To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.
Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.
Histologisk undersøkelse av biologiske vev er en fundamental tilnærming i forståelsen av molekyler / celler i sin naturlige sammenheng. Ideelt sett er høyoppløselig avbildning av hele organet mest informative og ønsket. Fordi lyset har en begrenset inntrengningsdybde, på grunn av spredning 1, faste organer må være seksjonert for å utføre høy oppløsning mikroskopisk avbildning. Derfor er de fleste av de histologiske undersøkelser utført på noen få vevssnitt representerer bare en liten del av organet. I noen studier, for eksempel, de som tar sikte på å finne fram nevrale forbindelser i hjernen eller ryggmargen, alle vev seksjoner fra målet organer blir innsamlet og fotografert for en 3D-rekonstruksjon. Men vev seksjonering og påfølgende avbildning av enkelte delene har ulike begrensninger. Disse inkluderer å være tidkrevende, og fører til en ufullstendig 3D gjenoppbygging av vev, på grunn av mekaniske forstyrrelser og vanskeligkaper i justeringen av de resulterende bildene.
Nylig, har avregnings-og bildebehandling intakte gjennomsiktige organer blitt utviklet som en betydelig løsning på dette brist 2,3. Ved avregning, er hele organet gjengis transparent, slik at avbildnings lyset å reise ende-til-ende (figur 1) for å frembringe bilder med høy oppløsning av det innlagt organ ved hjelp av et laser scanning mikroskop for eksempel en fler foton-eller lys-ark mikroskop ( figur 2). Ulike forskningsmiljøer har utviklet nye vev clearing protokoller for å være i stand til bildet sitt vev av interesse for ulike formål. Disse inkluderer organisk løsemiddel 2-5, vann 6,7 og elektroforese basert åtte clearing protokoller. Blant dem, tre-dimensjonal avbildning av oppløsningsmiddel fjernet organer eller 3DISCO er et lett anvendelig protokoll på en rekke forskjellige biologiske prøver, inkludert sentralnervesystem (CNS) organer, immunsystemet og faste tumorer. I addition, kan det bli kombinert med forskjellige mikroskopi teknikker som lys ark fluorescensmikroskopi (LSFM), multi foton og konfokal laser-skanning mikroskopi. 3DISCO er basert på rydding med lett tilgjengelige og rimelige reagenser slik som tetrahydrofuran (THF) og dibenzyl-eter (DBE) 4.. Hele protokollen kan ta så kort som 3-4 timer. Dermed er 3DISCO en robust og effektiv teknikk sammenlignet med tradisjonelle histologiske metoder som kan ta uker eller måneder for å fullføre 9..
Tissue clearing metoder tar sikte på å redusere spredning av bildebehandling lys ved å matche brytningsindeksene i ulike vev lag i de ryddet organer. Som et resultat, kan avbildnings lys trenge dypt inn i vev og stimulerer de merkede celler / molekyler. Denne gamle begrepet vev clearing 17 har fått økende oppmerksomhet etter den første sofistikert anvendelse av teknikken på intakte mus hjerner etter Dodt og kolleger to. Siden da, det er en raskt voksende liste av nye oppgjørsmetoder, inkludert 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY og SeeDB 3,4,7,18-20. I hovedsak de alle tar sikte på å gjengi organer gjennomsiktige for dyp vev avbildning ved å bevare den fluorescerende etiketten. Blant dem, står 3DISCO ut som en av de enkleste og reproduserbare fremgangsmåter. Det er relativt rask i forhold til andre clearing metodene nevnt ovenfor (1-5 dager vs 2-3 uker for voksne hjerner, henholdsvis) 21. Det har allerede vært vellykketfullt brukt til ulike organer som hjernen, ryggmargen, lymfeknuter, milt, lunger, solide tumorer, bukspyttkjertelen, og melkekjertler 3,4,9. I tillegg er flere publikasjoner av uavhengige forskergrupper allerede brukt denne metoden for å få bildebehandling resultater 22,23. Likevel kunne ulike vev clearing prosedyrer være en fordel for forskjellige forhold. For eksempel, mens Sca / e og SeeDB gjelder beste på embryonale vev 6,7, de er vannbasert clearing metoder, som kan være enklere å håndtere under bildebehandling. I motsetning til dette er KLARHET en komplisert og kostbar rensing metode. Men det kan være fordelaktig i sammenheng med antistoffmerking, spesielt i store vev slik som hjerne 8..
Den mest kritiske trinnet for å oppnå de beste bilderesultatene fra 3DISCO er vev merking, noe som oppnås før vevet clearing. Det er viktig å starte med den sterkeste fluorescenssignalet mulig. Dette kan be oppnås på ulike måter, inkludert transgene uttrykk for fluorescerende proteiner, sporing av syntetiske fargestoffer, viral transfeksjon eller antistoff merking. Det bør være oppmerksom på at noen clearing prosedyre vil redusere fluorescenssignalet av vev. Derfor, hvis det fluorescerende signalet ikke er sterk nok til i begynnelsen – dvs. det er ikke mulig å påvise før clearing-avbildning av de klarerte vev vil gi dårlige resultater.
Det er noen begrensninger for clearing metoder som venter på forbedringer. En viktig begrensning er at siden fjerne reagenser endre strukturen i de tømte organer, kan de ikke brukes på levende vev. Derfor bør eksperimenter som med photoactivatable mEos2 24 utføres før fikse og clearing. Ved clearing, blir super-oppløsning avbildning av fluorescerende signal fra lyse og photo proteiner mulig. I tillegg, fordi den lysning protokollen minskerintensiteten av fluorescerende proteiner, kan de klarerte organer ikke lagres i lengre perioder. Det er viktig å merke seg at noen organer er vanskeligere å bli ryddet. Spesielt, dersom de dissekerte organer beholde store mengder blodceller (for eksempel, milt, lever), de er forholdsvis vanskelige å fjerne og bilde. Det er også forholdsvis vanskelig å oppnå en fullstendig rensing for store vev, for eksempel voksen gnager hjernen. Slike vev kan trenge lengre inkubasjonstider, som kan, på den annen side, å redusere det fluorescerende signal. I tillegg, utvikling av mikroskopi metoder som kan image store gjennomsiktige organer på en gang på en høy oppløsning er en avventer må tas opp. En annen viktig begrensning av teknikken er vevet merking. Mens et sterkt fluorescerende signal via genetisk eller virus expression er ideell, kan ikke hver celle eller molekyl merkes genetisk eller viralt. På den annen side er antistoffmerking av tykk vev ikke er en enkel prosedyre eller ikke possible i de fleste tilfeller. Det kan trenge spesial permeabilization protokoller og lang inkubasjonstid (flere dager til noen uker) tre. Det er også viktig å huske på at vev krympe ~ 20% i hver dimensjon (målt for ryggmargen vev) etter avregning hovedsakelig på grunn av dehydrering og delipidering. Dette svinn oppstår ratiometrisk og bør korrigeres i kvantifisering trinn. Som observert i de presenterte resultater, fluorescensmerkede konstruksjoner forblir intakt, noe som er en indikasjon på protein integritet i de tømte vev. På grunn av den hydrofobe karakter av den endelige erte vev, kan det ikke lenger var farget med antistoffer, eller innebygd i vannholdige løsninger f.eks Focusclear-som brukes i KLARHET-eller 80% glycerol. Til slutt er det en utfordring å analysere overveldende størrelser av bildedata. For eksempel, når en hel murine hjernen skannes på et cellular oppløsning, ville det være svært vanskelig å spore og kvantifisere ønsket structures (f.eks neuronal eller gliaceller nettverk) og sammenligne over ulike prøvene i en automatisert måte. I sammendraget, mens forskerne som mål å finne ut nye oppgjørsmetoder, de ulike utfordringene ovenfor (vanskeligheter med å fjerne ulike vev, bildebehandling med høy oppløsning på større områder, og komplisert dataanalyse) bør forbedres parallelt.
I konklusjonen, nyutviklede vev ryddesag inkludert 3DISCO, elegant demonstrerer at høyoppløselig 3D avbildning av intakte organer er nå mulig. Ved hjelp av disse metodene, kan forskere skaffe anatomisk informasjon av celler og molekyler i intakt organ. Disse banebrytende 3D-imaging studier på gjennomsiktige organer inspirere et økende antall forskere å tyde komplekse anatomiske og molekylære organisasjoner av vev / organer i lyng og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker C. Højer for kritisk lesing av manuskriptet, B. Bingol (Genentech) for deltakelse i skript fortellinger, N. Bien-Ly for å dele opplevelsen av forbedret blodkar bildebehandling med halen vene injeksjon av Lektin fargestoff, og M Solloway (Genentech ) for mus brukt i bukspyttkjertelen avbildning. GFP-M linjen ble opprettet av J. Sanes (i St. Louis Washington University) og CX3CR1-GFP mus ved R. Littman (NYU). Arbeidet er støttet av Genentech, Inc.
Thy-1 GFP (GFP-M) mouse | can be obtained from Jackson | ||
CX3CR1 GFP mouse | can be obtained from Littman lab at NYU | ||
TgN(hGFAP-ECFP) mouse | can be obtained from Jackson | ||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7917-16 | |
NaH2PO4 | (Mallinckrodt, 7892-04) | ||
2-2-2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 152463 | used to prepare Avertin solution |
Saline | Braun | ||
Tetrahydrofuran | Sigma | 186562-12X100ML | |
Dichloromethane | Sigma | 270997-12X100ML | |
Dibenzyl ether | Sigma | Sigma, 108014-1KG | |
Benzyl alcohol | Sigma | 305197-100ML | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | |
Lectin FITC | Sigma | L0401-1MG | |
anti-CC10 | Santa Cruz | SC-9772 | 0.388888889 |
Heparin | APP pharmaceuticals | 504001 | used in perfusion |
Glass vials | VWR | 548-0554 | |
Forceps | FST | 11251-10 | |
Mini Rotator | VWR | 100498-878 | |
Aluminum Foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
100mL Media Storage Bottles | Kimax Media Bottles | EW-34523-00 | |
Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head | Gilson, Inc | F110701 and F117606 | |
Microscopy slide | VWR | 48311-703 | |
FastWell | Grace Bio-Labs | FW20 | |
Cover slip | Corning | 2940-245 | |
Glass petri dish | Corning Pyrex | 3160-101 | |
Dental cement | Lang Dental | 1223PNK | |
Quantofix Peroxide Test Strips | Sigma | 37206 | |
Amira with RT resolve microscopy module |
Visage Imaging | image analysis software | |
Imaris | Bitplane imaging | image analysis software | |
ImageJ | NIH | freeware |