Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Udarbejdelse af neuronale Co-kulturer med Single Cell Precision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Protokoller for enkelt neuron mikrofluid opstillingsindretningen og vand maskering for i chippen plasma mønstret af biomateriale belægninger beskrives. Stærkt sammenkoblede co-kulturer kan fremstilles ved anvendelse minimal celle indgange.

Abstract

Mikrofluidenheder udførelsesformer af Campenot kammer har tiltrukket stor interesse fra neurovidenskab samfund. Disse indbyrdes forbundne co-kultur platforme kan bruges til at undersøge en række spørgsmål, der spænder udviklingsmæssige og funktionelle neurobiologi til infektion og sygdom formering. Men konventionelle systemer kræver betydelige cellulære indgange (mange tusinde per rum), mangelfulde for at studere lav hyppighed celler, såsom primære dopaminerge substantia nigra, spiral ganglier, og Drosophilia melanogaster neuroner og upraktisk for high throughput eksperimenter. Den tætte kulturer er også meget lokalt sammenfiltrede, med få udvækster (<10%), der forbinder de to kulturer. I dette papir ligefremme mikrofluid og mønster protokoller er beskrevet som disse udfordringer: (i) en mikrofluid enkelt neuron arraying metode, og (ii) en vand maskering metode til plasma patterning biomateriale belægninger til auspicesSter neuroner og fremme udvækst mellem rummene. Minimalistiske neuronale co-kulturer blev fremstillet med højt niveau (> 85%) intercompartment forbindelse og kan anvendes til high throughput neurobiologi eksperimenter med enkelt celle præcision.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neuronvæv er meget kompleks; en heterogen cellulær blanding, der er rumligt bestilt inden for definerede lag og rum og med plastik tilslutning via celle kontakter og især via Axon og dendritceller udvækster. Nye teknikker er forpligtet til at give større eksperimentel frihed til at få dybere indsigt og optrævle mekanismer centrale for sygdom, udvikling og sund funktion. Den Campenot kammer 1,2 og mere for nylig microfabricated udførelsesformer 3,4 kan anvendes til ex vivo-fremstilling af netværksforbundne neuronale co-kulturer med evnen til selektivt at forstyrre de forskellige somatiske populationer og også deres neurit udvækster. Disse mikrofluidenheder er for eksempel blevet brugt til at studere axon degeneration og regeneration følgende kemiske 5,6 eller laser axotomi 6-8, tauopathy 9, viral spredning 10,11, og mRNA lokalisering i axoner 4.

ent ">

At udvide rækkevidden af ​​synæstesi er den teknologiske udvikling, der kræves for at forberede minimalistiske neuronale co-kulturer. Dette muliggør molekyleudretningen af ​​den neuronale netværk for undersøgelse af systemet med en enkelt celle og sub-cellulær præcision. Kravet om minimale celleantal åbner mulighed for at analysere sjældne celletyper, herunder dopaminerge substantia nigra-celler er relevante for Parkinsons sygdom, spiral ganglier fra øret, perifere neuroner og stamceller. Ud over dette, cellulære økonomi er relevant for 3R-initiativet. Ved hjælp af disse mikrofluid platforme, store toksicitet skærme eller andre high throughput, kan nu betragtes data rige eksperimentel serie kræver dyr neuroner.

I dette papir protokoller for fremstilling og anvendelse af en mikrofluid anordning er beskrevet. Mikrofluid opstillingsindretningen i kombination med en in situ biomaterial mønster metode kan anvendes til registrering af tæt forbundne neuronale co-kulturer under anvendelse af minimale celleantal. Mikrofluid opstillingsindretningen er baseret på en differentiel strøm tilgang 12-15, hvorved mikrostrukturerede fælder er placeret inden for en fluidisk kredsløb (illustreret sammen med SEM billeder i figur 1). Stien 0 → 1 har lavere fluidic modstand (R 2> R 1) til transport af neuroner til en lineær række af mikrostrukturerede åbninger - indløb til de neuritvækst kanaler. Belægning af fælden ved en enkelt celle lokalt hæmmer flowet at aflede strømlinierne til at indfange de efterfølgende celler i tilstødende fælder. Komplet belægning af fælder i array skifter fluidic ratio (R1> R2) for at omstille strømlinierne i Serpentine sti (0 → 2) for at frembringe en bypass driftsform til fjernelse af overskydende neuroner.


Figur 1.. Mikrofluid Circuit. A) Den differentielle modstand fluidisk kredsløb for enkelt neuron opstillingsindretningen med flankerende kultur kamre er indbyrdes forbundet ved neuritudvækst kanaler. B, C) ​​SEM billeder af dobbeltlaget opdelte neuron co-kultur array med menisk pinning mikro-søjler. Med denne udformning blev Trident-formede neuron fældefangst strukturer anvendes til at fremme fascikulationer af neurit udvækster. Figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12.. Klik her for at se større billede.

Udarbejdelsen af ​​micropatterned neuronale netværk på plane underlag kan let opnås (for exampl es fra vores gruppe, se FRIMAT et al. 16 og Heike et al. 17). Men indkapsle bioaktive materiale mønstre indenfor PDMS enheder, og med kravet om mikrometer skala tilpasning af disse til de mikrofluidkanaler udgør en stor teknisk udfordring. I afsnit 3.1 en protokol for den i chippen, eller in situ, udarbejdelse af biomateriale mønstre præsenteres. Disse mønstre muliggøre neuron registrering under langvarige kultur tidsplaner og fremme udvækster mellem rummene. Menisk-pinning mikrostrukturer anvendes til at justere en såkaldt vand maske med neuron arraying sites og neuritudvækst kanaler. Vandet maske beskytter adhæsionsmolekyleaktiviteter belægninger under plasmabehandling, mens eksponerede overflader disintegreres at definere biomateriale mønster. Desuden er protokoller indeholdt cellekultur og fluidisk isolation nødvendig til selektiv behandling af de forskellige co-kultur kamre.

ve_content "> De protokoller er designet til at udnytte brugervenlige principper for blød litografi til replikation af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mikrofluidenheder 18. Tilsvarende i situ biomateriale mønster er ligetil, udnytte fordampning og overfladespænding fænomener, og kun kræver en billig håndholdt plasma kilde. mikrofluid kredsløb effektivt programmer celle lastning og rum specifikke behandlinger, der gør disse operationer blot et spørgsmål om udlevering materialer i den rigtige bundporten og sugning ovenfra. På denne måde er det hensigten at give neurobiologer frihed til at forberede og anvende mikrofluidenheder i deres egne laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollerne er beregnet til hjerneforskere, og er opsummeret i figur 2.. Som sådan er det anbefales at microfabrication af SU-8 mestre anvendes til PDMS replikering er outsourcet til kommercielle eller institutionelle faciliteter. De to lag maske designs er frit tilgængelige som supplerende oplysninger (ZIP) på Royal Society of Chemistry hjemmeside 12. Vigtigere er det, at det første SU-8 lag fremstilles i en dybde på 2,5-3,0 um, og den anden til en dybde på 25-30 um. Disse er vigtige dimensioner, der er nødvendige for en effektiv neuron opstillingsindretningen. De 3 mikron højde grænse er også nødvendigt at forhindre, at neuroner, der transporteres eller migrere mellem de to kamre 12.

1.. Mikrofluid Device Replication i PDMS

  1. Bland PDMS præpolymeren grundigt med hærdningsmidlet (184) i et forhold på 10:01 og afgasses blandingen i vakuum til typisk 20 min. Alternativt sætte mixtur i et 50 ml Falcon-rør og bruger lave g centrifugering til afgasning.
  2. Placer 2-lags mikrostruktureret SU-8 wafer på en 80 ° C kogeplade og tilpasse polymer frames til hver enhed på wafer. Hæld PDMS ind i rammer til en dybde på ≥ 5 mm og lad> 1 time for at sikre fuldstændig termisk hærdning.
  3. Hærdet fjerne wafer fra varmepladen og lad den køle af på en flad overflade.
  4. Bær beskyttelsesbriller og arbejde fra det ene hjørne (væk fra SU-8 mikrostrukturer) med en stiv skalpel til tving forsigtigt rammen og PDMS fra wafer.
  5. Fjern PDMS mug fra rammen og bruge en saks til at trimme enheden af ​​overskydende PDMS. Denne såkaldte blinkende produceres ofte, når en tynd film af PDMS spreder mellem polymeren ramme og wafer overfladen.
  6. Resterende PDMS kan anvendes til hele vaflen og hærdes til at beskytte skiven under opbevaring. Fjern denne inden efterfølgende enhed støbning, og dermed fjerne enhver pformulere kontaminanter fra overfladen.

2.. Device Assembly og samtrafik

  1. Forbered de 6 interfaceporte hjælp af en 3 mm i diameter biopsi punch. Arbejde på en mørk overflade, i gode lysforhold og med de mikrostrukturerede funktioner opad for at hjælpe tilpasning af havnene med mikrofluidkanaler.
  2. Undersøg enheden for partikler. Fjern disse ved hjælp af reversibel tape.
  3. Mikrofluid kredsløb er indkapslet med en tynd PDMS lag monteret på et dækglas: Disse fremstilles ved at hælde et lille volumen (~ 0,5 ml) af PDMS-hærdemiddel-blanding (10:1, 601) på basis af en fleksibel, bakteriologisk kvalitet petriskål. Tryk forsigtigt et dækglas på PDMS lag, placeres på varmepladen og termisk kur for et par minutter. Hurtigt efter afkøling bruge en skalpel til at skære ud og præmie dækglasset-PDMS dobbeltlaget fra petriskål. Trim med saks, hvis nødvendigt.
  4. Plasma obligation PDMS-enhedenog støtte lag til at producere en god tætning: Optimale betingelser er instrument specifikke. For eksempel kan en plasma Ovn med 70 W og 40 kHz i en 0,2 mbar oxygenatmosfære i 40 sek frembringer en fremragende PDMS-PDMS binding. Når plasma behandlet, skal du trykke to dele sammen og efterlade et minut til fuldt obligation.
  5. Brug silikoneslanger (1,6 mm ID, 3,2 mm OD) til at interface med pumper og sprøjter.

3.. Biomateriale Patterning og Mikrofluidenheder Operations

Protokollerne for in situ biomateriale mønsterdannelse neuron kultur og strømningstekniske behandlinger er illustreret i figur 2.

Figur 2
Figur 2. Illustreret mikrofluid protokoller. A) PL og PLL-g-PEG mønster; tilsætning af celleadhæsion lag (fxPL, grøn), med fordampning producerer justeret vand maske B) Atmosfærisk luft plasma behandling af den eksponerede PL.; to antenne pins bruges med plasma introduktion antenne illustreret med en lyserød stjerne. C) PBS (blå) vask ved aspiration bruges til at undgå forurening af plasma-behandlede region med PL. D) Levering af PLL-g-PEG (rød ) ved aspiration til pels plasma-behandlede regioner E) Cell loading.; samtidig microfluidic opstillingsindretningen af neuroner både flankerende rum ved aspiration, F) medier (lyserød) perfusion med hydrostatisk drevet flow G) Isolerede fluidic behandlinger.; perifer behandling af en test agent (sort) leveret fra bunden flankerende indløb ved aspiration og H) central behandlingsenhed afgivet fra bunden centralt indløb ved aspiration. Figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry(RSC) 12.. Klik her for at se større billede.

Umiddelbart efter plasma limning PDMS mikrofluidkanaler er meget hydrofile (kontakt vinkel ≤ 5 °). Sådanne overflader er egnet til vedhæftning og kultur cellelinjer såsom differentierede humane SH-SY5Y-neuron-lignende celler. Til ex vivo-kultur af primære neuroner og kultur af neuronale precursor cellelinjer, såsom Lund human mesencephale cellelinie (LUHMES) en polyamin belægning enten polylysin (PL) eller polyornithin (PO), der kræves som en elektrostatisk anker. Desuden adhæsionsproteiner såsom laminin eller fibronectin kræves ofte som integrin-grænseflade belægning. Men PL og PO belægninger let binder neuroner, hindrer mikrofluid levering til array steder og også pålægge uønskede forskydningsspændinger. For at løse dette problem i chip biomaterialemønstret er forpligtet til at lokalisere vedhæftning materialer ved fælde sites og udvækst microchannels. Dette fremmer også udviklingen af ​​inter-rums-forbindelser og reducerer den lokale entanglement. Protokollen indebærer også tilføjelsen af ​​PEG-materialer til de omkringliggende områder for at sikre proteiner og neuroner er begrænset til de ønskede steder under langvarig kultur. Følgende protokol er dokumenteret i figur 3:

Figur 3
Fig. 3. Vand maskering til biomateriale mønsterdannelse af plasma stenciling. A) Illustration af vandet maskering processen med PDMS mikro-søjler pinning vand menisken på plads til plasma stenciling. Krumning af menisken i det lodrette plan er blevet negligeret. B) Vand maske visualiseret med et rødt farvestof og positioneret af menisken pinning. C) Den mønstrede PL-FITC belægning filmede efter plasma stenciling. D) Tilsætning af protein afvise og celle afvisende PLL-g-PEG-TRITC til et plasma-mønstrede PL-FITC belægning. Dette blev anvendt til registrering af SH-SY5Y celler og også for mønstret et ekstra fibronektin lag for LUHMES celler. Figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12.. Klik her for at se større billede.

  1. Vand Masking til in situ Biomateriale Patterning af Plasma Stenciling
    1. Kort efter plasma bonding pipette en 0,5 gl volumen PL eller PO (100 mg / ml i 1x PBS) i den nederste midterste port. I løbet af få sekunder hele mikrofluid kredsløb fyldes ved kapillarvirkning. Lad et par minutter at belægge de hydrofile PDMS overflader med polyAminer.
    2. Fjerne ubundne polyamin-molekyler ved aspiration drevet vask med 1x PBS (se figur 2C) i 1 min.
    3. Fjern alle PBS fra havnene og opvarme enheden ved belysning med et mikroskop. Dette øger fordampningen fra havnene for hurtig vand maske dannelse. Vandet masken (illustreret i figur 3A og dokumenteret i figur 3B) er etableret i ~ 5 min.
    4. Undersøg enheden ved mikroskopi for at sikre vand maskering er færdig. Bemærk reservoir strukturer opstrøms array websted er medtaget i masken design at forlænge stabiliteten af ​​vand maske (~ 15 min.)
    5. Sæt rustfrit stål pins i havnene (figur 2B). Disse anvendes til at koble plasma genereret af et atmosfærisk tryk håndholdt koronaudladning eller Tesla generator (f.eks opererer ved 2 MHz, 30 kV signal) 19,20 i de ledige mikrofluidkanaler. Vend than plasma kilde tæt på spidsen af ​​en pin og plasma behandle mikrokanalplade til ≤ 1 sek. Brug dårlige lysforhold at observere plasma mønster.
    6. Fjern vand maske med et vasketrin. Brug parallel aspiration fra de øverste 3 porte. Brug 4 lige længder af silikoneslanger forbundet med en 4-vejs-adapter til en aspiration pumpe for at opnå parallel aspiration. Start aspiration og dispensere PBS i de nederste 3 porte til at trække PBS gennem mikrofluid kredsløb. På denne måde en PDMS-polyamin materiale kontrast frembringes (se figur 3C). Evakuer PBS fra mikrofluid kredsløb og orlov til flere timer at genoprette de indfødte, hydrofobe tilstand. Dette gør PDMS fuldstændigt ikke-tolerant til celle adhæsion.
    7. Skulle yderligere vedhæftning materialer, såsom laminin eller fibronectin, være behov for de følgende trin er påkrævet og skal ske umiddelbart efter fjernelse af vand maske: Pipette en 10 ul volumen af graft co-polymer poly-L- Lysin-poly (ethylenglycol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml i PBS) ind i begge bund flankerende kanaler, efterfulgt af opsugning fra de øvre flankerende kanaler for 2 min.
    8. Uden at afbryde strømmen, fjerne overskydende PLL-g-PEG ved udveksling med en PBS-buffer. Denne selektivt frakker ikke-polyaminholdige coatede regioner med PEG-delen handler for at forhindre proteinadsorption og celleadhæsion 17,21.
    9. Adhæsionsproteiner såsom laminin eller fibronectin kan derefter co-lokaliseret med poly-amin belægning: mængderne af disse ECM-proteiner (typisk 10 ug / ml) afpipetteres 10 pi i alle tre nederste porte. Aspirer fra de øverste tre porte, indtil enheden er fyldt med protein-opløsning og inkuberes i 1 time for at frembringe en belægning af god kvalitet.
    10. Fjern overskydende proteiner ved at aspirere PBS fra de nederste 3 porte.
  2. Mikrofluid Single Neuron opstillingsindretningen
    1. Prime enheder med hensigtsspiste medier. Tilføj volumener 20 gl til de nederste 3 havne og af parallel aspiration fra de øverste tre porte hurtigt fylde mikrofluid kredsløb med medierne. Brug en 4-vejs slangeforbindelsesindretningen at koble de 3 øverste porte via ens længde silikoneslanger til en aspiration pumpe.
    2. Tilsæt 20 pi af et disaggregeret cellesuspension (1 x 10 6 celler / ml) til hver af de flankerende indgangsporte (0, i figur 1).
    3. Udstyre en aspiration pumpe med en regulator eller bruge en sprøjte til blid aspiration fra de øverste 3 porte. Komplet neuron opstillingsindretningen kræver typisk 1 min.
    4. Harvest overskydende neuroner tilbage i de 4 flankerende havne med en pipette til gruppering i efterfølgende mikrofluidenheder.
    5. Fjern slangen. Fyld alle porte med medier og placere enheden i inkubatoren. Inden for et par timer blev cellerne bliver fuldt klæbende på biomaterialet mønster.
  3. Neuron Kultur, Selektiv Fluidic behandling, og Immunostaining
    1. Udskift mediet ved periodisk perfusion hjælp hydrostatisk foder (en 2 mm søjle højdeforskel er passende langsom).
    2. Alternativt nedsænkes mikrofluid enhed i medierne, udveksle mediet periodisk (2-3 dage), som med standard cellekulturer.
    3. Selektive fluidstyrede behandlinger til enten neuron kultur rum eller den centrale neuritudvæksten rum opnås som følger: Dispensér 20 ul af teststoffet i bunden porten på kanalen af ​​interesse, og aspireres fra havnen direkte ovenfor. For langvarige behandlinger reducerer flowhastigheden ved hjælp af et flow-regulator og genopbygge prøvestoffet efter behov.
    4. Immunofarvning protokoller varierer for hver molekylære mål og tilhørende reagenser. For at imødegå den potentielle risiko for shear-induceret skade på neuroner en langsom strømningshastighed blev brugt. Dette resulterer i øget anvendelse tider til fuldt perfuse systemet, udvidelse normale protokol tider. Hydrostatic perfusion hjælp havnene med forskellige søjlehøjderne (fx ved 2 mm) blev anvendt til at levere reagenser. Mere hurtig tilsætning af reagens og fjernelse ved hjælp af en pumpe kan anvendes til at reducere eksperimentelle tidsskalaer. Tilslut en aspiration pumpe til de øverste 3 porte til at trække reagenser fra de nederste 3 porte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vand maskering exploits overfladespænding. Trykket tolerance på luft-væske grænsefladen skalaer omvendt proportionalt med krumningsradius [ , Der producerer meget stabile grænseflader på mikrofluidenheder dimensioner. De mikro-søjler effektivt forankre vand maske på plads. Vand maske dannelse er drevet af fordampning fra microfluidic havne med den steg med opvarmning. Ved hjælp af varmen fra lav forstørrelse (4x - 10x) mikroskopi belysning blev vand maske typisk oprettelse i ≤ 5 min. Fordampning fører også til den endelige kollaps af vand maske. For at øge levetiden af ​​vand maske til ~ 15 min (praktisk for plasma stenciling), 18 nl reservoir strukturer er blevet placeret opstrøms for kultur rum. Hastigheden af ​​vand maske dannelse og kollaps kan variere, og det anbefales intermitterende observation til at identificere en passende periode til plasma tEHANDLING. Ikke desto mindre kan flere enheder forberedes samtidigt.

Plasma stenciling kræver ~ 1 sek. Anvendelsen af ​​langvarige behandlinger fordamper vand maske, hvilket fører til overdreven plasma desintegration af polyamin belægning. Til tider utilstrækkelige plasma behandling resultater, idet hverken polyamin belægninger på den tilstødende mikrokanalplade væg (se figur 3D), der kan understøtte neuron vedhæftning 12. Alligevel arrayed mus corticalneuroner havde et mønster effektivitet på 89,5% 12 efter dyrkning i 6 dage. Denne effektivitet er ækvivalent med PL / PEG mønstre på plane substrater. Biomateriale mønster har den yderligere fordel, at fremme udvækster ind i neuritlængder microchannels. Med biomateriale mønsterdannende udvækster forlænges inden for ~ 90% af de mikrokanaler, der med en kontinuerlig polyamin belægning udvækst niveauer blev reduceret til ~ 70%. Ved hjælp af corticale neuroner var 7 dage i chippen kultur nødvendig for vokserths at spænde begge rum (en distance på 500 um). Differentierede humane SH-SY5Y neuroner havde højere udvækst satser, etablering af forbindelser i 4-6 dage. Kortikal, LUHMES og SH-SY5Y neuroner er blevet dyrket i op til 2 uger. Det er lang nok til spontan elektrofysiologiske funktion, der skal nås, og kan indirekte måles ved Ca 2 + billeddannelse. Dette vil validere den udbredte anvendelighed biomateriale mønster og mikrofluid opstillingsindretningen metoder til oprettelse af funktionelle neuronale netværk.

Menisken-pinning strukturer giver dog fremme neurite entanglement (se figur 4C). Edge konstatering er et fælles træk ved axoner dyrket på mikrostrukturerede overflader 22. For at forhindre en sådan entanglement og yderligere fremme dannelsen af inter-rum forbindelser, kan menisk-pinning søjler blive fusioneret med mikrokanalplade væg (dvs. ikke længere fritstående). Desuden udvæksteri den centrale microfluidic kanal kan være uorganiserede. Til forsøg kræver lineær forbindelse, kan den centrale kanal skal fjernes (se masken design i Dinh et al. 12. supplerende oplysninger). Dette kredsløb kræver serielle opstillingsindretningen af det første rum, efterfulgt af en periode (fx 4 timer) for celleadhæsion eller såkaldt cellulær ventilarrangementet 14 for at gøre kredsløbet eftergivende for gruppering celler i det andet kammer.

Mikrofluid kredsløb giver forprogrammerede fluidic operationer. De forskellige funktioner bestemmes af valget af havn til at indlæse reagenser eller interface med slanger eller tips. Dette undgår behovet for komplicerede, dyre og pladskrævende tilbagekobling styret instrumentering til at gøre teknikken meget tilgængelige for neurobiologi. Kredsløb design er kritisk afhængig af optimale relative dimensioner for at opnå mikrofluidisk arraying 12-14. Små ændringer kan forhindre CIRcuit fungere, og derfor anbefalede vi indledende adopters af de protokoller til at gøre brug af de frit tilgængelige designs 12. Med en optimal kredsløb, mikrofluid enkelt neuron opstillingsindretningen er hurtig, med ~ 100 neuroner klædt i hver kultur kammer på mindre end 1 min. Trods det begrænsede antal neuroner, den lokale tæthed er stadig svarer til standard kulturer at give tilstrækkelig life support-signalering niveauer. Som dokumenteret i figur 4B denne fremgangsmåde reelt giver 1 neuron per fælde (1,14 ± 0,09) 12.. Det er dog ikke alle neuroner klædt. Mikrofluid kredsløb genererer parallelle strømliner, sådan at neuroner, der ankommer i de ydre områder af laminar strømning fortsat Serpentine kanal. Ikke desto mindre præsenterede system er 10-100 gange mere økonomisk med celler end de eksisterende opdelte systemer. Bortvist celler kan høstes fra havnene og slanger. I fremtidige designs, opstrøms deterministisk sideforskydningstrukturer 23 kan anvendes til at aflede alle celler i opstillingsindretningen strømliner efter absolutte cellulære økonomi.

Figur 4
Figur 4.. Mikrofluid neuron opstillingsindretningen. A) Manuel aspiration med en sprøjte anvendes til skånsom neuron opstillingsindretningen. En 4-vejs slangeforbindelsesindretningen anvendes til at interface sprøjten med de øverste 3 porte til simultan neuron arraying i begge kamre. B) Differentieret neuron-lignende menneske SH-SY5Y celler og andre neuroner er klædt med enkelt celle præcision (en neuron per fælde ). C) Efter 5 dages kultur, neuritlængder extensions sammenkoble de to kulturer. Kerner farves med DAPI og actin immunfarvning blev brugt til at visualisere udvækster. Modificeret figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) Klik her for at se større billede.

Et centralt element i opdelte systemer er evnen til selektivt at behandle individuelle cellepopulationer til at undersøge materiale menneskehandel og langtrækkende signalering. Men metoder til rådighed i litteraturen er enten utilstrækkelige for fluidiske isolering eller er dårligt beskrevet. Fluidumydelse isolation metode, vi har udviklet muliggør hurtig levering (<1 min) teststoffer og forlænget fluidisk isolation (> 1 time) 12. Resultater er dokumenteret i fig. 5. Denne funktion er gjort mulig ved kombination af kredsløbet design og ved hjælp af aspiration at levere teststoffet. Dette er i modsætning til væskeinjektion hjælp af enten en sprøjtepumpe af hydrostatisk foder. Trods den høje strømningstekniske modstand neuritudvækst kanaler disse metoder producere konvektion stier that hurtigt sprede teststoffer og forurene hele enheden. Aspiration fra den øvre åbning også interagerer med væske i hele kredsløbet (en funktion af central betydning for forskellen modstand arraying-princippet). Men i denne driftsform, er alle hentet fra andre steder i kredsløbet at fortynde teststoffet stedet for at sprede det. I betragtning af den ekstreme fluidisk modstand (relativ) af neuritudvækst kanaler, omfanget af fortynding er ubetydeligt. Til forsøg indebærer etablering af diffusion gradienter, kan aspiration metode bruges til selektivt at behandle et rum, med flow ophør bruges til at indlede den tidsafhængige udvikling i den kemiske gradient.

Figur 5
Figur 5. Selektive strømningstekniske behandlinger. A) Aspiration-drevne selektive behandlinger af than centrale og B) flankerende rum. Pilen angiver enkelt port, der anvendes til aspiration. Behandlinger blev etableret i 1 min (røde linjer) og blev opretholdt under hele forsøget; 60 min (blå linjer). Modificeret figur og legende gengivet med tilladelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12.. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrofluid opstillingsindretningen teknik er den første af sin slags, der giver præcision enkelt neuron håndtering for at etablere minimalistiske kulturer. Sammen med in situ biomateriale mønster metode, en kraftfuld tilgang til at justere cellemønstre med microfluidic strukturer, disse minimalistiske kulturer har høj intercompartment tilslutningsmuligheder niveauer med reduceret lokal entanglement. Disse funktioner kan bruges til effektiv undersøgelse af inter-rum overførsel og med enkle design ændringer har potentiale til at isolere de enkelte axoner til visualisering og kvantitativ analyse. For eksempel, i næste generation motiver Trident strukturer kan erstattes med en udvækst kanal pr neuron at reducere sandsynligheden af ​​flere axoner danner bundter. Disse funktioner kan i høj grad til gavn for en bred vifte af neurovidenskab applikationer, herunder; nanopartikulære toksicitet 24 og mangan formering 25 aktivitet SYNchronization i epilepsi, spredning af smitsomme stoffer såsom prioner 26, amyloid beta (Ab) transmission i Alzheimer 9, og alpha synuclein i Parkinsons sygdom 27..

En anden indlysende fordel af mikrofluid opstillingsindretningen metode er evnen til at gennemføre forskning med lave overflod neuron delpopulationer snarere end komplekse heterogene kulturer. For eksempel dopaminerge substantia nigra neuroner egnede til Parkinsons forskning eller perifere neuroner, der kun kan isoleret i små tal er stadig tilstrækkelig til replikat-undersøgelser under anvendelse af mikrofluid platform. Andre sjældne celle applikationseksempler omfatter undersøgelse af grundlaget for høretab ved hjælp af en eksperimentel arrangement af hårceller co-dyrket med spiral ganglier neuroner, eller undersøgelser ved hjælp af induceret pluripotente stamceller fra mennesker. Ligeledes lave celle krav til systemet gør detumiddelbart muligt at foretage eksperimenter med neuroner fra miniature Drosophilia melanogaster hjerne 28 og dermed udnytte fordelene ved denne kraftfulde genetiske model.

Den anden perspektiv er den pragmatisme cellulære økonomi og den lille enhed fodaftryk, der gør high throughput forskning håndterbare. Hver tilstand og replikere kræver minimal neuroner, en funktion, der kan bruges til voldsomt at reducere antallet af dyr i overensstemmelse med den igangværende 3R initiativ. For eksempel kan udføres dosis-respons analyse af et stort panel af forbindelser ved hjælp af et enkelt dyr. Skærmtyper omfatte prøvning toksicitet og undersøgelse af biblioteker af siRNA eller farmakologiske agenter for deres effekt på langtrækkende menneskehandel og signaltransduktion. Sammenfattende beskrevne protokoller udvide eksperimentelle rækkevidde neuroscientist, der tilbyder muligheden for at levere high throughput, kvantitativ og statistikallieret stærke data med enkelt og subcellulære opløsning. Dette og de mange andre store udviklinger inden for neurovidenskab vil føre til nye indsigter i mekanismerne bag neuronal udvikling og funktion, samt patologiske processer, der forårsager sygdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Ulrich Marggraf (ISA) på SU-8 fabrikation og Maria Becker (ISA) på SEM billeddannelse. Forskningen blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), en Bundesministerium für Bildung und Forschung tilskud (BMBF 0101-31P6541) og af Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf takker International Leibniz Graduate School "Systembiologi Lab-on-a-chip" for finansiel støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Udarbejdelse af neuronale Co-kulturer med Single Cell Precision
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter