ्तों के लिए कई दिनों) विशेष permeabilization प्रोटोकॉल और लंबी ऊष्मायन बार पड़ सकता है. यह ऊतकों के कारण निर्जलीकरण और delipidation के लिए मुख्य रूप से साफ़ करने के बाद (रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए मापा) प्रत्येक आयाम में ~ 20% हटना है कि मन में रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इस संकोचन ratiometrically होता है और मात्रा का ठहराव चरणों में सही किया जाना चाहिए. प्रस्तुत परिणामों में मनाया के रूप में, fluorescently लेबल संरचनाओं को मंजूरी दे दी ऊतकों में प्रोटीन अखंडता का संकेत है, जो बरकरार रहेगा. जैसे, Focusclear जो स्पष्टता या 80% ग्लिसरॉल में प्रयोग किया जाता है क्योंकि अंतिम मंजूरी दे दी ऊतक के हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, यह आगे एंटीबॉडी के साथ दाग नहीं किया जा सकता या पानी युक्त समाधान में एम्बेडेड. अंत में, यह इमेजिंग डेटा की भारी आकार का विश्लेषण करने के लिए एक चुनौती है. एक पूरी murine मस्तिष्क एक सेलुलर संकल्प पर स्कैन किया जाता है जब उदाहरण के लिए, यह वांछित Str का पता लगाने और यों तो बहुत मुश्किल होगाuctures (जैसे, neuronal या glia नेटवर्क) और एक स्वचालित तरीके से विभिन्न नमूनों से अधिक की तुलना करें. शोधकर्ताओं ने नए समाशोधन तरीकों बाहर खोजने के उद्देश्य जबकि सारांश में,, (विविध ऊतकों समाशोधन की कठिनाई, बड़े क्षेत्रों के उच्च संकल्प इमेजिंग, और जटिल डेटा विश्लेषण) ऊपर विभिन्न चुनौतियों समानांतर में सुधार किया जाना चाहिए.
अंत में, 3DISCO सहित हाल ही में विकसित ऊतक समाशोधन तकनीक, सुंदर ढंग से बरकरार अंगों के उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग अब संभव है कि प्रदर्शित करता है. इन विधियों का प्रयोग, वैज्ञानिकों बरकरार अंग में कोशिकाओं और अणुओं की संरचनात्मक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं. पारदर्शी अंगों पर इन अग्रणी 3 डी इमेजिंग अध्ययन जटिल शारीरिक और स्वास्थ्य और रोग में ऊतकों / अंगों की आणविक संगठनों समझने के लिए शोधकर्ताओं की बढ़ती संख्या को प्रेरित.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Lectin डाई की पूंछ नस में इंजेक्शन के साथ बेहतर vasculature इमेजिंग के अनुभव साझा करने के लिए स्क्रिप्ट कथन, एन बिएन-ly में भाग लेने के लिए, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए बी bingol (Genentech) सी. Hojer धन्यवाद, और एम Solloway (Genentech ) अग्न्याशय इमेजिंग में इस्तेमाल चूहों के लिए. GFP-M रेखा आर Littman (NYU) द्वारा जे Sanes (सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय) और CX3CR1-GFP चूहों द्वारा बनाया गया था. काम Genentech, इंक द्वारा समर्थित है
Materials
| Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| CX3CR1 GFP mouse | can be obtained from Littman lab at NYU | ||
| TgN(hGFAP-ECFP) mouse | can be obtained from Jackson | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
| NaH2PO4 | (Mallinckrodt, 7892-04) | ||
| 2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | used to prepare Avertin solution |
| Saline | Braun | ||
| Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
| Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
| Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
| Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
| anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
| Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | used in perfusion |
| Glass vials | VWR | 548-0554 | |
| Forceps | FST | 11251-10 | |
| Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
| Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
| 100mL Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
| Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
| Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
| FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
| Cover slip | Corning | 2940-245 | |
| Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
| Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
| Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
| Amira with RT resolve microscopy module |
Visage Imaging | image analysis software | |
| Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
| ImageJ | NIH | freeware |
References
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